CC BY
51
разработка тканеинженерных конструкций на основе смеси хитозана и поликапролактона для сосудистой хирургии
И.С. Захарова 12■3, А.М. Смирнова 134, М.К. Живень 12■3, Ш.Б. Саая 3, А.И.Шевченко 12■34, СМ. Закиян 12 3 4, Л.Н. Иванова 14
1 Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
2 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия
3 Сибирский федеральный биомедицинский исследовательский центр им. акад. Е.Н. Мешалкина, Новосибирск, Россия
4 Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия
Development of tissue-engineered chitosan-polycaprolactone blends for vascular surgery
I.S. Zakharova 1 2 3, A.M. Smirnova 134, M.K. Zhiveri 1 2 3, ShB. Saaya 3, A.I. Shevchenko 1 2 34, S.M. Zakian 1 2 34, L.N. Ivanova 14
1 Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the RAS, Novosibirsk, Russia
2 Institute of ^emical Biology and Fundamental Medicine of the Siberian Branch of the RAS, Novosibirsk, Russia
3 E.N. Meshalkin Siberian Federal Biomedical Research Center, Novosibirsk, Russia
4 Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
Благодаря развитию тканевой инженерии в сосудистой хирургии появилась возможность минимизировать отдаленные негативные последствия, возникающие при замещении дефектов синтетическими протезами. Выбор оптимального матрикса-носителя и источника клеток для его заселения — ключевое условие, необходимое для того, чтобы функциональные свойства такой конструкции были максимально приближены к физиологическим. В ряде работ показано, что смесь поликап-ролактона с хитозаном является подходящим биодеградируемым материалом для тканевой инженерии.
В данной работе предложен эффективный способ получения тканеинженерных конструкций на основе мембран из поликапролактона и хитозана, заселенных эндотелиальны-ми клетками кардиальных эксплантов человека. Проведены исследования динамики пролиферации, жизнеспособности эндотелиальных клеток в составе полученных конструкций, анализ специфических антигенов, оценка способности синтезировать компоненты межклеточного матрикса и формировать капилляроподобные структуры. Полученные результаты свидетельствуют, что эндотелиальные клетки кардиальных эксплантов человека в составе тканеинже-нерных конструкций на основе смеси поликапролактона и хитозана сохраняют свои функциональные свойства. Использование таких тканеинженерных конструкций при разработке заменителей сосудов малого диаметра позволит максимально приблизить свойства транспланта к физиологическим.
Ключевые слова: тканевая инженерия, эндотелиальные клетки, поликапролактон, хитозан, сосудистая хирургия.
Tissue engineering provides the opportunity to minimize some possible negative results of the synthetic vascular grafts in long-term follow-up. The choice of the optimal scaffold and cell source for seeding are key conditions to bring properties of vessel substitute to physiological. In some works it is shown that a chitosan-polycaprolactone blend is a suitable biodegradable material for tissue engineering. In this paper we suggest an efficient method to generate of tissue-engineered chitosan-polycaprolactone blends, cellularized by endothelial cells of human cardiac explants. The cells cultured on the blended membranes retain their functional properties: viability and proliferative properties; maintain specific endothelial antigens and synthesis of extracellular matrix. These results suggested that tissue-engineered chitosan-polycaprolactone blends seeded by endothelial cells of human cardiac explants may be potential to development of substitutes for small diameter blood vessels.
Keywords: tissue engineering, endothelial cells, polycaprolactone, chitosan, vascular surgery.
введение
В настоящее время в мире ведутся разработки тканеинженерных сосудов на основе биологических тканей и синтетических материалов. Лечение ряда патологий кровеносных сосудов предусматривает замену на ауто-, аллотрансплантаты и синтетические протезы. Существуют ограничения и противопоказания для использования аутотрансплантатов, проблемы выбора донора и отторжения аллотрансплан-татов. Несмотря на ряд положительных свойств синтетических материалов (биосовместимость, контролируемость морфологических и механических свойств), часто наблюдаются неудовлетворительные отдаленные результаты при использовании синте-
е-таП: zakharova@bionet.nsc.ru
тических протезов, в особенности малого диаметра (менее 6 мм): стенозы, тромбозы, гиперплазия неоинтимы, невозможность роста трансплантата, воспалительные реакции, вызванные продуктами распада полимеров, потеря структурной целостности из-за быстрой деградации полимеров.
При разработке тканеинженерного сосуда в качестве матрикса-носителя для заселения клеток используют разнообразные синтетические и натуральные материалы [1, 2]. Не все материалы, используемые в сосудистой хирургии, применимы для создания протезов сосудов малого диаметра: политетрафторэтилен (PTFE), полиэтилентерефталат (PET), полиуретаны — демонстрируют неудовлетво-
рительные отдаленные показатели в силу тромбоза и стеноза [2]. В этой связи, в настоящее время в задачи тканевой инженерии сосудов, особенно малого диаметра, входит подбор подходящих для заселения материалов.
Хитозан и поликапролактон (PCL) — биодегради-руемые материалы, применяемые в биомедицине в силу ряда положительных свойств [3]. Использование смеси натуральных и синтетических полимеров позволяет разработать материал с более ценными свойствами, чем те, которыми обладает каждый из компонентов по отдельности [4]. Метод получения смеси более дешевый и менее ресурсозатратный по сравнению с разработкой способов синтеза новых мономеров или протоколов полимеризации. В ряде работ показано, что смесь PCL с хитозаном имеет более благоприятные свойства, чем имеющиеся у каждого материала в отдельности [5, 6]. Подобраны оптимальные соотношения компонентов смеси для формирования мембраны, пригодной для заселения фибробластами мыши [5], корнеальным эндотелием быка [3, 6], а также дермальным ми-кроваскулярным эндотелием человека [7]. В экспериментах на модельных животных показана возможность использования материала, состоящего из смеси PCL и хитозана, для создания сосуда малого диаметра, заселенного мононуклеарными клетками крови собаки [8].
Другая важная задача при создании тканеинже-нерного протеза сосуда — выбор подходящего источника клеток для заселения, что имеет принципиальное значение для последующей правильной интеграции трансплантата в окружающие ткани. Монослой эндотелиоцитов значительно повышает тромборезистентность протеза сосуда и предотвращает развитие гиперплазии неоинтимы [2, 9]. Эндотелиальные клетки имеют высокую степень гетерогенности по функциям и структуре в разных типах сосудов и тканей, что необходимо учитывать при выборе источника клеток.
Ранее мы разработали способ получения и обогащения популяции эндотелиальных и гладкомышеч-ных клеток из доступного послеоперационного материала кардиальных эксплантов человека — миокарда выходного отдела правого желудочка [10].
В данном исследовании мы разработали эффективный метод получения тканеинженерных конструкций на основе мембран из PCL и хитозана, заселенных эндотелиальными клетками кардиальных эксплантов человека.
Материал и методы
Получение эндотелиальных клеток
Эндотелиальные клетки получали из послеоперационного материала миокарда выходного отдела правого желудочка человека с последующим культивированием и характеристикой in vitro и in vivo в соответствии с ранее разработанным нами протоколом [10]. Все пациенты перед операцией подписывали добровольное информированное согласие.
Получение мембран из смеси полимеров
Подготовка мембран из смеси хитозана и PCL для заселения клетками проводилась с использованием протоколов, ранее описанных в литературе [5—7], с модификациями. Готовили стоковые растворы 1 wt.% хитозана (Sigma-Aldrich, Исландия, степень
деацетилирования — 85%) в 0,5 М растворе уксусной кислоты и 10 wt.% PCL в ледяной уксусной кислоте; дальнейшие разведения PCL — также в ледяной уксусной кислоте. Смеси хитозана и PCL нужных соотношений готовили по следующей схеме:
PCL25 (PCL: хитозан 1:3) = 10 мл 0,1% PCL + 3 мл 1% хитозана
PCL50 (PCL: хитозан 1:1) = 10 мл 0,3% PCL + 3 мл 1% хитозана
PCL75 (PCL: хитозан 3:1) = 10 мл 0,9% PCL + 3 мл 1% хитозана.
Полученные смеси хитозана/PCL25, 50, 75 (PCL25, PCL50, PCL75) заливали на культуральные поверхности, выпаривали в конвекционной печи или термостате без конвекции при температуре 55—57°C в течение 24 ч. до образования пленки. Нейтрализацию мембран проводили двумя способами: 1) щелочью - 0,5 М NaOH (2% w/v) 30 мин.; 2) смесью щелочи и этанола — 0,5 М NaOH в 80% этаноле 30 мин., далее — 3 раза в 80% этаноле. Промывали мембраны в фосфатно-солевом буфере (PBS), оставляли под ультрафиолетом в течение 40 мин., помещали в Ш2-инкубатор при 5% СО2.
Заселение и культивирование клеток на подложках
Количество заселяемых эндотелиальных клеток составляло 1х105/4 см2 в экспериментах по анализу пролиферации методом подсчета числа клеток и XTT; для анализа методом FACS — 1х10в/10 см2. Клетки культивировали на подложках в среде EGM-2 (Lonza, США). Пассирование проводили с помощью трипсина или TrypLE Express (Life Technologies, Великобритания).
Анализ пролиферативных способностей клеток
Динамика пролиферации эндотелиальных клеток на разных типах подложек оценивалась методом подсчета количества клеток на 1, 8 и 12 сут. после заселения. Клетки предварительно метили прижизненным митохондриальным красителем TMRM (Life Technologies, США), в некоторых случаях — витальным ядерным красителем NucBlue (Life Technologies, США). Количество клеток подсчитывали в пяти случайных полях зрения на 10-кратном увеличении с помощью инвертированного флуоресцентного микрокопа Nikon Ti-E (Япония), используя программное обеспечение NIS Advanced Research. Эксперимент проводился в трех повторностях.
XTT-тест
Для оценки пролиферации эндотелиальных клеток на подложках из смеси хитозана и PCL проводили XTT-тест по протоколу фирмы-производителя (Roche, США) через 22 ч. после добавления реагентов. Результат оценивали с помощью сканирующего спектрофотометра Perkin Elmer (2030 Multilabel Reader Victor X3, Финляндия) при длине волны 570 нм. Полученные значения коэффициента поглощения отражали количество жизнеспособных клеток в каждой лунке.
Анализ жизнеспособности клеток с помощью
йодида пропидия и аннексина V
Жизнеспособность клеток на подложках из смеси PCL и хитозана оценивали через 24 ч. и 7 сут. после заселения с помощью набора Propidium lodide/Annexin V*FITC (BioLegend, США) по протоколу фирмы-производителя. Мембраны с различными концентрациями PCL заселяли эндотелиальными
5г
оригинальные исследования
клетками. В качестве контроля использовали клетки на культуральном пластике без подложки. В контрольных точках наблюдения клетки снимали с поверхности с помощью TrypLE Express. Доли живых, апоптотирую-щих и некротизировавшихся клеток подсчитывали методом цитофлуорометрии для 104 событий с помощью прибора FACS Canto II (FACS Diva 7.0, США).
Иммунофлуоресцентный анализ Клетки, заселенные на подложках, фиксировали вместе с подложками в 4% PFA по стандартному протоколу, описанному ранее [10]. Анализировали клетки на инвертированном флуоресцентном микроскопе Nikon Ti-E (Япония) в программе NIS Advanced Research. В работе использовали следующие антитела: первичные: anti-human CD31 (DAKO, США, M0823); anti-fibronectin (Abcam, США, abB32В); anti-von Willebrand factor (Abcam, США, ab6994); anti-collagen IV (Life Span, США, LS-C79B03), вторичные (Life Technologies, США): Alexa Fluor 4ВВ goat anti-rabbit IgG ^НООВ), Alexa Fluor 5ВВ goat anti-rabbit IgG (H + L) (A11011), Alexa Fluor 5ВВ goat anti-mouse IgG (H + L) (A11031), Alexa Fluor 4ВВ goat anti-mouse IgG (H + L) (A110S9). Окраску изо-лектином (Isolectin GS-IB4 from Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor® 594 Conjugate) и витальным ядерным красителем TMRM проводили согласно протоколам фирм-производителей (Life Technologies, США).
Тест на сохранение эндотелиальными клетками функциональной способности формировать капилляроподобные структуры в матригеле Предварительно окрашенные витальным мито-хондриальным красителем TMRM клетки культивировали на подложках. Поверх клеток заливали слой матригеля (Corning, США), разведенного ростовой средой в S раза. Образование капилляроподобных структур наблюдали через 1 сут. Изображения получали с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Nikon Ti-E методом Z-стэков с использованием программного модуля BD программы Advanced Research (Nikon, Япония).
Изготовление криосрезов
Клетки, заселенные на подложку из PCL75, фиксировали 4% PFA по вышеописанному протоколу. С помощью пинцета отделяли область подложки с клетками, помещали в Tissue Tek O.C.T.Compound (Sakura, Нидерланды), выполнение криосрезов толщиной 10 мкм проводили по стандартной методике, описанной ранее [10], на приборе Cryostat Microm HM 550 (Microm International GmbH, Германия) в ЦКП микроскопического анализа биологических объектов ИЦиГ СО РАН.
Статистический анализ
Для выявления статистической значимости различий между группами использовали U-критерий Манна — Уитни и критерий Пирсона в программе Statistica 10.0 (StatSoft, США).
Результаты
Пролиферация и жизнеспособность эндотелиальных клеток на подложках из смеси PCL и хитозана Физико-химические свойства мембран, изготовленных из смесей PCL и хитозана в разных процентных соотношениях, исследованы несколькими
группами авторов [3, 5—8, 11—14]. Мы применили описанные ранее протоколы изготовления смесей с небольшими модификациями. Мембраны, полученные нами с использованием конвекционной печи, обладали негомогенной структурой. Поэтому в данной работе для получения мембран мы применяли термостат без конвекции.
Существуют литературные данные о том, что на подложках из хитозана, нейтрализованного щелочью с этанолом, фибробласты мыши пролиферируют более эффективно, чем на подложках, нейтрализованных только щелочью [7]. Чтобы выяснить, имеют ли значение условия нейтрализации подложек из смеси PCL и хитозана для пролиферации клеток кардиаль-ных эксплантов человека, в данной работе мы проанализировали динамику пролиферации клеток на исследуемых подложках в течение 12 сут. культивирования (рис. 1А-В). Полученные результаты показали, что нейтрализация подложек смесью щелочи и этанола дает преимущество перед обработкой только щелочью: различия в трех анализируемых временных точках для PCL25 были статистически значимы (рис. 1А). Литературные данные для хитозана были подтверждены аналогичным образом. Для PCL50 и PCL75 также прослеживалась указанная тенденция, однако достоверные различия при разных способах нейтрализации в этих случаях были зарегистрированы только на 8 и 12 сут. измерения. На подложках из PCL25 клетки пролиферировали более эффективно по сравнению с PCL50 и PCL75 при нейтрализации щелочью и этанолом. Статистическая значимость различий в данном случае подтверждалась в двух из трех выполненных экспериментальных повторениях для всех точек измерения (рис. 1Б-В). В случае нейтрализации только щелочью достоверно эффективная пролиферация на PCL25 по сравнению с PCL50 была показана только в одном повторении на 8 и 12 сут., по сравнению с PCL75 — на 1 и 8 сут. в двух и одном повторениях, соответственно. Не выявлено различий между количеством клеток в контрольных точках наблюдения на подложках PCL50 и PCL75 как при одном, так и при другом способе нейтрализации (рис. 1Б-В).
Таким образом, при формировании тканеинженер-ных конструкций с использованием эндотелиальных клеток кардиальных эксплантов человека предпочтительнее применять смесь PCL25, нейтрализованную смесью щелочи и этанола. Также полученные данные свидетельствуют, что вне зависимости от способа нейтрализации подложек эндотелиальные клетки демонстрируют более эффективную пролиферацию на подложках из смеси PCL и хитозана по сравнению с подложками из 100% хитозана. При нейтрализации хитозановой подложки щелочью данный факт достоверно подтверждался на всех сроках наблюдения в двух или трех повторениях, при нейтрализации щелочью и этанолом — в двух повторениях на 1 и 8 сут. наблюдения. Таким образом, для дальнейших экспериментов мы использовали подложки, нейтрализованные щелочью и этанолом. Общая тенденция улучшения показателей пролиферации клеток на смеси PCL и хитозана по сравнению со 100% хитозаном была показана также методом XTT-анализа пролиферации клеток на подложках, нейтрализованных смесью щелочи и этанола, на 2, 5 и 8 сут. наблюдения (рис. 1Г). Метод основан на том, что жизнеспособные клетки посредством мито-хондриальных ферментов метаболизируют желтые
соли тетразолия в оранжевые соли формазана. Детектируемый коэффициент поглощения коррелирует с количеством жизнеспособных клеток. К 8 сут. наблюдения количество жизнеспособных клеток на РС1_25 и РС1_75 было достоверно большим по сравнению
с количеством клеток на хитозане (рис. 1Г). На подложках из смеси полимеров данный показатель был достоверно выше, чем на необработанной поверхности культурального пластика. Следует отметить, что для РС1_25 такая тенденция наблюдалась уже к 6 сут.
А
н- 250
а
и 200
5
д
6 150 со
<D
§ 100 с
m 50 0
^^ /
L>
¿у
1 сутки 8 сутки 12 сутки
Б
200 150 100 50 0
1 сутки 8 сутки 12 сутки
в
250 200 150 100 50 0
1 сутки 8 сутки 12 сутки
хитозан (щ) I хитозан (щ+э)
PCL25 (щ) PCL25 (щ+э)
PCL50 (щ) PCL50 (щ+э)
PCL75 (щ) PCL75 (щ+э)
г
2,5
3
о
5
О _ 2 G S Ё =
о о 1,5
S Os '
Я S
К
-е-
Г)
ь ь
X
1
0,5 0
,СУ
# I
*
*** ** ■ ■
№т
,CV
,CV
I I 2 сутки 5 сутки ■■ 8 сутки
д
контроль 1 сутки
t
позднии апоптоз
некроз
PCL25 1 сутки
|М 8»
PCL50 1 сутки
PCL75 1 сутки
PI ■
Е
контроль 7 сутки
PCL25 7 сутки
PCL50 7 сутки
PCL75 7 сутки
t
позднии апоптоз
ш
ЙЕ
некроз
: #
йШ « # 'о * "■
#
да О
PI ■
Рис. 1. Динамика пролиферации и жизнеспособность эндотелиальных клеток кардиальных эксплантов человека на подложках с разным соотношением PCL и хитозана:
А — количество клеток в пяти случайных полях зрения на 1, 8, 12 сут. культивирования, (щ) — нейтрализация щелочью, (щ + э) — нейтрализация смесью щелочи и этанола;
Б — количество клеток в пяти случайных полях зрения на подложках, нейтрализованных щелочью; В — количество клеток в пяти случайных полях зрения на подложках, нейтрализованных смесью щелочи и этанола; Г — количество жизнеспособных клеток на 2, 5, 8 сут. культивирования по данным XTT-анализа; Д, Е — доля жизнеспособных клеток, выявленная методом FACS, на 1 и 7 сут. культивирования
Таблица. Жизнеспособность эндотелиальных клеток кардиальных эксплантов человека на подложках с разным соотношением PCL и хитозана
Жизнеспособность
Тип подложки -
через 1 сут. через 7 сут.
Культуральный пластик без подложки 92,8±0,3% 94,0±0,2%
PCL25 87,3±0,3% 86,8±0,3%*
PCL50 85,6±0,4%* 82,5±0,4%*
PCL75 87,4±0,3% 76,8±0,4% *#
* — различия по сравнению с культуральным пластиком без подложки статистически значимы, р<0,05 относительно культурального пластика без подложки; # — различия по сравнению с РС1_25 статистически значимы, р<0,025.
А
TMRM
. » >' л-
» 100 [im
Б
в
Рис. 2. Функциональные свойства эндотелиальных клеток кардиальных эксплантов человека на подложках из смеси поликапролактона и хитозана: А — метаболизация эндотелиальными клетками липопротеина низкой плотности ас1_й1_ (зеленый сигнал) на РС1_25, образование капилляроподобных структур в матригеле на РС1_25 (эндотелиальные клетки окрашены витальным митохондриальным красителем ТМРМ (красный сигнал)); Б — экспрессия клетками Сй 31, фактора фон Виллебранда (уШР), коллагена IV типа и фибронектина; В — экспрессия фактора фон Виллебранда эндотелиоцитами, размещенными на мембране из РС1_75. Иммунофлуоресцентная микроскопия. Окраска специфическими антителами, докраска ядер йАР1
Кроме того, был проведен анализ жизнеспособности клеток с помощью окраски йодидом пропидия (PI) и аннексином V (Annexin V) (рис. 1Д) на исследуемых типах подложек из смеси PCL и хитозана через 1 и 7 сут. после заселения (табл.). Негативная по обоим маркерам популяция клеток является жизне-
способной. Через 1 сут. после заселения доля жизнеспособных клеток на РС1_25 и РС1_75 достоверно не отличалась от таковой на культуральном пластике без подложки. Несмотря на снижение жизнеспособности клеток на РС1_50 (85,6±0,4%) по сравнению с контрольными условиями (92,8±0,3%), не обна-
ружено достоверных отличий в процентном содержании клеток на всех типах подложек. Через 7 сут. после заселения происходило снижение доли жизнеспособных клеток на всех трех типах подложек. При этом данный показатель был достоверно ниже на подложке из PCL75 (76,8±0,4%) по сравнению с PCL25 (86,8±0,3%). В остальных случаях не было достоверной разницы между подложками.
Функциональные свойства эндотелиальных клеток
на подложке из смеси PCL и хитозана in vitro
Чтобы тканеинженерная конструкция имела свойства, максимально приближенные к физиологическим, и могла правильно интегрироваться в окружающие ткани, необходимо, чтобы клетки после заселения на матрикс сохраняли свои функциональные свойства. Поскольку наиболее оптимальные характеристики пролиферации и жизнеспособности клетки демонстрировали на подложке из PCL25, оценка сохранения функциональных свойств клеток проводилась именно на этом материале. Клетки, заселенные на PCL25, сохраняли специфические для эндотелия способности метаболизировать ацети-лированную форму липопротеина низкой плотности и формировать капилляроподобные структуры в толще матригеля, залитого поверх клеток на подложке (рис. 2А). Клетки в составе исследуемой тканеин-женерной конструкции экспрессировали специфические эндотелиальные маркеры: CD31 и фактор фон Виллебранда, а также нарабатывали компоненты межклеточного матрикса: фибронектин и коллаген 4 типа (рис. 2Б). Кроме того, на криосрезах заселенной тканеинженерной конструкции на основе PCL75 детектировался сформированный монослой эндотелиальных клеток, о чем свидетельствовала ярко выраженная окраска антителами к фактору фон Виллебранда (рис. 2В).
Обсуждение
На сегодняшний день актуальной задачей сосудистой хирургии остается разработка тканеинженерных трансплантатов сосудов малого диаметра. Одним из подходящих материалов в силу своих физико-химических и биосовместимых свойств рассматривается смесь синтетического и природного полимеров — PCL и хитозана. Для получения смеси исходные компоненты растворяются в уксусной кислоте, готовые полимерные мембраны нейтрализуют раствором щелочи. Для мембран, изготовленных из 100% хи-тозана, ранее было показано, что в зависимости от способа нейтрализации изменяется наноструктура волокон получившегося полимера, что, в свою очередь, влияет на топографию поверхности мембраны и адгезивные свойства заселяемых клеток [7]. Так, нейтрализация мембраны из хитозана раствором NaOH в 80% этаноле дает преимущества в адгезии и пролиферации фибробластов мыши по сравнению с нейтрализацией раствором NaOH в воде. Однако для смесей PCL и хитозана данный факт не исследовался. Также известно, что на динамику пролиферации клеток влияет соотношение компонентов смеси PCL и хитозана [5, 6].
В данной работе проанализирована динамика пролиферации и сохранение специфических функциональных свойств in vitro эндотелиальных клеток кардиальных эксплантов человека в составе тка-неинженерных конструкций на основе смеси PCL
и хитозана. Смесь более благоприятна для пролиферации эндотелиальных клеток, чем 100% хитозан. Прослеживалась тенденция к увеличению пролифе-ративных показателей эндотелиальных клеток при нейтрализации раствором щелочи с этанолом по сравнению с водным раствором щелочи (рис. 1А). Таким образом, при формировании тканеинженер-ных конструкций, заселенных эндотелиальными клетками кардиальных эксплантов человека, предпочтительнее применять мембраны из PCL и хито-зана, нейтрализованные смесью щелочи и этанола. Для дальнейших экспериментов мы использовали подложки PCL25, нейтрализованные щелочью и этанолом. Однако ускоренный темп пролиферации приводил к некоторому снижению жизнеспособности клеток к 7 сут. наблюдения (рис. 1Д). Вероятно, это связано с контактным торможением пролиферации при быстром достижении критической плотности клеточного слоя. Поэтому при разработке тканеин-женерных конструкций на основе смесей PCL и хи-тозана, заселенных данным типом эндотелиальных клеток, необходимо подбирать оптимальное количество клеток и длительность культивирования конструкции in vitro.
Исходные функциональные характеристики данной клеточной популяции исследованы нами в предыдущей работе [10]. Одной из специфических функциональных характеристик эндотелиальных клеток является способность метаболизировать аце-тилированную форму липопротеина низкой плотности. В данной работе показано сохранение клетками тканеинженерной конструкции на основе смеси PCL и хитозана в условиях in vitro специфических эндотелиальных маркеров: CD31 и фактора Фон Вилле-бранда, способности метаболизировать липопротеин низкой плотности, нарабатывать компоненты межклеточного матрикса, формировать капилляропо-добные структуры в матригеле. Сохранение функциональных свойств клеток в составе тканеинженерной конструкции дает основание полагать, что заселение будет способствовать адекватной интеграции сосудистого трансплантата и, возможно, минимизировать негативные отдаленные показатели. Так, в 2013 г. группой исследователей была продемонстрирована возможность использования материала, состоящего из смеси PCL и хитозана, для создания тканеинженерного сосуда малого диаметра (менее 6 мм). Нановолокна, применяемые для изготовления матрикса-носителя, получали путем электроспиннинга смеси данных полимеров, заселяли аутогенными мононуклеарными клетками периферической крови собаки и имплантировали в сонные артерии 6 животных. Гистологические и иммуногистохимиче-ские анализы тканеинженерных конструкций, изъятых через 3 мес., показали регенерацию эндотелия, а также наличие коллагена и эластина [8]. В работе по экспансии эндотелия роговицы крупного рогатого скота на мембранах, изготовленных из смеси PCL и хитозана методом выпаривания в конвекционной печи, авторы выявили хорошую пролиферативную активность и сохранение морфофункциональных свойств эндотелиальных клеток в составе конструкции [6].
Таким образом, тканеинженерные конструкции на основе PCL и хитозана, заселенные эндотелиальными клетками кардиальных эксплантов человека, могут быть основой для разработки функциональных трансплантатов со свойствами, максимально
приближенными к физиологическим, что позволит снизить негативные последствия, связанные с неадекватной работой сосудистого трансплантата в отдаленном периоде.
ЛИТЕРАТУРА:
1. G N., Tan A., Gundogan B. et al. Tissue engineering vascular grafts a fortiori: looking back and going forward. Expert. Opin. Biol. Ther. 2015; 15(2): 231-44.
2. Tara S., Rocco K.A., Hibino N. et al. Vessel bioengineering. Circ. J. 2014; 78(1): 12-9.
3. Wang T.J., Wang I.J., Lu J.N. et al. Novel chitosan-polycaprolactone blends as potential scaffold and carrier for corneal endothelial transplantation. Mol. Vis. 2012; 18: 255-64.
4. García Cruz D.M., Gomez Ribelles J.L., Salmerón Sánchez M. Blending polysaccharides with biodegradable polymers. I. Properties of chitosan/polycaprolactone blends. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 2008; 85(2): 303-13.
5. Sarasam A., Madihally S.V. Characterization of chitosan-polycaprolactone blends for tissue engineering applications. Biomaterials 2005; 26(27): 5500-8.
6. Young T.H., Wang I.J., Hu F.R. et al. Fabrication of a bioengineered corneal endothelial cell sheet using chitosan/polycaprolactone blend membranes. Colloids Surf. B. Biointerfaces 2014; 116: 403-10.
7. He Q., Ao Q., Gong Y. et al. Preparation of chitosan films using different neutralizing solutions to improve endothelial cell compatibility. J. Mater. Sci. Mater. Med. 2011; 22(12): 2791-802.
8. Zhou M., Qiao W., Liu Z. et al. Development and in vivo evaluation of small-diameter vascular grafts engineered by outgrowth endothelial
Благодарности
Работа поддержана бюджетным проектом Института цитологии и генетики СО РАН № 0324-2015-0003 и грантом РФФИ № 14-04-00082.
cells and electrospun chitosan/poly(e-caprolactone) nanofibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A 2014; 20(1-2): 79-91.
9. Wang H., Zhou J., Liu Z. et al. Injectable cardiac tissue engineering for the treatment of myocardial infarction. J. Cell. Mol. Med. 2010; 14(5): 1044-55.
10. Захарова И.С., Живень М.К., Саая Ш.Б. и др. Разработка клеточных технологий для создания клеточно-наполненных сосудистых трансплантатов. Патология кровообращения и кардиохирургия 2015; 19(4-2): 43-54.
11. Coimbra P., Ferreira P., de Sousa H.C. et al. Preparation and chemical and biological characterization of a pectin/chitosan polyelectrolyte complex scaffold for possible bone tissue engineering applications. Int. J. Biol. Macromol. 2011; 48(1): 112-8.
12. Thuaksuban N., Nuntanaranont T., Pattanachot W. et al. Biodegradable polycaprolactone-chitosan three-dimensional scaffolds fabricated by melt stretching and multilayer deposition for bone tissue engineering: assessment of the physical properties and cellular response. Biomed. Mater. 2011; 6(1): 015009.
13. Thuaksuban N., Nuntanaranont T., Suttapreyasri S. et al. Biomechanical properties of novel biodegradable poly e-caprolactone-chitosan scaffolds. J. Investig. Clin. Dent. 2013; 4(1): 26-33.
14. Yang W., Fu J., Wang D. et al. Study on chitosan/ polycaprolactone blending vascular scaffolds by electrospinning. J. Biomed. Nanotechnol. 2010; 6(3): 254-9.
Поступила: 04.03.2016
