CC BY
19
ПРЕПАРАТЫ
ИНДУКЦИЯ ПРОТЕКТИВНОГО ГЕТЕРОСУБТИ-ПИЧЕСКОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА ПРИ ИММУНИЗАЦИИ РЕКОМБИНАНТНЫМИ АДЕНОВИРУСНЫМИ ВЕКТОРАМИ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИМИ ГЕМАГГЛЮТИНИН ВИРУСА ГРИППА H5
'Шмаров М.М., 'Седова Е.С., 'Верховская Л.В., 2Руднева И.А., 'Богачева Е.А., 'Барыкова Ю.А., 'Щербинин Д.Н., 'Лысенко А.А., 'Тутыхина И.Л., 'Логунов Д.Ю.,2Смирнов Ю.А., 'Народицкий Б.С., 'Гинцбург А.Л.
'Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательской институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН, г. Москва, РФ; 2Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательской институт вирусологии им. Д.И Ивановского РАМН, г. Москва, РФ
Вирусы гриппа характеризуются большой антигенной вариабельностью, что приводит к ежегодному возникновению эпидемий, а через нерегулярные интервалы времени (10 - 40 лет) - пандемий вызываемых вирусами гриппа с новыми антигенными и биологическими свойствами. Решить проблему защиты населения от эпидемий вируса гриппа могут помочь новые подходы к вакцинации, одним из которых является применение генетических вакцин, созданных на основе аденовирусных векторов. Рекомбинантные аденовирусные векторы, несущие гены гемагглютинина вирусов гриппа птиц H5N1 и H5N2 (Ad-HA5-1 и Ad-HA5-2) были получены c использованием системы AdEasy Adenoviral Vector System (Stratagene). Лабораторные мыши были двукратно инт-
раназально иммунизированы Ad-HA5-1 и Ad-HA5-2. Показано, что иммунизация рекомбинантными аденовирусами, несущими ген гемагглютинина вируса гриппа Н5, обеспечивает индукцию протективного иммунного ответа, защищающего иммунизированных мышей не только от не летальной дозы вируса гриппа Н5 гетерологичного субтипа, но и от летальной дозы вируса гриппа подтипа Н1, относящегося к тому же клайду, что и Н5, но не обеспечивает защиту мышей против вируса гриппа подтипа Н3, относящегося к другому клайду.
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что аденовирусные векторы могут служить универсальной платформой для получения вакцин, как от сезонных, так и от пандемических штаммов вируса гриппа.
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ЖИВОЙ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ «ВЕКТОР-ФЛЮ»
'Нечаева Е.А., 'Сенькина Т.Ю., 'Радаева И.Ф., 'Свириденко Т.М., 'Жилина Н.В., 'Рыжиков А.Б., 'Богрянцева М.П.,2Киселева И.В., 'Ларионова Н.В., 2Руденко Л.Г., 'Дроздов И.Г.
1 ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, п. Кольцово, Новосибирской области, Россия;
2 НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург, Россия
В соответствии с рекомендациями ВОЗ ряд зарубежных фирм с 1995 г. приступил к разработке культураль-ных вакцин против гриппа, поскольку вакцины, получаемые на основе клеточных культур, могут оказаться важным инструментом быстрого реагирования в случае угрозы пандемии. Учитывая стабильность свойств перевиваемых культур клеток, отсутствие контаминан-
тов, возможность сохранения клеток в виде аттестованных банков, возможность выращивания клеток в промышленных ферментерах, разработка технологии получения живой культуральной гриппозной вакцины является актуальной задачей.
В ГНЦ ВБ «Вектор» с 2001 г. ведутся исследования по разработке технологии культивирования различных
е
2010 г.
штаммов вируса гриппа в клетках MDCK, стабилизации и лиофилизации вируссодержащего материала, получению и контролю готовых форм культуральных гриппозных вакцин. Созданы и аттестованы посевные и рабочие банки культуры клеток МDCK, получены рекомендации Ученого совета ГИСК им. Л.А. Тарасеви-ча на использование клеток МDCK в производстве профилактических препаратов.
Для создания вакцины против пандемического гриппа А/Н1Ж использовали вакцинный штамм А/17/Калифор-ния/2009/38, полученный из НИИ экспериментальной
медицины СЗО РАМН. На базе экспериментально-производственного участка отработаны режимы культивирования клеток MDCK и вакцинного штамма вируса гриппа в ферментерах с объемом культурального сосуда 10 и 14 л; исследована репродукция штамма А/Н1Ж в бессывороточных питательных средах; подобраны составы стабилизаторов, которые позволили сохранить специфическую активность вируса на этапах лиофили-зации и последующего режимного хранения. Разработанные технологические приемы легли в основу заявки на патент.
БИОЛОГО-ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ АНТИПРОТЕАЗНОЙ ТЕРАПИИ ГРИППА
Дивоча В.А.
ГП «Украинский НИИ медицины транспорта», г. Одесса, Украина
Целью работы являлось изучение состояния и роли ан-типротеиназных систем вируса и реципиента в развитии гриппозной инфекции для обоснования получения и использования принципиально новых лечебных препаратов на основе ингибиторов трипсиноподобных протеиназ.
Работа посвящена изучению взаимодействия проте-олитической системы клетки - хозяина с вирусом гриппа, который размножается в ней. В работе разрабатывается новое направление борьбы с гриппозной инфекцией, основанное на блокировании вируса в межклеточном пространстве или при сборке его в самой клетке путем использования специфических ан-типротеиназных иммунных сывороток или ингибитора трипсиноподобной протеиназы.
В работе использовались вирусы гриппа А и В, трип-синоподобные протеиназы и их ингибиторы, куриные эмбрионы, легкие и кровь белых мышей и крыс, природные и синтетические ингибиторы трипсина, кровь человека. Исследования проводились с использованием вирусологических, биохимических, иммунологических, молекулярно-биологических и радиоизотопных методов исследований.
Установлено, что очистка и концентрация вируса гриппа методами центрифугирования не освобождали вирус гриппа от белков с протеиназной активностью. Доочистка вируса гриппа в ступенчатом градиенте сахарозы показала, что в зоне 38 - 43% концентрации сахарозы локализовалось основное количество вируса гриппа и большая часть протеолитической активности. Первоначально ассоциированная с вирусом гриппа протеиназа в градиенте сахарозы разделилась на четыре изоформы, а из нормальных хорионаллантоисных оболочек - на три изоформы, которые в 345 раз были ниже, чем вирусассоциированные. Эллюция и адсорбция вируса гриппа на формалинизированных эритроцитах показали, что протеолитическая активность не связана с У-антигеном, а, по-видимому, связана с РНП.
Метод электрофореза в ПААГе вируса гриппа в нево-сстанавливающих условиях показал чёткое разделение
протеиназы на 7 - 9 фракций, которые владели высокой протеолитической активностью и различным электрическим зарядом. Протеиназа, ассоциированная с вирусом гриппа, является клеточным ферментом, так как иммунные сыворотки к нормальным хорионаллантоис-ным оболочкам куриного эмбриона нейтрализовали протеиназу в зоне 35 - 45% сахарозы, где локализовался очищенный вирус гриппа, при этом гемагглютиниру-ющая активность сохранялась. При заражении белых мышей вирусом гриппа А происходило нарушение фер-ментно-ингибирующего баланса. Наиболее глубокие изменения происходили в первые часы после заражения. Снижение протеиназной активности в первые часы после заражения объясняются увеличением ингибиру-ющей протеиназу активности. При заражении куриных эмбрионов вирусом гриппа А в первые часы происходит увеличение как протеиназной, так и ингибирующей активности. В лёгких заражённых мышей и в куриных эмбрионах имеется соответствие между накоплением инфекционного агента и наступающим снижением протеиназной и ингибирующей активности. При заражении мышей вирусом гриппа В профиль протеиназной активности был не так резко выражен в лёгких и имел отличия по сравнению с вирусом гриппа А. Сходство было отмечено только в первые часы после заражения. Вирусиндуцированный клеточный ингибитор в первые часы после заражения играет важную роль в блокировке протеиназы, после его истощения главную роль в развитии патологии берут на себя трипсиноподобные протеиназы, которые начинают расщеплять гемагглю-тинин и при этом происходит возрастание инфекционного титра. Из лёгких незаражённых мышей выделено шесть изоформ трипсиноподобной протеиназы, из заражённых вирусом гриппа - восемь изоформ, обладающих высокой удельной протеолитической активностью. Изучены их физико-химические свойства. Установили, что ингибиторы трипсина: триэлин, ово-мукоид, ингибитор из ячменя и Э-АКК не одинаково ингибировали их протеиназную активность. Оптимальная рН изоформ, выделенных из лёгких незара-
