CC BY
32Процессы и машины агроинженерных систем
УДК 664;66.081.6 Код ВАК 05.20.01
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО
ПРИРОДНОГО АНГИОГЕНИНА
В.А.Тимкин,1* В.С. Артемова 1, Л.А. Новопашин1
1 ФГБОУ ВО Уральский ГАУ, Россия, Екатеринбург.
*E-mail: ural.m embrana@yandex .ru
Аннотация. Работа посвящена разработке технологии природного ангиогенина. Рассмотрены основные свойства ангиогенина, существующие технологии его получения, раскрыта актуальность проблемы. Проведены исследования, направленные на изучение баромембранных процессов в условиях приближенных к изоэлектрической точке. Научной новизной будет являться: применение мембранных процессов, наиболее близких по своей сущности к биологическим процессам и разработка на их основе оптимальных режимных параметров процесса разделения молочного сырья, путем приближения к изоэлектрической точке выделяемого компонента, для получения биологически активного природного ангиогенина. В качестве сырья предлагается использовать молочную сыворотку, поскольку данный тип сырья широко распространен как в России, так и в Свердловской области, но при этом крайне мало используется, так как считается отходом производства. При этом содержание ангиогенина в сыворотке молока довольно велико.
Разработана технологическая схема получения природного ангиогенина. Преимущества предлагаемой технологии получения природного ангиогенина: увеличение объемов производства; менее трудоемкие производственные процессы; низкая себестоимость готовой продукции по сравнению с аналогами; увеличение доступности для потребителя; расширение ассортимента. Предполагается использовать технологию на молокоперерабатывающих предприятиях, при этом суточный объем производства будет составлять порядка 15-40 грамм готового продукта. Оценка себестоимости готовой продукции составляет 60 руб./мг.
Ключевые слова: ангиогенин, белок, ультрафильтрация, изоэлектрическая точка, мембрана, селективность, проницаемость.
DEVELOPMENT OF TECHNOLOGY FOR OBTAINING BIOLOGICALLY ACTIVE
NATURAL ANGIOGENIN
Timkin V. A., Artemova V. S. 1*, Novopashin L.A.1
1 Ural state agrarian University, Ekaterinburg
*E-mail: ural.m embrana@yandex .ru
Abstract. The work is devoted to the development of natural angiogenin technology. The main properties of angiogenin, the existing technologies of its production are considered, the relevance of the problem is revealed. Studies aimed at studying baromembrane processes under conditions close to the isoelectric point are carried out. The scientific novelty will be: the use of membrane processes that are closest in essence to biological processes and the development on their basis of optimal regime parameters of the process of separation of dairy raw materials, by approaching the isoelectric point of the isolated component, to obtain biologically active natural angiogenin. As a raw material, it is proposed to use whey, since this type of raw material is widely distributed both in Russia and in the Sverdlovsk region, but it is extremely little used, since it is considered a waste product. At the same time, the content of angiogenin in milk serum is quite high.
A technological scheme for the production of natural angiogenin has been developed. Advantages of the proposed technology for obtaining natural angiogenin: increased production volumes; less laborintensive production processes; low cost of finished products compared to analogues; increased availability to the consumer; expansion of the range. It is planned to use the technology at milk processing enterprises, while the daily production volume will be about 15-40 grams of the finished product. The estimated cost of finished products is 60 rubles / mg.
Keywords: angiogenin, protein, ultrafiltration, isoelectric point, membrane, selectivity, permeability.
Постановка проблемы (Introduction)
Ангиогенин - полифункциональный белок, основными свойствами которого являются: ранозаживляющий эффект, антимикробная функция, участие в образовании новых кровеносных сосудов, защита организма в стрессовых ситуациях, и применение при лечении онкологических заболеваний. Этот белок был открыт в США в 1985 г. [1-3] и был назван ангиогенином (от греч. angion - сосуд), это новый представитель семейства панкреатических рибонуклеаз, оказавшийся активным индуктором роста кровеносных сосудов. В 1988 г. ангиогенин был обнаружен в коровьем молоке. Структура, физико-химические и ферментативные свойства ангиогенина достаточно полно изучены [2-7].
Известно, что существует по крайней мере 3 молекулярные формы ангиогенина молока. Ангиогенин-1 - основной белок с изоэлектрической точкой более 9,5 рН. Наиболее значимыми для ферментативной активности ангиогенина-1 являются аминокислоты - гистидин и лизин. Другим ангиогенным белком молока является бычий ангиогенин-2 [3, 8-12]. Это одноцепочный полипептид из 123 аминокислотных остатков, имеет более высокую молекулярную массу - около 20 000. Гомологичность ангиогенина-2 ангиогенину-1 составляет 57 %. Третьей молекулярной формой ангиогенина в коровьем молоке является лактогенин. Его молекулярная масса составляет около
17000. Да. Этот белок не гомологичен ангиогенину-2, хотя и сходен с ним в некоторых позициях аминокислотной последовательности.
Молекулярные формы ангиогенина молока несколько различаются между собой как по активности, так и по субстратной специфичности. Их ферментативные свойства определяются не столько первичной структурой критических для нее довольно консервативных участков, сколько расположением их в молекуле, т. е. пространственной структурой.
Ангиогенин (рис. 1) (с греч. angion - «сосуд» и genes - «порождающий») -полифункциональный белок, обладающий уникальной рибонуклеазной (рибонуклеазолитической) активностью и являющийся мощным стимулятором образования кровеносных сосудов [5-12].
Рисунок 1 - Структурный вид ангиогенина
Свойства ангиогенина:
• Ранозаживляющий эффект
• Образование новых кровеносных (капиллярных) сосудов
• Защита организма в стрессовых ситуациях
• Антимикробная функция
• Лечение онкологических заболеваний.
На диаграмме (рис.2) представлены страны, в которых занимаются исследованием и получением ангиогенина. Как видно, в России эти исследования находятся на начальной стадии.
■ США ■ Япония ■ Канада
■ Россия ■ Франция ■ Германия
■ Великобритания
Рисунок 2 - Диаграмма стран Литературные данные, касающиеся биохимических свойств ангиогенина из различных источников, свидетельствует об его полифункциональности [4,6,9].
Показано, что выделенные из коровьего молока ангиогенина-1 и лактогенин ингибируют синтез белка в лизатах ретикулоцитов кролика на 50 % при концентрациях ниже 100 нмоль. Выделенный из коровьего молока ангиогенин в концентрации ~ 0,15 мкг/мл контролирует образование меланина в клетках. Недавно обнаружен бактериостатитический эффект ангиогенина. Он тормозит рост кишечной палочки. Возможно, что устойчивый к протеолитическим ферментам и низким значениям рН этот фермент является одним из неспецифических антимикробных факторов молока и может проявлять свое действие уже в желудочно-кишечном тракте [13-15]. Есть основание полагать, что ангиогенин молока участвует в передаче пассивного иммунитета при скармливании молодняка, на что указывает его синтез в молочной железе и зависимость содержания в молоке от физиологических факторов, связанных с репродуктивной функцией лактирующих животных. Очевидно, не случайно в ранний период лактации в молоке, и особенно в молозиве, отмечается высокий уровень ангиогенина [16, 17].
Биологическая активность ангиогенина коровьего молока (в модификации кожной пробы по Г. С. Комоловой) исследована И. И. Ионовой (1998 г.)[1-4], показавшая активный рост кровеносных сосудов в коже ушной раковины и на роговице глаза крысы. Ангиогенин рассматривают также как активный фактор костеобразования [13-17].
С учетом известных физиологических функций ангиогенина, и в частности из молока, можно прогнозировать перспективу его применения в медицине и косметологии. Просматривается возможность получения из ангиогенина молока пищевых добавок к детским и диетическим продуктам специального назначения [11-17].
На сегодняшний день существует технология получения рекомбинантного ангиогенина, синтезируемого в лабораторных условиях путем встраивания гена человеческого ангиогенина в генетический аппарат бактерий Escherichia coli [1-6], что дает им возможность продуцировать человеческий ангиогенин. Данная технология является чрезвычайно трудоемкой, при этом объем получаемой продукции невелик, из чего следует его дороговизна и ограниченная доступность. Природный ангиогенин, находящийся в молоке и молочном сырье, по своим свойствам схож с рекомбинантным.
В России исследования по использованию ангиогенина находятся на начальной стадии. Исходя из этого, можно сделать вывод, что разработка технологии получения природного ангиогенина из молочного сырья является актуальной и перспективной задачей.
Преимущества предлагаемой технологии получения природного ангиогенина: увеличение объемов производства; менее трудоемкие производственные процессы; низкая себестоимость готовой продукции по сравнению с аналогами; увеличение доступности для потребителя; расширение ассортимента.
В (табл.1) приведены источники содержания природного и рекомбинантного ангиогенина[4].
Таблица 1 - Источники ангиогенина
Источник Выход Молекулярная Аминокислотный
ангиогенина ангиогенина, мкг/л масса, кДа состав
Природный Культуральная среда клеток Нт-29 0,5 14,0 124
Плазма крови быка 30-80 14,0 124
Плазма крови 60-150 14,0 124
человека
Коровье молоко 2300-9000 14,577-14,599 125
Молочная сыворотка 500-800 14,577-14,599 125
Рекомбинантный
Культуральная среда:
Культуры клеток
детенышей хомячка 400 14,0 123
Культуры E. Coli, % общего
бактериального белка 1,5-3,0 14,0 123
Научной новизной будет являться: применение мембранных процессов, наиболее близких по своей сущности к биологическим процессам и разработка на их основе оптимальных режимных параметров процесса разделения молочного сырья, путем приближения к изоэлектрической точке выделяемого компонента, для получения биологически активного природного ангиогенина.
Методология и методы исследования (Methods)
В качестве сырья предлагается использовать молочную сыворотку, поскольку данный тип сырья широко распространен как в России, так и в Свердловской области, но при этом крайне мало используется, так как считается отходом производства. При этом содержание ангиогенина в сыворотке молока довольно велико.
Использовали свежую творожную и подсырную несоленую сыворотку, соответствующую ГОСТ Р 53438 - 2009 (табл. 2).
Таблица 2 - Состав молочной сыворотки (средние значения)
Параметры Сыворотка творожная Сыворотка подсырная
Белок общий, % 0,9 0,7
Лактоза, % 4,3 4,9
Жир, % 0,4 0,1
Минеральные вещества, % 0,7 0,6
СВ, % 6,2 6,4
Физико-химические показатели определяли по стандартным методикам. Ангиогенин
определяли количественным методом путем хроматографической очистки сырья от избытка РНКазы перед проведением комбинированной пробы конкурентного взаимодействия панкреатической рибонуклеазы и ангиогенина с плацентарным ингибитором РНКазы. Общая и
активная кислотность определялась потенциометрическим методом по ГОСТ 15113.5-77 с использованием рН метра HI 2211(погрешность ±0,03 ед. рН).
Диапазон наших исследований находится в разделе «Сывороточные белки» (рис. 3). Молочная сыворотка при разделении в процессе ультрафильтрации не подвергается тепловому воздействию, а значит, сохраняются все полезные свойства сывороточных белков для извлечения активного ангиогенина.
Исследование процесса УФ проводилось в лабораторных условиях на установке (рис. 4). В экспериментах использовались полисульфонамидные - УПМ-20; 50М, ацетатцеллюлюзные - УАМ-50П; 100П, а так же керамическая мембрана серии КУФЭ. Мембраны характеризуются «отсечками» по молекулярной массе 10; 30; 50; 100; 150 кДа.
Результаты (Results)
Основываясь на положении, что аминокислоты и, соответственно, белки являются по своей природе амфотерными молекулами, так как содержат и кислотные, и щелочные функциональные группы, мы предположили, что существует взаимосвязь между основными характеристиками процесса ультрафильтрации и активной кислотностью разделяемой молочной сыворотки. Эксперименты осуществлялись в диапазоне pH, при котором исследуемый продукт соответствует изоэлектрической точке ангиогенина, а также в небольшом интервале (±1,0 - 2,5 ед. рН) за этими пределами, для исследования характера зависимости.
Рисунок 3 - Диапазон исследований
Зависимость проницаемости ультрафильтрационной мембраны по ангиогенину от активной кислотности сыворотки приведена на (рис. 5). Как видно из графика, проницаемость ультрафильтрационной мембраны существенно зависит от показателя рН исследуемого раствора. При увеличении щелочности, добавлением гидрокарбоната натрия, в диапазоне рН 8 - 10 ед.,
проницаемость возрастает, достигая максимального значения. Дальнейшее увеличение щелочности исследуемого раствора приводит сначала к стабилизации проницаемости (рН 9,5 ед.), а затем к ее резкому снижению.
1 - мембранная ячейка; 2 - насос;3 - циркуляционный бак; 4 - бак для пермеата; 5 - манометр; 6 -ротаметр; 7 - вентиль регулировочный; 8 - змеевик; 9 -термопара; 10 - милливольтметр; 11 -
сосуд Дьюара; 12 - разделитель; 13, 14 - вентили. Рисунок 4 - Схема лабораторной установки:
§ О
55 54 53 52 51 50 49 48 47 46 45
Рисунок 5 - Зависимость проницаемости ультрафильтрационной мембраны по ангиогенину от
активной кислотности сыворотки Максимальное значение проницаемости О = 54 дм 3 /(м2 ч) наблюдается в интервале рН 9,5 -10, что хорошо согласуется со значением активной кислотности изоэлектрической точки ангиогенина.
Селективность ультрафильтрационной мембраны по ангиогенину, при изменении рН в исследуемом диапазоне (рис. 6), изменяется значительно.
1
0,95 0,9 0,85 0,8 0,75 0,7
^ 0,65 0,6 0,55 0,5 0,45 0,4 0,35
8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 11,5 12 12,5
рН
Рисунок 6 - Зависимость селективности ультрафильтрационной мембраны от активной
кислотности сыворотки Наибольшие «провалы» селективности наблюдаются областях рН, соответствующих изоэлектрической точке ангиогенина.
Проведенные эксперименты показали возможность влияния активной кислотности разделяемой молочной сыворотки на процесс ультрафильтрации посредством приближения к изоэлектрической точке ангиогенина.
В лабораторных условиях из 10 литров творожной сыворотки был получен водный раствор ангиогенина с концентрацией 8,5 мг/л.
Обсуждение и выводы (Discussion and Conclusion)
По результатам исследований разработана технологическая схема получения природного ангиогенина (рис. 7).
Ультрафильтрация
Сублимация
Рисунок 7 - Технологическая схема получения природного ангиогенина Предполагается использовать технологию на молокоперерабатывающих предприятиях, при этом суточный объем производства будет составлять порядка 15-40 грамм готового продукта.
Оценка себестоимости готовой продукции составляет 60 руб./мг. Соответственно, стоимость суточного объема продукции будет составлять 900-2400 тыс. руб.
Библиографический список
1. Гидролазы [Электронный ресурс].- Режим доступа: https://alternativa-sar.ru/tehnologu/mol/v-p-shidlovskaya-fermenty-moloka/1596-1-5-gidrolazy-3-i-klass;
2. Комолова Г.С, Федорова Т.В. Ангиогенин молока. // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. № 3. 229-236;
3. Strydom, D.J., Bond, M.D., and Vallee, B.L., Eur. J. Biochem., 1997, vol. 247, no. 2, pp. 535-544 ;
4. Тихомирова Н. А. Научные и практические основы получения молочного сырья биологически активного вещества ангиогенина : Автореферат, 1999.- 48с;
5. А. Е. Гуляев, С. В. Лохвицкий, Б. А.Тусупханов . Ранозаживляющие эффекты рекомбинантного ангиогенина человека: Научная работа, 2010;
6. Миннигареев Б.У., Тимкин В.А. Получение биологически активного природного ангиогенина с применением баромембранной технологии: Статья .- Уральский ГАУ : 2019.- 58-60с.
7. Саматошенков И.В. Стимулирование ангиогенеза скелетной мышцы крысы путем прямого и клеточно-опосредованного введения рекомбинантного гена ангиогенина Морфология. 2020. Т. 157. № 1. С. 35-40.
8. Ельчанинов В.В. Некоторые технологические аспекты получения сывороточных белков коровьего молока 8. Получение ангиогенина Молочная промышленность. 2018. № 4. С. 4041.
9. Тихомирова Н.А., Титов Е.И., Ионова И.И. Ресурсы вторичного сырья для создания инновационной продукции Переработка молока. 2017. № 10 (216). С. 48-51.
10. Тихомирова Н.А. Влияние гомогенизации на ангиогенин молока. Переработка молока. 2012. № 9 (155). С. 68-69.
11. Уметалиева А.Б., Габитов В.Х., Елясин П.А. Архитектоника кожи после термического воздействия в условиях применения ангиогенина Медицина и образование в Сибири. 2014. № 2. С. 63.
12. Гуляев А.Е., Шульгау З.Т., Сергазы Ш.Д., Ашуева З.И., Толыбекова А.А. Безопасность и переносимость гелевой формы рекомбинантного ангиогенина человека под торговым названием «Фармаген» при наружном применении у здоровых добровольцев Вестник СурГУ. Медицина. 2016. № 3 (29). С. 39-47.
13. Merkel A., Ashrafi A.M. An investigation on the application of pulsed electrodialysis reversal in whey desalination International Journal of Molecular Sciences. 2019. Т. 20. № 8. С. 1918.
14. Yee K.W.K., Wiley D.E., Bao J. Whey protein concentrate production by continuous ultrafiltration: operability under constant operating conditions Journal of Membrane Science. 2017. T. 290. № 1-2. C. 125-137.
15. Babenyshev S.P., Zhidkov V.E., Mamay D.S., Utkin V.P., Shapakov N.A. Ultrafiltration of modified milk whey Foods and Raw Materials. 2016. T. 4. № 2. C. 101-110.
16. Andreeva M.A., Gil V.V., Pismenskaya N.D., Dammak L., Kononenko N.A., Larchet C., Grande D., Nikonenko V.V. Mitigation of membrane scaling in electrodialysis by electroconvection enhancement, Ph Adjustment and pulsed electric field application Journal of Membrane Science. 2018. T. 549. C. 129-140.
17. Fedosov S.V., Maslennikov V.A., Osadchii Y.P., Markelov A.V. Pressure loss along the channel of a tubular membrane during the ultrafiltration of liquid media Theoretical Foundations of Chemical Engineering. 2020. T. 54. № 2. C. 380-387.
References
1. Hydrolases [Electronic resource].- Access mode: https://alternativa-sar.ru/tehnologu/mol/v-p-shidlovskaya-fermenty-moloka/1596-1-5-gidrolazy-3-j-klass;
2. Komolova G. S., Fedorova T. V. Milk angiogenin. // Applied Biochemistry and Microbiology. 2002. Vol. 38. no. 3. 229-236;
3. Strydom, D.J., Bond, M.D., and Vallee, B.L., Eur. J. Biochem., 1997, vol. 247, no. 2, pp. 535-544 ;
4. Tikhomirova N. A. Scientific and practical bases of obtaining dairy raw materials of biologically active substance angiogenin : Abstract, 1999. - 48c;
5. A. E. Gulyaev, S. V. Lokhvitsky, B. A. Tusuphanov . Wound-healing effects of recombinant human angiogenin: Scientific work, 2010;
6. Minnigareev B. U., Timkin V. A. Preparation of biologically active natural angiogenin using baromembrane technology: Article.- Ural State Agrarian University : 2019. - 58-60s.
7. Samatoshenkov I. V. Stimulation of rat skeletal muscle angiogenesis by direct and cellmediated administration of the recombinant angiogenin gene Morphology. 2020. Vol. 157. No. 1. pp. 3540.
8. Elchaninov V. V. Some technological aspects of obtaining whey proteins of cow's milk 8. Obtaining angiogenin Dairy industry. 2018. No. 4. pp. 40-41.
9. Tikhomirova N. A., Titov E. I., Ionova I. I. Resources of secondary raw materials for the creation of innovative products Milk processing. 2017. No. 10 (216). pp. 48-51.
10. Tikhomirova N. A. The effect of homogenization on milk angiogenin. Milk processing. 2012. No. 9 (155). pp. 68-69.
11. Umetalieva A. B., Gabitov V. Kh., Elyasin P. A. Architectonics of the skin after thermal exposure in the conditions of angiogenin application Medicine and education in Siberia. 2014. No. 2. p. 63.
12. Gulyaev A. E., Shulgau Z. T., Sergazy Sh. D., Ashueva Z. I., Tolybekova A. A. Safety and tolerability of the gel form of recombinant human angiogenin under the trade name "Farmagen" for external use in healthy volunteers Vestnik SurGU. Medicine. 2016. No. 3 (29). pp. 39-47.
13. Merkel A., Ashrafi A.M. An investigation on the application of pulsed electrodialysis reversal in whey desalination International Journal of Molecular Sciences. 2019. T. 20. № 8. C. 1918.
14. Yee K.W.K., Wiley D.E., Bao J. Whey protein concentrate production by continuous ultrafiltration: operability under constant operating conditions Journal of Membrane Science. 2017. T. 290. № 1-2. C. 125-137.
15. Babenyshev S.P., Zhidkov V.E., Mamay D.S., Utkin V.P., Shapakov N.A. Ultrafiltration of modified milk whey Foods and Raw Materials. 2016. T. 4. № 2. C. 101-110.
16. Andreeva M.A., Gil V.V., Pismenskaya N.D., Dammak L., Kononenko N.A., Larchet C., Grande D., Nikonenko V.V. Mitigation of membrane scaling in electrodialysis by electroconvection enhancement, Ph Adjustment and pulsed electric field application Journal of Membrane Science. 2018. T. 549. C. 129-140.
17. Fedosov S.V., Maslennikov V.A., Osadchii Y.P., Markelov A.V. Pressure loss along the channel of a tubular membrane during the ultrafiltration of liquid media Theoretical Foundations of Chemical Engineering. 2020. T. 54. № 2. C. 380-387.
