CC BY
31
2003
Известия ТИНРО
Том 135
УДК 664.95
Э.Н.Ким, С.М.Патрышев (Дальрыбвтуз)
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИНТЕНСИФИКАТОРА ВКУСА
Наиболее перспективным направлением создания технологий, обеспечивающих высокое качество и безопасность рыбных продуктов, является использование современных интенсификаторов вкуса, позволяющих направленно регулировать органолептические характеристики пищевых продуктов. Возможным вариантом решения данной задачи может быть разработанная технология получения 5'-мононуклеотидов из молок лососевых рыб на основе использования иммобилизованных ферментных препаратов. В статье подробно рассмотрена технология получения 5'-мононуклеотидов, даны практические рекомендации ее применения, а также методы использования 5'-мононуклеотидов при изготовлении различных продуктов из гидробионтов и их влияние на органолептические характеристики готовых продуктов.
Kim E.N., Patryshev S.M. Development of taste and flavor potentiator technology // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 135. — P. 281-287.
The important branch of fish industry development is the creation of the technologies providing the high quality and safety of fish products. The most perspective way of it is application of modern taste and flavor potentiators, allowing directional regulation of food products organoleptic characteristics. The possible variant of this task solving is the elaborated technology of 5'-mononucleotides production from salmon milt on the base of using immobilized enzyme preparations.
The technology of 5'-mononucleotides production is described in detail, recommendations of its practical usage are given, the methods of 5'-mononucleotides use for preparing of various seafood products are considered, as well as their influence on organoleptic characteristics of final products.
В соответствии с концепцией государственной политики в области здорового питания населения России на период до 2005 г. одним из важных направлений развития рыбной отрасли является создание технологий, обеспечивающих высокое качество и безопасность рыбных продуктов.
Перспективным направлением решения указанной проблемы является использование современных интенсификаторов вкуса, позволяющих направленно регулировать органолептические характеристики пищевых продуктов, использовать нетрадиционные объекты промысла для производства деликатесных изделий, повысить технологичность, экологичность и рентабельность их производства.
Анализ научной литературы и патентной документации показал, что в качестве интенсификаторов вкуса в пищевой промышленности многих зарубежных стран широко используются глутаминат натрия и 5'-рибомононуклеотиды (McCormick, 1986). Объем мирового производства глутамината натрия для этих целей в мире составляет сотни тысяч тонн в год, а 5'-рибомононуклеотидов — тысячи тонн в год, причем объемы производства этих веществ растут с каж-
дым годом в геометрической прогрессии. Отечественной промышленностью из указанных интенсификаторов вкуса освоен только выпуск глутамината натрия, но явно в недостаточных для пищевой промышленности объемах. Производство 5'-рибомононуклеотидов отсутствует вообще.
Наряду с отдельными видами 5'-рибомононуклеотидов в некоторых странах эффективно используются всевозможные ферментативные гидролизаты. При этом использование суммарного препарата 5'-мононуклеотидов экономически более эффективно (Сафронова и др., 1992).
Рыбная промышленность обладает богатейшим сырьем для производства интенсификаторов вкуса на основе мононуклеотидов. Наиболее подходящими являются молоки лососевых рыб, содержащие дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК). При этом необходимо отметить, что ДНК по сравнению с рибомононук-леотидами более устойчива к воздействию высоких и низких температур, ионизирующего излучения, кислот и щелочей (Гофман, 1971). Это позволяет предполагать более широкую сферу применения интенсификаторов вкуса, полученных из молок лососевых рыб, в частности, в производстве стерилизованных пищевых продуктов.
ДНК представляет собой природный полимер весьма сложной конструкции. Однако в ее структуре можно выделить основные компоненты. Это четыре вида нуклеотидов, которые соединяются между собой в различной последовательности посредством фосфоэфирных связей. Нуклеотиды, в свою очередь, состоят из трех компонентов, специфически связанных между собой: пуриновых или пири-мидиновых оснований, молекулы 2-дезокси^-рибозы и молекулы фосфорной кислоты (Гофман, 1971; Мусил и др., 1981).
Для нуклеотидов характерно (Гофман, 1971; Мусил и др., 1981) следующее:
— соединение между собой через фосфатные мостики, которые идут от третьего углеродного атома рибозы или соответствующей дезоксирибозы одного нуклеотида к пятому углеродному атому сахара другого нуклеотида;
— сахара своим первым углеродным атомом всегда соединяются с соответствующим основанием: с пуриновыми основаниями по их девятому атому азота, с пиримидиновыми основаниями по третьему атому азота;
— сахара находятся в нуклеотидах в форме D-фуранозы; соединение последних с основаниями осуществляется через Ь-гликозидную связь;
— основания находятся в нуклеотидах в форме лактамов. Молярное отношение нуклеотидов в молоках лососевых рыб составляет АМФ: ТМФ: ГМФ: ЦМФ = 10,0: 9,8: 7,0: 6,9 (Микельсон, 1966).
Расщепить фосфоэфирные связи ДНК, с целью получения нуклеотидов, можно двумя путями: химическим гидролизом или ферментативным расщеплением. Но продуктами химического гидролиза, независимо кислотного или щелочного, являются З'-мононуклеотиды, которые не интенсифицируют вкусовые качества пищевых продуктов, так как одним из условий этого является положение 5' в рибозной части, подвергающейся фосфорной этерификации (Микельсон, 1966; Зейдана, 1985).
Более эффективно использование ферментного препарата в иммобилизованном виде (Тривен, 1983). Это обеспечивает возможность оптимизации условий процесса ферментации (температуры, рН), а также ускорения ферментативной реакции. Степень и природа этих изменений зависят не только от ферментативной реакции, но и от используемого метода иммобилизации (Тривен, 1983).
Исходя из изложенного, целью настоящих исследований являлась разработка технологии интенсификатора вкуса из молок дальневосточных лососевых рыб. В соответствии с этим решались следующие конкретные задачи: исследование процесса выделения ДНК из молок лососевых рыб; оптимизация процесса фер-
ментации Д НК; разработка технологии интенсификатора вкуса и оценка его функциональных свойств.
В качестве сырья были выбраны молоки дальневосточных лососевых рыб 3-4-й стадии зрелости, которые практически не используются для производства пищевых продуктов.
Качество полученной ДНК оценивали по ультрафиолетовому спектру в области 230-290 нм, примесь белка определяли отношением А260: А280 (для идеального случая оно равно 2), примесь полисахаридов — отношением А260: А230. Для идеального случая оно равно 2 и больше (Гофман, 1971; Мусил и др., 1981). Концентрацию ДНК в растворе принимали равной 37 мг/мл на одну единицу оптической плотности при А = 260 нм (Гофман, 1971; Мусил и др., 1981). Все оптические измерения проводили в водных растворах на спектрофотометре СФ-24.
Выход ДНК в процентах к массе молок определяли по формуле
X _ ^ хкх37ХЮ-6 ху ш% , т
где А260 — оптическая плотность при длине волны 260 нм; К — коэффициент разведения; 37х10-6 — содержание ДНК при А260 = 1, г/мл; V — объем раствора, мл; т — масса молок, г.
С целью ферментативного расщепления ДНК и получения 5'-мононуклеоти-дов была исследована возможность использования ферментного препарата из печени минтая, с удельной активностью в пределах 0,001-0,005 мг-1. Удельную активность вычисляли по формуле
А _ А400 Х Ур
у _ 17,6хУфхТхК ,
где Ау — удельная активность, мг-1; А400 — оптическая плотность при длине волны 400 нм; Vp — конечный реакционный объем, мл; 17,6 — коэффициент молярной инкстинции; Vф — объем ферментативного препарата, мл; Т — время инкубации, мин; К — концентрация белка, мг/мл.
Для контроля качественного состава продуктов ферментативного гидролиза использовали тонкослойную хроматографию на силуфоле в системе диоксан—изопропанол—вода—аммиак в соотношении 4: 2: 2: 1 (Березкин, Бочков, 1980).
ДНК обладает выраженными кислыми свойствами, обусловленными остатками ортофосфорной кислоты в ее составе, и при физиологических значениях рН несет отрицательный заряд. Этим объясняется одно из важнейших ее свойств — способность к взаимодействию по типу ионной связи с основными белками, ионами металлов и другими. Поэтому для выделения ДНК из комплексов с белками необходимо разрушить эти сильные и многочисленные электростатические связи — между положительно заряженными молекулами белков и отрицательно заряженными молекулами нуклеиновых кислот.
Учитывая это, для разрушения белково-нуклеинового комплекса был выбран щелочной гидролиз. Дополнительным аргументом в пользу щелочного гидролиза послужило то, что белково-нуклеиновые комплексы представлены преимущественно протаминами, которые хорошо растворяются в щелочи и не осаждаются этанолом из раствора, в отличие от ДНК.
Для получения ДНК мороженые молоки лососевых рыб 3-й стадии зрелости дефростировали при комнатной температуре, после чего промывали в пресной проточной воде, затем гомогенизировали на микроизмельчителе тканей МPW-324 в воде до получения мелкодисперсного коллоидного раствора. Полученный гомогенат разбавляли водой до содержания измельченных молок 1-15 % к мас-
се. Приготовление гомогената молок содержанием свыше 15 % нецелесообразно, так как в дальнейшем при добавлении щелочи происходит увеличение вязкости раствора на первом этапе гидролиза. Это вызывает значительные трудности, связанные с необходимостью применения мощных перемешивающих устройств. Кроме того, при последующем добавлении щелочи к концентрированным растворам не исключено образование локальных зон в растворе: в одних зонах будет наблюдаться переизбыток щелочи, ведущий к разрушению дезокси-рибонуклеиновой кислоты до нуклеозидов, а в других — полное ее отсутствие и, следовательно, невозможность протекания гидролиза.
К гомогенату молок добавляли №ОН до содержания 4 % в массе раствора. Раствор делили на 4 части: первая гидролизовалась при температуре 4 0С в течение 48 ч; вторая при температуре 60 0С в течение 2 ч; третья при комнатной температуре в течение 48 ч; четвертая при температуре 4 0С в течение 48 ч.
После окончания гидролиза к каждой пробе добавлялось два объема этанола для осаждения дезоксирибонуклеиновой кислоты из раствора. Осажденную ДНК выделяли центрифугированием при частоте вращения 3500 с-1 в течение 15 мин. Затем ДНК собирали и промывали этанолом до нейтральной реакции.
Результаты спектрального анализа четырех экспериментальных образцов ДНК из молок лососевых рыб приведены на рисунке. Измерения сняты при одинаковом коэффициенте разведения.
1
220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 275 280 290
Длина волны, нм
Результаты спектрального анализа экспериментальных образцов гидролиза-та молок: 1-4 — номера образцов
Results of spectral analysis of experimental samples salmon milts: 1-4 — number of samples
При анализе полученных спектров извлеченных образцов ДНК на наличие примесей белков и полисахаридов установлено следующее:
— отношение Л260: Л280 (примесь белков) для первой пробы составило 1,82, для второй — 1,59, для третьей — 1,86, для четвертой — 1,92;
— отношение Л260: Л230 (примесь полисахаридов) для первой пробы составило 2,37, для второй — 0,81, для третьей — 2,16, для четвертой — 2,4.
Содержание ДНК (выход к массе молок) составило для первой пробы 4,01 %, для второй — 1,26, для третьей — 4,44, для четвертой — 2,41 %. Полное содержание ДНК в молоках данной партии, определенное спектрофотометричес-ки после гидролиза с хлорной кислотой, составило 4,99 %.
Полученные результаты измерений и расчетов позволяют выделить по совокупности всех факторов первую и третью пробы. Эти пробы при хорошем выходе ДНК (соответственно 4,01 и 4,44 %) значительно превосходят вторую пробу по наличию примесей полисахаридов (2,37 и 2,16 против 0,81) и ненамного уступают четвертой пробе по этим показателям, но превосходят ее по выходу ДНК к массе молок (4,01 и 4,44 против 2,41).
При окончательном выборе режима гидролиза в качестве критерия использовали скорость растворения ДНК в воде. Этот критерий определяет конечную стадию получения 5'-мононуклеотидов — ферментативный гидролиз. Скорость растворения ДНК определяли следующим образом: равное количество ДНК каждой пробы растворяли в одинаковом количестве воды и ставили на магнитные мешалки. Таким образом, если принять скорость растворения третьей пробы за единицу, а скорость растворения других проб выразить в долях единицы, то получим следующие результаты: первая проба — 0,8, вторая — 0,1, третья — 1,0, четвертая — 0,85.
Данные проведенного эксперимента позволяют выбрать для промышленного способа получения ДНК режим, аналогичный режиму третьей пробы, т.е. гомо-генат, содержащий 1-15 % измельченных молок и 85- 99% воды; концентрация щелочи 4 %; время гидролиза 48 ч при температуре 20-25 0С; осаждение 1,52,0 объема этанола с последующим центрифугированием. Полученную Д НК можно высушивать до содержания влаги 10-12 % или хранить в растворе. Хранение ДНК в растворе упрощает ее дальнейшее использование, так как исключается операция сушки, а в дальнейшем и растворения.
При указанных условиях был реализован эксперимент по гидролизу молок дальневосточных лососевых 4-й стадии зрелости; выход ДНК в данном случае составил 8,8-9,0 % при общем содержании ДНК в молоках 9,5-9,7 %. Это позволяет с целью повышения эффективности процесса рекомендовать для производства использование молок дальневосточных лососевых последней стадии зрелости.
Конечная стадия получения 5'-мононуклеотидов — ферментативный гидролиз. В качестве источника ферментов был использован амилорезин из плесневого гриба Aspergillus oryzae. Амилорезин представляет собой комплекс амило-литических ферментов, в котором присутствует специфический фермент, проявляющий нуклеазную активность как в отношении РНК, так и ДНК — нуклеаза S1. Это обстоятельство является несомненным преимуществом, так как позволяет получать 5'-мононуклеотиды из ДНК и РНК.
Для иммобилизации ферментного комплекса амилорезина был проведен эксперимент по прикреплению его на полимерную матрицу, в качестве которой использовался крилевый хитозан, активированный глутаровым альдегидом. К хитозану добавляли раствор ферментов и перемешивали на магнитной мешалке до тех пор, пока в жидкой фазе не исчезала активность фосфодиэстеразы 1-го типа — это происходило примерно через два часа. Глутаровый альдегид в данном случае играет роль химического мостика, так как своей первой альдегидной группой соединяется с аминогруппой хитозана, второй альдегидной группой — с аминогруппами ферментов, образуя ковалентные связи хитозан — глутаровый альдегид — фермент.
Хитозаном с иммобилизованным на нем ферментом заполняли стеклянную колонку с водяной рубашкой, которая соединялась с термостатом, позволяющим поддерживать постоянную температуру 37 0С. Через колонку с помощью перистальтического насоса циркулировал буферный раствор ДНК, содержащий ионы щелочноземельных металлов в концентрации 0,01 М. Получаемые 5'-мононуклеотиды после реакции ферментативного разложения содержатся в растворе в незначительной концентрации, величина которой зависит от начальной концентрации ДНК в приготовленном субстрате и полноты ферментативного гидролиза. С целью концентрирования растворов 5'-мононуклеоти-дов использовали вакуум-выпаривание при температуре 37 0С на роторном вакуумном испарителе, что позволяет достичь 90-95 %-ной концентрации 5'-моно-нуклеотидов в растворе.
На основании результатов исследований разработана технология получения 5'-мононуклеотидов, включающая следующие этапы: измельчение и гидролиз
молок, осаждение ДНК, промывание ДНК, концентрирование раствора ДНК, фер-ментолиз ДНК, концентрирование раствора 5'-мононуклеотидов и т.д.
В соответствии с разработанной технологией из молок дальневосточных лососевых изготовлена опытная партия 5'-мононуклеотидов, которую использовали в качестве интенсификатора вкуса пресервов, консервов, вкусовой крабовой добавки (ВКД), а также для обработки хитозана.
Органолептическая оценка экспериментальных образцов пресервов в масле из несозревающего сырья — трески — показала возможность и перспективность использования разработанного интенсификатора вкуса для получения приемлемого продукта. Установлено, что интенсификатор вкуса целесообразно вносить в пресервы в виде раствора вместе с другими компонентами. Рациональная дозировка интенсификатора вкуса составляла 0,05-0,10 г на 100 г рыбы.
Внесение разработанного интенсификатора в консервы из минтая приводит к заметному улучшению органолептических характеристик продукта. Наибольший эффект от введения интенсификатора вкуса наблюдается при комплексном использовании 5'-мононуклеотидов совместно с глутаминатом натрия. Это обеспечивает сбалансированность всех вкусовых оттенков, а также появление новых вкусовых качеств, свойственных продуктам животного происхождения — куриному бульону. Установлено также положительное влияние смеси интенси-фикаторов на цвет бульона в консервах.
Использование разработанного интенсификатора вкуса при изготовлении ВКД в количестве 0,05 % к ее массе обеспечивает продукту характерный крабовый, сладкосоленый, гармоничный вкус хорошей интенсивности. При дозировке 5'-мононуклеотидов менее 0,02 % интенсификация вкуса ВКД проявляется слабо, так как такое содержание близко к пороговому ощущению 5'-мононукле-отидов. В то же время даже в такой концентрации 5'-мононуклеотидов эффект ретуширования неприятных оттенков вкуса, таких как аммиачный, гнилостный, щиплющий, туковый, был заметен.
Экспериментальные исследования показали, что 5'-мононуклеотиды снижают интенсивность вяжущего вкуса раствора хитозана примерно в 1,8-2,0 раза, но не устраняют его полностью. Оптимальная концентрация 5'-мононуклеоти-дов в майонезах на основе хитозана должна быть в пределах 0,025-0,010 % к массе продукта. Добавление 5'-мононуклеотидов в продукт целесообразно проводить без предварительной их термической обработки.
Таким образом, комплекс проведенных экспериментов позволил обосновать технологию получения интенсификатора вкуса, включающую щелочной гидролиз молок лососевых рыб 3-4-й стадии зрелости с последующей обработкой иммобилизованным ферментным комплексом амилорезина из плесневого гриба Aspergillus oryzae.
Экспериментально доказана целесообразность использования предлагаемого интенсификатора вкуса для изготовления пресервов из трески, консервов из минтая, а также для улучшения органолептических характеристик вкусовой крабовой добавки и хитозана.
Литература
Березкин В.Г., Бочков А.С. Количественная тонкослойная хроматография. — М.: Наука, 1980 — 236 с.
Гофман Э. Динамическая биохимия: Пер. с нем. — М.: Медицина, 1971. — 187 с.
Зейдана А.А. Практика разработки и внедрение технологий получения препаратов нуклеаз // Тез. докл. Всесоюз. итог. конф. "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование". — Рига, 1985. — С. 77.
Микельсон А. Химия нуклеотидов и нуклеозидов: Пер. с англ. — М.: Мир, 1966. — 113 с.
Мусил Я., Новикова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах: Пер. с англ. — М.: Мир, 1981. — 216 с.
Сафронова Т.М., Патрышев С.М., Мамедова Т.Д. Влияние нуклеотидов на вкус модельных рыбных продуктов // Изв. вузов. Пищ. технология — 1992. — № 1. — С. 14-16.
Тривен М. Иммобилизованные ферменты: Пер. с англ. — М.: Мир, 1983. — 213 с.
McCormick R.D. The role flavor potentiators in future fabricated foods // Prep. Foods. — 1986. — March. — P. 159.
Поступила в редакцию 21.06.03 г.
