CC BY
356
УДК 615.454.1.014.47.015:616.314.17-008.1-092.9
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ И ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ СТОМАТОЛОГИЧЕСКОГО ГЕЛЯ НА ОСНОВЕ ГЛЮКОЗАМИНА С СОКАМИ КРАПИВЫ И КАЛАНХОЭ
© Ващенко Е.С., Кулешова С.А., Компанцева Е.В., Компанцев Д.В., Маринина Т.Ф.
Кафедра аналитической химии Пятигорской государственной фармацевтической академии, Пятигорск,
Ставропольский край
E-mail: vaschenko_elena@mail.ru
Разработана технология мягкой лекарственной формы - геля на гидрофильной основе для лечения и профилактики пародонтита, в состав которого входит глюкозамина гидрохлорид, крапивы сок, каланхоэ сок с использованием стабилизаторов и консервантов. С помощью методики "фетровой гранулемы" на крысах проведены исследования противовоспалительной активности геля стоматологического и установлено, что исследуемый гель оказывает противовоспалительное действие: уменьшает отек и ускоряет процесс регенерации, что может служить основанием для применения его в качестве средства для лечения пародонтита.
Ключевые слова: пародонтит, глюкозамина гидрохлорид, сок крапивы, сок каланхоэ, "фетровая гранулема", гель стоматологический.
DEVELOPMENT OF TECHNOLOGY AND STUDYING ANTI-INFLAMMATORY ACTIONS OF STOMATOLOGIC GEL ON THE BASIS OF GLYCOZAMINE WITH STINGING NETTLE AND KALAN-
HOE SAPS
Vaschenko E.S., Kuleshova S.A., Kompantseva E.V., Kompantsev D.V., Marinina T.F.
Analytical Chemistry Department of the Pyatigorsk State Pharmaceutical Academy, Pyatigorsk, Stavropol Region
Development of the technology and study of anti-inflammatory effect of stomatological gel on the basis of gly-cosamine with nettle and kalanchoe saps. The technology of a soft dosage form was developed - a gel for treatment and prophylaxis of periodontitis on the hydrophilous basis, which contains glycosamine hydrochloride, nettle and kalanchoe saps, stabilizers and preserving agents. By means of the "felt granule" technique the investigations of anti-inflammatory activity of the stomatologic gel has been conducted in rats and it has been established that the investigated gel has anti-inflammatory effect and accelerates regeneration process that can form the ground for its application as a medicine for curing paradontitis.
Key words: paradontitis, glycozamine hydrochloride, nettle and kalanchoe saps, "felt granule", stomatological gel.________________________________________________________________________________________________
Одним из самых распространенных стоматологических заболеваний на сегодняшний день является пародонтит.
В настоящее время в стоматологии для лечения пародонта применяется широкий спектр препаратов как растительного, так и синтетического происхождения: Мараславин, Полиминерол, Тыквеол, Метрогил дента, Стоматидин, Калгель, шалфей, настойка календулы, настойка эвкалипта, Ромазулон [6].
Актуальной задачей для специалистов является создание новых высокоэффективных природных противопародонтозных средств,
оказывающих комплексное воздействие на пораженные ткани пародонта.
Среди средств растительного происхождения в стоматологии чаще всего используются препараты листьев крапивы, каланхоэ, корни кровохлебки, кора дуба, трава тысячелистника и др. [2].
Препараты крапивы назначаются внутрь и наружно при различных заболеваниях полости рта в качестве кровоостанавливающих, поливитаминных, стимулирующих грануляцию и эпителизацию средств. Листья крапивы двудомной содержат каротиноиды, хлорофилл, дубильные вещества, органические
кислоты. Наряду с этим в надземной части растения обнаружены эфирное масло, сито-стерин, фенолкарбоновые кислоты (галловая, кумаровая, кофейная, феруловая), порфири-ны, флавоноиды, витамины С, Bi, Bi2, К, Е, РР, пантотеновая кислота, гликозид ургицин, богатый комплекс микроэлементов [2].
Сок каланхоэ обладает антисептическим и противовоспалительным действием. В стоматологической практике сок каланхоэ назначают для лечения пародонтоза, особенно остро развившейся его стадии, для прекращения выделений из десневых карманов, а также для лечения хронического рецидивирующего афтозного стоматита и гингивита [3].
В соке каланхоэ содержатся флавоноиды, органические кислоты (яблочная, уксусная, лимонная), дубильные вещества, полисахариды, ферменты, витамин С, микро- и макроэлементы - алюминий, железо, магний, кальций, медь, кремний и марганец [3].
Важную роль в защитной функции эпителия десны, особенно в отношении проникновения инфекций и токсинов в подлежащую ткань, играют глюкозаминогликаны, находящиеся в составе склеивающего вещества между клетками многослойного плоского эпителия. Имеются бесспорные данные, свидетельствующие о значительной роли гиалу-роновой кислоты в регуляции капиллярносоединительных структур и о том, что глюко-заминогликаны обеспечивают защиту тканей пародонта от бактериальных и токсических агентов.
Глюкозамина гидрохлорид оказывает противовоспалительное и слабое обезболивающее действие, является источником синтеза глюкозаминогликанов, необходимых для восстановления поврежденной костной структуры. Вероятным механизмом репара-тивного действия глюкозамина является стимулирование синтеза гликозаминогликанов и коллагена [5].
На наш взгляд, использование глюкоза-мина (основного структурного фрагмента глюкозаминогликанов и гиалуроновой кислоты) будет способствовать восстановлению пораженного пародонта.
Димексид (диметилсульфоксид - ДМСО) является антисептическим препаратом, обладающим противовоспалительным и антимикробным действием, вместе с растворенными в
нем веществами хорошо проникает через кожу и слизистые без повреждения последних, действуя как фактор, усиливающий проникновение лекарственных веществ через эпителиальные барьеры [7].
Таким образом, сок крапивы двудомной был выбран как кровоостанавливающее средство, сок каланхоэ - как репаративное средство, глюкозамина гидрохлорид - как противовоспалительное, репаративное и слабое обезболивающее средство, димексид использовали как проводник и слабый антисептик [3].
В процессе разработки мягких лекарственных форм для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний пародонта особое внимание следует уделять выбору оптимальной основы, которая бы обладала способностью высвобождать активные компоненты (глюкозамин и биологически активные вещества соков крапивы и каланхоэ), а также необходимыми структурно-механическими свойствами и стабильностью [9]. Предпочтение отдали гидрофильным основам, так как они улучшают и обеспечивают равномерное распределение, способствуют проявлению терапевтического эффекта действующих веществ [9].
Целью настоящего исследования является разработка технологии и изучение противовоспалительной активности геля стоматологического, в состав которого в качестве основного действующего компонента входят глюкозамина гидрохлорид, обладающий противовоспалительной активностью, а также способностью регенерировать соединительнотканные структуры, и растительные компоненты - сок крапивы двудомной и сок каланхоэ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Технологическая экспериментальная часть
Для изготовления стоматологического геля использовали глюкозамина гидрохлорид, отвечающий требованиям ФСП 42-03141478-01 "Глюкозамина гидрохлорид", и сок каланхоэ, соответствующий требованиям ФС "Сок каланхоэ" 42-3727-99.
Сок крапивы получали из сырья - листьев крапивы двудомной (Urtica dioica L.) семейства Крапивные (Urticaceae). Сырье заготавливалось в Ставропольском крае (май 2008 г.). Свежие листья молодой крапивы измельчали и отжимом выдавливали сок. Полученный сок выдерживали 15-20 минут на водяной бане при 40-60°С для инактивации содержащихся в соке ферментов. После охлаждения выделившийся осадок отфильтровывали, а в сок добавляли 20% этилового спирта. Полученный сок представлял собой прозрачную жидкость темно-коричневого цвета.
Для приготовления гелей были использованы основы: натрий - карбоксиметилцелю-лоза (№КМЦ), метилцелюлоза (МЦ), поли-этиленоксид 400 (ПЭО 400) и полиэтиленок-сид 4000 (ПЭО 4000)
Технология геля на основе полиэтиленок-сидов заключается в следующем: полиэтиле-ноксид 4000 (ПЭО 4000) и полиэтиленоксид 400 (ПЭО 400) сплавляли в выпарительной чашке, необходимый объем воды смешивали с глицерином. В этой смеси растворяли глю-козамина гидрохлорид, затем частями в раствор вводили сплав ПЭО при постоянном перемешивании.
№КМЦ заливали частью горячей воды, в которой предварительно был растворен глю-козамина гидрохлорид, затем добавляли холодную воду до необходимого объема. Полученную массу оставляли в холодильнике на 40 минут до полного растворения, а затем полученный гель смешивали в ступке с глицерином. По аналогичной схеме готовили гель на основе МЦ. Гели на выбранных основах были приготовлены с учетом всех технологических особенностей.
Глюкозамина гидрохлорид вводили в состав гелей в концентрации 10%. Эта концентрация по результатам ранее проведенных исследований является наиболее эффективной.
Оценку способности гелевых основ высвобождать действующее вещество проводи-
Состав № 1 Сок крапивы 10%
Сок каланхоэ 10% Глюкозамина гидрохлорид 10,0 Диметилсульфоксид 3,0 Основа гелевая до 100,0
ли методом диффузии в агаровый гель. В качестве индикатора использовали нингидрин. Для приготовления агарового геля отвешивали 38,5 г агара, который заливали 1 литром воды. Полученную смесь кипятили в течение
3 минут, фильтровали и стерилизовали в автоклаве при 121°С в течение 15 минут. Затем охлаждали до 45-50°С, добавляли в полученный гель 10 г сухого нингидрина, тщательно перемешивали, разливали по чашкам Петри слоем 1 см и оставляли подсыхать при комнатной температуре на 40-60 минут. В застывшем гелевом слое каждой чашки делали по 6 отверстий диаметром 1,5 см, в которые закладывали по 1 г геля. По величине зон окрашивания судили о степени диффузии лекарственного вещества из геля.
Методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану была изучена степень высвобождения глюкозамина гидрохлорида.
Диализ осуществляли из 4 г геля с содержанием в данной массе соли глюкозамина
0,2 г. Навеска геля равномерно распределялась по поверхности полупроницаемой мембраны, которой был закрыт один конец диализной трубки. Отбор проб проводили в объеме 5 мл пипеткой через 60, 120, 180 минут с восполнением диализной среды. В качестве диализной среды брали воду очищенную. Диализ проводили при температуре 20°С± 1°С.
Глюкозамина гидрохлорид определяли в диализате титриметрическим способом по связанной хлористоводородной кислоте, используя в качестве титранта раствор нитрата ртути (II) (0,01 моль/л) и в качестве индикатора - дифенилкарбазид [5].
По полученным данным был построен график высвобождения глюкозамина гидрохлорида (в %) из гелей на различных основах.
Для изучения противовоспалительной активности геля стоматологического были приготовлены следующие составы:
Состав № 2 Сок крапивы 10%
Сок каланхоэ 10% Диметилсульфоксид 3,0 Основа гелевая до 100,0
В качестве основы использовали сплав полиэтиленоксидов ПЭО-400 и ПЭО-4000 40% и 20% соответственно в смеси с глицерином.
Фармакологическая экспериментальная часть
Противовоспалительную активность стоматологических гелей оценивали по их влиянию на экссудативный и пролиферативный компонент воспаления.
Опыты проводили на белых беспородных крысах обоего пола. Для исследования использовали здоровых половозрелых животных, прошедших карантин 14 дней. Животные содержались на стандартном рационе, соответствующем действующим нормам. Кормление проводили в фиксированное время. Для питья лабораторных животных использовали автопоилки. В эксперименте использовали животных одной возрастной группы (6 месяцев).
Методом случайной выборки нами были взяты 40 животных обоего пола, из которых были сформированы 5 групп по 8 животных в каждой:
1 группа - животные, которым создавали модель воспаления и для лечения использовали состав № 1;
2 группа - животные, которым создавали модель воспаления и для лечения использовали состав № 2;
3 группа - животные, которым создавали модель воспаления и для лечения использовали препарат сравнения мазь метилурацило-вую 10%;
4 группа - животные, которым создавали модель воспаления и для лечения использовали препарат сравнения мазь календулы;
5 группа - животные, которым создавали модель воспаления, но лечение не проводили.
Для оценки способности объектов исследования оказывать влияние на процессы заживления использовали методику создания пролиферативного воспаления, в котором ярко демонстрируются фазы экссудации и пролиферации.
У крыс массой 200,0+50,0 г тщательно выстригали шерсть в области спины, а затем через разрез в коже и подкожной клетчатке формировали полость, в которую имплантировали предварительно простерилизованный ватный шарик массой 15 мг, после чего на
рану накладывали 2 шва. Операция проводилась под наркозом (хлоралгидрат - в дозе 300 мг/кг), в асептических условиях [8]. Гель наносили ежедневно на область раны и шарика в течение недели. На восьмые сутки эксперимента после операции ватные шарики с образовавшимися вокруг них грануляционными тканями извлекали, взвешивали на торсионных весах и высушивали до постоянной массы при 55-60ОС. Пролиферативную активность оценивали по разнице между массой высушенной гранулёмы и исходной массой ватного шарика. Разницу в весе гранулёмы до и после высушивания использовали как критерий противоотечного действия исследуемых объектов.
Для изучения фармакологической активности проведена сравнительная оценка геля, в состав которого входят глюкозамина гидрохлорид, соки крапивы и каланхоэ, и геля, полученного на основе соков крапивы и каланхоэ без глюкозамина, в сравнении с мазью метилурацила и мазью календулы.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась, согласно ГФ XI. Для обработки результатов экспериментов использовали статистические методы с нахождением средней арифметической (М), средней ошибки средней арифметической (m) и вероятности ошибки по таблицам Стьюден-та. Достоверность полученных результатов между группами в сравнительном аспекте оценивали по критерию Стьюдента (t) [1].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Используя результаты, полученные методом проникновения в агар, был построен график зависимости высвобождения глюко-замина гидрохлорида из различных основ от времени наблюдения (рис. 1). Измерения диаметра зоны окрашивания агарового слоя проводилось в течение суток (24 часа).
Оказалось, что наибольшее высвобождение глюкозамина наблюдалось через 20 часов из основы сплава ПЭО-400 и ПЭО -4000.
Гели на основе МЦ и №КМЦ проявляли наименьшую осмотическую активность, так как максимальное высвобождение наступало только через З часа, а площадь окрашивания
Рис. 1. Влияние составов гелевой основы на ровый слой.
при этом была светло - фиолетового цвета по периферии лунки с исследуемым составом.
Критерием оценки равновесного диализа была избрана степень высвобождения глюко-замина гидрохлорида из изучаемых гелевых основ через полупроницаемую мембрану (рис. 2).
Анализ результатов степени высвобождения через полупроницаемую мембрану также подтвердил, что оптимальной основой для создания геля является сплав ПЭО 400 и ПЭО 4000.
Для предотвращения высыхания основы нами был использован глицерин в количестве 10%.
В связи с тем что в качестве основы были выбраны гидрофильные вещества, водные растворы которых могут подвергаться контаминации, нами в качестве консервантов предлагается использовать нипагин, нипазол (0,2%). Ввиду того что водные растворы глю-козамина гидрохлорида нестабильны, в качестве стабилизатора использовали метабисульфит натрия и сульфит натрия в количествах 2% и 1% соответственно [9].
Полученный гель представляет собой мягкую лекарственную форму, светлокоричневого цвета, которая легко намазывается на кожные покровы, тает и впитывается при температуре тела.
Результаты исследования (табл.) свидетельствуют, что гель, содержащий глюкозамина гидрохлорид 10%, сок крапивы двудом-
проникновение глюкозамина гидрохлорида в ага-
ной и сок каланхоэ, достоверно снижает величину отека относительно контроля на ЗЗ%. Его антиэкссудативная активность достоверно не отличалась от действия мази метилура-цила и мази календулы. Величина отека при применении геля с соками крапивы и каланхоэ без глюкозамина составила 2З8,7± 25,56 мг, что на 11% выше результата контрольного опыта. Таким образом, на модели пролиферативного воспаления гель с соками крапивы и каланхоэ без глюкозамина не оказывал противоотечного действия.
Синтез грануляционной ткани на фоне геля с глюкозамина гидрохлоридом и соками крапивы и каланхоэ достоверно увеличивался на 5З% относительно контроля и на 74% в сравнении с мазью календулы, но не носил достоверных различий с действием мази ме-тилурацила (на 6%). Гель, содержащий только соки крапивы и каланхоэ, в отличие от геля с глюкозамина гидрохлоридом и соками, достоверно снижал (на 20%) скорость пролиферации гранулёмы. В сравнении с контролем и мазью метилурацила данный факт носил недостоверный характер.
При изучении противовоспалительного действия у животных через неделю визуально определяли состояние ран. Они были чистыми, быстро подсыхали и к восьмому дню, на их месте образовывался крепкий рубец, особенно в группах, получавших метилурацила мазь и гель с глюкозамина гидрохлоридом и соками крапивы и каланхоэ.
Рис. 2. Зависимость высвобождения глюкозамина гидрохлорида из гелей на различных основах от времени проведения диализа через полупроницаемую мембрану.
Таблица
Результаты изучения противоотечной и пролиферативной активности геля, содержащего глюкозамина гидрохлорид 10%, крапивы и каланхоэ соки
Исследуемый объект Вес гранулёмы, мг Экссудация, мг Пролиферация, мг
до высушивания после высушивания
Контроль 270,5±11,04 55,4±2,5З 215,1±5,З7 40,4±1,81
Метилурацила 10% мазь З75,5±17,64 7З,2±З,60 164,З±17,64х 58,2±З,60х
Календулы мазь 2З4,5±17,28 50,5±2,88 184,0±6,08х * З5,5±З,02
Гель с глюкозамина гидрохлоридом 10%, крапивы и каланхоэ соками 242,6±12,24 76,8±2,70 165,8±11,21х 61,8±2,70Лх
Гель с крапивы и каланхоэ соками 295,9±20,З4 64,З±4,14 2З8,7±25,56Ф 49,З±4,14ФЛ
Примечание: х - достоверно к контролю, р<0,05; * - достоверно к метилурацила 10% мази, р<0,05; Л - достоверно к календулы мази, р<0,05; Ф - достоверно к гелю, содержащему глюкозамина гидрохлорид 10%, крапивы двудомной и каланхоэ соки.
Проведенные исследования показали, что выбранная гидрофильная основа позволяет обеспечить достаточное высвобождение активных компонентов геля. В связи с этим стоматологический гель оказывает репара-тивный эффект, сопоставимый с мазью мети-лурацила 10%.
Введение глюкозамина гидрохлорида совместно с соками крапивы и каланхоэ в состав стоматологического геля способствовало
значительному увеличению противовоспалительного эффекта геля на основе только соков крапивы и каланхоэ в стадии пролиферации. Кроме того, показано, что использование глюкозамина в сочетании с соками крапивы и коланхоэ в значительной степени увеличивает противовоспалительное действие глюкозамина [4].
Таким образом, проведенные исследования показали, что гель, в состав которого
входят глюкозамина гидрохлорид, соки крапивы и каланхоэ, наиболее эффективно оказывает противовоспалительное действие на стадиях экссудации и пролиферации, чем гели в которых отсутствует глюкозамина гидрохлорид, и его активность сравнима с активностью мази метилурацила 10%. Показано, что противовоспалительная активность геля, содержащего только соки крапивы и каланхоэ, выше активности мази календулы на стадии пролиферации.
По результатам проведенных исследований можно сделать вывод, что наиболее оптимальным составом стоматологического геля является сочетание сплава ПЭО-400 и ПЭО-4000, димексида, глицерина, глюкоза-мина гидрохлорида и соков крапивы и каланхоэ с применением стабилизаторов (натрия сульфита и натрия метабисульфита) и консервантов (нипагин, нипазол).
В опытах на животных установлено, что гель, содержащий глюкозамина гидрохлорид 10%, крапивы сок 10% и каланхоэ сок 10%, оказывает противоотечное действие и ускоряет процесс регенерации, что может служить основанием для применения его в качестве средства для лечения пародонтита.
ЛИТЕРАТУРА
1. Государственная фармакопея СССР, XI изд. -Вып. 1. Общие методы анализа. МЗ СССР. -М.: Медицина, 1987. - 336 с.
2. Грохольский А.П. Лекарственные растения в стоматологической практике. - Киев: Здоровье, 1995. - 376 с.
3. Данилевский Н.Ф. Фитотерапия в стоматологии. - Киев: Здоровье, 1984. - 176 с.
4. Компанцев Д.В., Погорелый В.Е., Макарова Л.М., Компанцева Е.В. Экспериментальное исследование противовоспалительной активности композиций глюкозамина сульфата и пектина с органическими кислотами // Вестн. Волгоградского ГМУ. - 2007. - № 1 (прил.). -С.13-15.
5. Компанцева Е.В., Компанцев Д.В. Глюкоза-мин: использование в медицине и ветеринарии, методы анализа. - Пятигорск: ПятГФА, 2007. - 160 с.
6. Машковский М.Д. Лекарственные средства: в
2 т. - 14-е изд., перераб. и доп. - М.: Новая волна, 2001. - Т. 2. - 608 с.
7. Пат. 2275199 РФ, МПК A61 K47/34. Средство для лечения болезней суставов / С.Е. Васюков, Е.И. Нестерова, Т.Ю. Александрова и др. (РФ). - № 2005110016/15; Заявл. 2005.04.06; Опубл. 2006.04.27.
8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М., 2005. - 832 с.
9. Технология лекарственных форм: уч. В 2-х томах. Том 1. / Т.С. Кондратьва, Л.А. Иванова, Ю.И. Зеликсон и др., под ред. Т.С. Кондратьевой. - М.: Медицина, 1991. - 496 с.
10. Фисенко В.П. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: Ремедиум, 2000. - 999 с.
