CC BY
83
УДК 615.014.24
В. В. МАЛЯВИНА, С. А. ТОМИЛИНА, А. М. САМПИЕВ
разработка технологии фитофосфолипидов медицинского применения из побочных продуктов производства подсолнечного масла.
Сообщение 2. обогащение липидного комплекса
лецитиновой фракцией
Кафедра фармации Кубанского государственного медицинского университета
Терапевтический эффект от применения фосфолипидов (ФЛ) обусловлен в большинстве случаев наличием в их составе одного из представителей этой группы веществ - фосфатидилхолина (лецитина). В этой связи представлялось важным решить задачу по «обогащению» фосфатидилхо-лином (ФХ) липидного комплекса, полученного в статусе полупродукта на первом этапе исследований по разработке технологии фитофосфолипидов медицинского применения (сообщение 1). При этом целью данного исследования являлось увеличение доли ФХ в липидном комплексе не за счет добавления его извне, а путем дополнительных технологических операций над полученным ранее полупродуктом.
Материалы и методы исследования
В основу технологического решения по увеличению количественного содержания в липидном комплексе лецитиновой фракции было положено различие в растворимости отдельных групп ФЛ в органических растворителях. Известно, что в этиловом и метиловом спиртах фосфатидилхолины, лизофосфатидил-холины (ЛФХ) и фосфатидные кислоты (ФК) хорошо растворимы, фосфатидилэтаноламины (ФЭА) мало растворимы, фосфатидилсерины (ФС) практически не растворимы. Указанное различие в растворимости позволяло спрогнозировать более высокое перераспределение лецитиновой фракции из полупродукта (липидного комплекса) в получаемый спир-товый экстракт и, соответственно, увеличение в последнем доли ФХ («технологическое обогащение») относительно других представителей ФЛ. Из двух упомянутых растворителей с учетом экологической, производственной приемлемости, низкой токсичности (3-й класс в соответствии с ОФС 42-0004-01 «Остаточные органические растворители») для целей экстракции больше соответствовал спирт этиловый. Кроме того, с технологической точки зрения этанол как экстрагент приветствовался бы производителем разрабатываемого ФЛ-препарата, поскольку соблюдался бы рациональный принцип использования в производственном цикле однотипного растворителя (липидный комплекс был получен разрушением фос-фатидной эмульсии именно этанолом).
Использование спирта для обогащения продукта лецитиновой фракцией позволяло решать и другую задачу: максимальное снижение в нем содержания неполярных липидов (масла). Растворимость подсолнеч-
ного и других, кроме касторового, растительных масел в этаноле достаточно низкая и при температуре 30° С составляет не более 5%.
Необходимо отметить, что процесс извлечения спиртом ФЛ из липидного комплекса не может быть однозначно отнесен к классическому варианту экстракции в системе «жидкость - жидкость» или «твердое тело - жидкость», поскольку полученный на предшествовавшем этапе исследования полупродукт представлял собой густую массу мазеобразной консистенции (что, кстати, в отличие от субстанций ФЛ в виде порошка предполагает наличие у него сохраненных нативных биосвойств). Скорее всего, такую систему можно отнести к состоянию «псевдожидкость - жидкость».
Высокая вязкость липидного комплекса приводила к образованию в системе «липидный комплекс: этанол» таких ламелярных потоков, при которых слои жидкости «скользили» относительно друг друга не перемешиваясь. Это обстоятельство в совокупности со склонностью фосфолипидов образовывать ассоциаты затрудняло «доступ» экстрагента к спирторастворимым группам ФЛ, в т. ч. лецитиновой.
Интенсификацию процесса «псевдожидкость - жидкостная экстракция» проводили с учетом того, что липидный комплекс из состояния густой, вязкой массы переходил в более текучее при повышении температуры. В этой связи использовали следующий технологический прием: процесс осуществляли при температуре 70° С (более высокие значения могли привести к деструкции молекул ФЛ) и активном перемешивании в течение 15 минут. Активное перемешивание преследовало цель максимального снижения времени на достижение гомогенности системы и, как следствие, времени термообработки. При указанных условиях происходили макроскопическое перемешивание соседних слоев экстракционной системы и активация молекулярной диффузии, приводящие к поперечному перемещению компонентов в слоях и между слоями жидкости. Экспериментально было установлено, что эти параметры достаточны для достижения оптимальной площади контакта фаз. Однако при указанном выше значении температуры понижалась селективность спирта как экстрагента по отношению к ФХ-фракции и увеличивалась растворимость нежелательных для целевого продукта (фосфолипидного препарата) компонентов липидного комплекса, в частности, масла подсолнечного
Выход суммы всех липидов из полупродукта в спиртовые экстракты, %
Время седиментационного разделения, мин. Соотношение «липидный комплекс:этанол»
1:3 1:6 1:9
Температура седиментационного разделения 40 °С
30 42,2 63,1 70,8
60 39,8 57,5 66,2
90 39,4 54,4 62,9
120 35,8 51,1 62,2
Температура седиментационного разделения 20 °С
30 24,8 56,4 61,2
60 20,3 51,2 56,4
90 19,2 47,2 52,7
120 18,5 45,3 49,6
Температура седиментационного разделения 0 °С
30 23,5 51,9 58,1
60 23,5 41,3 51,3
90 22,4 37,6 47,5
120 19,3 34,0 42,2
(в 4-5 раз). Изменение коэффициента распределения в желательном направлении (повышение селективности) проводили путем изменения температуры сосуществования (отстаивания) двух фаз. Использование других приемов повышения селективности экстрагента (введение в систему дополнительных компонентов, повышающих растворимость целевых веществ и снижающих сопутствующих, и др.) оказалось малопригодным. Так, введение кислот даже в малых концентрациях вызывало частичный гидролиз эфирных связей ФЛ, а «обводнение» этанола с целью снижения перехода в извлечение неполярных липидов - к образованию слоя устойчивой эмульсии.
Поэтому последующую после перемешивания стадию разделения фаз при отстаивании осуществляли, варьируя температурой (40, 20 и 0 °С) и временем седиментации (30, 60, 90 и 120 мин.). Экспериментальные исследования проводили в термостатируемом лабораторном реакторе с перемешиванием обеих фаз с помощью двухлопастной мешалки с регулируемой скоростью вращения. Температурные режимы процесса задавали и контролировали с помощью двух термостатов. К факторам, влияющим на распределение компонентов данной системы, относили также соотношение «сырье:экстрагент». Для разработки технологии использовали образцы липидного комплекса одной серии в соотношении с этанолом 1:3, 1:6 и 1:9. Исходный липидный комплекс имел кислотное число 0,26, содержание масла - 30,2%, фосфоли-
пидов - 68,0%, влаги и летучих веществ - 4,1%, не растворимых в диэтиловом эфире веществ - 0,3%. Процесс экстракции оценивали по выходу (в % в пересчете на сухое вещество) суммы всех липидов из исходного полупродукта в экстракт, содержанию в последнем ФЛ и ФХ в %.
Содержание отдельных групп ФЛ и удельный вес неполярных липидов в экстрактах определяли с использованием методики ТСХ-анализа в сочетании с программными средствами визуализации данных. Для обработки данных использовали программу Sorbfil TLC Videodensitometer как более информативную и позволяющую не только идентифицировать ФЛ по величине Rf, но и одновременно проводить расчеты по содержанию отдельных групп ФЛ [4]. Хроматографирование образцов экстрактов проводили без дополнительной предподготовки анализируемых проб в системе полярных растворителей «хлороформ - метанол - вода» (65:25:4). Проявленные ТСХ-пластины сканировали, данные графических файлов подвергали обработке программой Sorbfil Videodensitometer. При этом расчет пятен в треках (дорожках) на видеоизображениях пластин ТСХ проводился с построением аналоговых кривых (хроматограмм) по отклонению яркости треков от яркости фона пластин. Пример хроматограммы образца экстракта, полученного при соотношении фаз «липидный комплекс:этанол» - 1:6, температуре седиментации 20° С и времени седиментационного разделения 120 мин., представлен на рисунке. На вкладке (таблица
Содержание фосфолипидов в полученных спиртовых экстрактах, %
Время седиментационного разделения, мин. Соотношение «липидный комплекс:этанол»
1:3 1:6 1:9
Температура седиментационного разделения 40° C
зо 56,2 73,8 75,9
бо 56,6 73,3 75,9
90 56,4 73,9 76,2
120 56,7 73,7 76,9
Температура седиментационного разделения 20° C
зо 33,8 70,7 70,3
бо 35,5 70,9 70,4
90 35,9 73,8 71,3
120 35,9 74,0 72,1
Температура седиментационного разделения 0° C
зо 8,5 62,2 58,8
бо 8,4 59,1 57,7
90 8,5 56,7 57,1
120 8,3 56,4 55,8
над рисунком) приведены: Rf (отдельных групп ФЛ и неполярных липидов), площади пиков ^), отношение площади каждого пика к сумме площадей всех пиков в треке, выраженное в процентах (%S), высота пиков (Н), а также процент отношения высоты каждого пика к сумме высот всех пиков в треке (%Н). Аналогичным образом проводили анализ образцов всех полученных экстрактов. Результаты расчетов отношения площади пиков ФХ, других отдельных групп ФЛ, а также неполярных липидов (масла) к сумме площадей всех пиков в треке (%S) использовали для оценки их количественного содержания.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования по выходу суммы всех липидов из исходного полупродукта в экстракты и количественному содержанию в последних ФЛ представлены в таблицах 1 и 2 (средние значения пяти определений). В таблице 3 обобщены результаты оценки содержания ФХ в экстрактах.
Согласно результатам, представленным в таблице 1, в процессе изучения динамики разделения фаз и перераспределения общей суммы липидов выявлена четкая тенденция снижения содержания последних в «верхней» (целевой) фракции с течением времени (в среднем на 6-17%). Максимальный выход суммы липидов в экстракт наблюдался при соотношении «сырье:экстрагент» 1:6 и 1:9.
Вместе с тем адекватного (с суммой всех липидов) снижения количественного содержания ФЛ в экстракте с увеличением времени отстаивания
не наблюдалось (табл. 2). Более того, при температуре седиментации -20° С даже отмечался рост их удельного веса в среднем на 1-3%. Тем не менее максимум содержания ФЛ в экстракте приходился, как и в случае с суммой всех липидов, на соотношение фаз 1:6 и 1:9 и отстаивание фаз в течение 60-90 минут при температуре 20-40° С.
Парадоксально низкое значение содержания ФЛ получалось при соотношении фаз 1:3 и температуре седиментации 0° С (табл. 2). Вероятно, данное явление обусловлено тем, что ФЛ подсолнечного масла склонны к образованию ассоциатов при пониженных температурах, при которой наблюдаются уменьшение значения концентрации и образование ассоциированных молекул фосфолипидов [1, 2, 3].
Наибольшая селективность этанола (табл. 3) по отношению к ФХ достигалась при температуре седиментационного разделения 20° С и 0° С. Однако, как уже отмечалось выше, при температуре 0° С наблюдался наименьший удельный вес ФЛ в экстракте. При температуре 40° С растворитель становился практически неселективным по отношению к ФХ.
Данные анализа по составу экстрактов (табл. 2) и результаты хроматографии (рисунок) подтверждают высокую солюбилизирующую способность спирторастворимых фосфолипидов как по отношению к маслу, так и по отношению к другим, не растворимым в этаноле группам ФЛ. Сравнительный анализ группового состава ФЛ в экстракте и рафинате свидетельствовал о перегруппировке в сторону увеличения содержания групп
Трек № 3
Пик Rf L() S %S H %H Описание
1 0,08 10 544 0,8 973 2,0 ЛФХ
2 0,50 703 856 53,4 16 647 33,6 ФХ
3 0,68 139 718 10,2 8974 18,1 ФС
4 0,79 106 766 8,1 4863 9,8 ФЭА
5 0,84 17 135 1,3 1941 3,9 ФК
6 0,94 345 343 26,2 16 211 32,7 Масло
Сумма 1 318 102 49 609
Хроматограмма фитофосфолипидов. Программа Sorbfil TLC Videodensitometer
фосфатидилхолина, фосфатидилсерина и фосфа-тидилэтаноламина в экстракте. Максимальная концентрация ФХ в экстракте, которая была достигнута на данном этапе исследований, составила 55,8% (табл. 3), эффективность экстракции при этом находилась на уровне 45% (табл. 1).
Дальнейшие исследования были направлены на определение оптимального числа ступеней экстракции в системе с одним экстрагентом. Процесс представлял собой периодическую, многократно повторяемую, одноступенчатую экстракцию по установленным оптимальным условиям проведения: соотношение «исходное сырье (липидный комплекс):
этанол» - 1:6, температура и время экстракции - 70° С и 15 минут, седиментационного разделения - 20° С и 90 минут соответственно.
Результаты анализа экстракта после отдельных ступеней жидкостной экстракции свидетельствовали
о том, что проведение процесса более чем в две ступени представлялось нецелесообразным, поскольку при последующем контакте фаз наблюдалось снижение содержания суммы ФЛ. Кроме того, на третьей ступени снизилось и содержание фосфатидилхолина в общей сумме ФЛ получаемого экстракта, что не отвечало поставленной задаче по обогащению целевого продукта лецитиновой фракцией.
Содержание фосфатидилхолина в % к общей сумме фосфолипидов экстракта
Время седиментационного разделения, мин. Соотношение «липидный комплекс:этанол»
1:3 1:6 1:9
Температура седиментационного разделения 40° C
зо 29,6 30,9 31,4
бо 31,4 31,2 33,2
90 31,6 32,9 35,3
120 32,1 34,1 36,6
Температура седиментационного разделения 20° C
зо 48,9 47,8 48,6
бо 50,1 50,7 50,9
90 50,8 53,4 53,0
120 52,2 55,8 55,1
Температура седиментационного разделения 0° C
зо 52,1 42,1 45,3
бо 53,2 42,8 45,9
90 53,3 44,1 46,6
120 53,6 44,6 46,9
Таким образом, на основании комплекса проведенных экспериментально-теоретических исследований была разработана оптимальная технология фитофосфолипидов медицинского назначения, предусматривающая три основные стадии:
I стадия - получение в рамках производства подсолнечного масла фосфатидной эмульсии;
II стадия - получение полупродукта (липидного комплекса) путем разрушения фосфатидной эмульсии спиртом и отделения от спиртоводной фазы суммы ФЛ и нейтральных липидов в мягких температурных режимах. Щадящие температурные условия производства липидного комплекса позволяют сохранить от деструкции термолабильные соединения и значительно снизить степень окисленности продукта по сравнению с существующими способами выделения концентратов ФЛ в масложировой промышленности;
III стадия - получение целевого продукта - фитофосфолипидов медицинского применения, содержащего не менее 50% фосфатидилхолина от суммы ФЛ, посредством двухступенчатой экстракции этанолом полупродукта со II стадии и последующим удалением растворителя из экстракта.
Поступила 25.09.2007
ЛИТЕРАТУРА
1. АрутюнянН. С. Фосфолипиды растительных масел: состав, структура, свойства, применение и получение / Арутюнян Н. С., Корнена Е. П. М.: Агропромиздат, 1986. 256 с.
2. Биофизика / В. Ф. Антонов, А. М. Черныш, С. А. Вознесенский и др. М.: Владос, 2000. 287 с.
3 . Корнена Е. П., Арутюнян Н. С. Исследование в области количественного выведения фосфорсодержащих веществ // Тр. ВНИИЖ, 1980. С. 57-63.
4. Малявина В. В. Применение программных средств визуализации и обработки данных ТСХ-анализа при производстве фосфолипидных продуктов // Фармация. 2003. № 2. С. 26-30.
v. v. malyavina, s. a. tomilina, a. m. sampiev
THE DEVELOPMENT TO TECHNOLOGIES PHYTOPHOSPHOLIPIDS MEDICAL USING
FROM BY-PRODUCT SUNFLOWER BUTTER PRODUCTION MESSAGE2. INCREASING LIPIDS COMPLEX PHOSPHATIDYLCHOLINE FACTION
On the grounds of complex called on experimental-theoretical is-followings is designed optimum technology phytophospholipids, including three main stages:
I stage — a reception in industrial condition phospholipids to emulsions;
II stage — a reception of the semi-product - an lipids complex by destructions phospholipids
to emulsions in sparing warm-up condition, allowing keep from destruction thermovariability join and vastly reduce the degree oxidation product in contrast with existing way of the separation FL in fat of industry;
III stage — a reception of the target product - an phytophospholipids of the medical using, containing not
less 50% phosphatidylcholine from amount FL, in a way to two-stage extraction semi-product alcohol ethyl with II stage (the lipids complex) and the following removing the alcohol from extract.
Key words: phospholipids, phosphatidylcholine.
В. А. МИНКИН, Н. Н. НИКОЛАЕНКО
исследование зависимости психофизиологических характеристик человека от величины торможения вестибулярной системы методом виброизображения
Многопрофильное предприятие «Элсис», г. Санкт-Петербург
Великие ученые прошлого (Ч. Дарвин, И. М. Сеченов, К. Лоренц) декларировали неразрывную связь между движением и жизнью биологических объектов, в том числе между двигательной активностью и психофизиологическим состоянием. Тезис И. М. Сеченова «Каждая мысль имеет мускульное проявление» [4] наиболее наглядно устанавливает связь между процессом мышления и движением. Поддержание вертикального равновесия человека осуществляется вестибулярной системой и может быть рассмотрено как частный случай двигательной активности, причем динамика мускульного движения определяется процессами сенсорного торможения вестибулярной системы [5].
Метод виброизображения регистрирует микродвижения и пространственные колебания объекта путем определения параметров вибрации (частоты и амплитуды) для каждого элемента (пикселя) исследуемого объекта [2]. С помощью этого метода удалось установить, что параметры виброизображения отражают количество движения, а значит, характеризуют эмоции и физиологическое состояние организма человека [3].
Движения и микроколебания головы человека в пространстве, классически определяемые вестибулярной системой и сенсорной физиологией, изучаются и обсуждаются в сопоставлении с проявлением вестибулярных рефлексов (в том числе вестибулярно-окулярного и шейно-окулярного рефлекса) [6, 7, 8].
В данной статье предпринята попытка рассмотрения движения головы с точки зрения биохимических превращений и законов термодинамики при помощи технологии виброизображения. Мы предположили, что голова человека, находящаяся в равновесии и не совершающая «осознанных движений», может рассматриваться как квазирав-новесная термодинамическая система и определенная часть внутренней энергии, изменяющая равновесие этой квазизакрытой системы, расходуется на совершение движения в виде механичес-
ких колебаний (вибрации). Каждое эмоциональное состояние характеризуется неким расходом энергии, и работа, осуществляемая системой, преобразуется в микровибрации, если человек стоит или сидит без движения. Параметры вибрации головы (частота в диапазоне 0,1-10,0 Гц и амплитуда в пределах 10-1000 мкм [1]) для стабильного эмоционального состояния человека стабильны во времени. Параметры вибрации изменяются только после изменения эмоционального состояния. Известно, что оценка работы вестибулярной системы эффективно применяется для функциональной диагностики психофизиологических параметров и работоспособности человека. В ходе НИР «Создание системы дистанционного бесконтактного сканирования и идентификации психофизиологического состояния человека», проводимой в рамках федеральной целевой научно-технической программы по приоритетному направлению «Безопасность и противодействие терроризму», исследовалась возможность бесконтактной диагностики состояния вестибулярной системы с целью определения интегральных психофизиологических параметров человека и количественной оценки эмоционального состояния, прежде всего уровня агрессивности.
Методы исследования
Для регистрации виброизображения использовались стандартные видеосистемы, такие как вебкамера или цифровой камкодер, или аналоговая камера с оцифровщиком. Установленная разрешающая способность камеры составляла 640*480, причем качество виброизображения значительно зависело от шумовых характеристик камеры. Лучшие результаты по качеству виброизображения были получены с простой веб-камерой AVerCam и датчиком изображения 1/3 дюйма КМОП с разрядностью 8 бит (256 градаций серого). Аналогичные по качеству результаты были также получены с более современной веб-камерой 1/4 дюйма Genius Eye 311Q.
УДК 621.397
