Разработка технологического процесса получения бактериального концентрата lactobacillusreuteri Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

УДК / UDK 637.146.3.03

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА LACTOBACILLUS REUTERI

DEVELOPMENT OF THE TECHNOLOGICAL PROCESS OF LACTOBACILLUS REUTERI BACTERIAL CONCENTRATE PRODACTION

Семенихина В.Ф., научный сотрудник Semenikhina V.F., researcher Раскошная T.A., к.т.н., научный сотрудник Raskoshnaya T.A., researcher Рожкова И.В., к.т.н., научный сотрудник Rozhkova I.V., researcher Бегунова А.В., научный сотрудник

Begunova A.V., researcher Ширшова Т.И., научный сотрудник Shirshova T.I., researcher Федеральное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» (ФГБНУ

«ВНИМИ»)

Federal State Budget Institution "All-Russian Dairy Research Institute (FGBNU

"VNIMI") E-mail: [email protected]

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА

пробиотический штамм, Lactobacillus reuteri, ферменты, Alcalase, Neutrase, Protamex, протосубтилин, инулин.

KEY WORDS

probiotic strain, Lactobacillus reuteri, enzymes, Alcalase, Neutrase, protosubtilin, inulin.

В последние годы наблюдается большой интерес к кисломолочным продуктам, содержащим микроорганизмы - пробиотики (бифидобактерии, ацидофильные молочнокислые палочки, L.rhamnosus, L.casei, пропионовокислые бактерии и др.), которые являются представителями нормальной кишечной микрофлоры человека. Lactobacillus reuteri впервые были выделены немецким микробиологом Gerhard Reuter из грудного молока и в честь него они и получили название. В работах Gerhard Reuter [1] в 1960 году они были отнесены к молочнокислым бактериям, в частности, к Lactobacillus fermentum биотип 11. В 1980 году Kandler et. al [2] установили существенное различием между Lactobacillus reuteri и другими биотипами Lactobacillus fermentum и было предложено определить их в новый вид Lactobacillus reuteri.

Интерес к Lactobacillus reuteri начал проявляться после того, как они были выделены из желудочно-кишечного тракта.

В дальнейшем при исследовании основных видов микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных было установлено, что Lactobacillus reuteri является основным компонентом лактобактерий, наряду с Lactobacillus acidophilus, которые присутствуют в желудочно-кишечном тракте. Lactobacillus reuteri обладает высокой антимикробной активностью Продуцирует

бактериоцины реутерин, реутерицин и реутециклин, которые ингибируют кишечные патогенны и стимулируют иммунную систему человека. Lactobacillus reuteri облигатная гетероферментативная молочнокислая палочка, микроаэрофил., продуцирует большое количество глюканов и фруктанов экзополисахаридов, которые рассматриваются как пребиотики. Образует конечные продукты метаболизма молочную и уксусную кислоты. В настоящее время на российском рынке бактерии вида Lactobacillus reuteri продаются в виде БАД, жевательных таблеток, капель для приема внутрь, капсул для перорального приема и сухого детского питания. Кисломолочные продукты c Lactobacillus reuteri производятся только в Швеции. Препараты с Lactobacillus reuteri используются при лечении диареи у детей, а также для снятия коликов у новорожденных.

Исследования последних десятилетий выявили способность молочнокислых бактерий образовывать антимикробные вещества различной природы, которые могут стать альтернативой существующим антибиотикам и консервантам. Наиболее изученной из них является группа антибактериальных пептидов - бактериоцинов, разнообразных по уровню активности, спектру и механизму действия [3,4,5]. Бактериоцины легко расщепляются ферментами пищеварительного тракта и поэтому они могут заменить традиционные химические [6,7,8].

Процесс получения бактериального концентрата включает в себя наращивание клеток молочнокислых бактерий в питательной среде и их отделение центрифугированием. При этом необходимо накопить в среде максимально возможное количество активных клеток. В качестве азотистой основы для питательных сред широко используются гидролизаты белков молока. Степень гидролиза белковых субстратов и пептидный состав гидролизата зависит от многих факторов, таких как: вид и специфичность фермента, концентрация фермента и продолжительность ферментации, рН и температура ферментации и т.д.

Целью настоящих исследований является разработка технологических режимов производства бактериального концентрата пробиотических культур Lactobacillus reuteri для производства функциональных молочных продуктов.

Объектом исследования является штамм Lactobacillus reuteri.

Штамм Lactobacillus reuteri хранили в замороженном состоянии при температуре минус 80°С в растворе, содержащем 6% обезжиренного сухого молока и 10% глицерина. Для восстановления культуры использовали среду MRS, температуру культивирования 37°С и анаэробные условия.

Для исследований были выбраны 4 протеолитических фермента (протосубтилин, Alcalase, Neutrase, Protamex).

Работы по подбору питательной среды для культивирования L. reuteri проводили поэтапно: на первом - осуществляли гидролиз обезжиренного молока и сыворотки. Диапазон варьирования дозы вносимого фермента и продолжительность ферментации различна и подбирается для каждого процесса отдельно. Исходя из литературных источников и предшествующих исследований [9, 10, 11] для эксперимента были выбраны две концентрации ферментов: 0,4 % и 3%, которые зависят от содержания белка в среде, а также продолжительность ферментации 1,5 ч и 3 ч. Согласно рекомендациям производителей, температура и активная кислотность процесса составляли 55°С и 7,2 ед. рН. Полученные гидролизаты были исследованы как питательные среды для накопления максимального количества клеток L. reuteri. Процесс

культивирования проводили при температуре 37°С в течение (16 - 17) часов, доза инокулята - 5 %. После 17 часов культивирования определяли количество клеток (чашечным методом на среде MRS в анаэробных условиях).

При разработке состава питательной среды для наращивания биомассы L. reuteri использовались следующие компоненты: гидролизованное молоко, дрожжевой экстракт, инулин, сахароза и цистеин. Все полученные данные обрабатывались в программе Statistica 6.1[12, 13,14].

Известно, что оптимальная температура роста и рН питательной среды для молочнокислых палочек составляет (37 - 41) °С и рН= (5,4 - 6,4) ед. рН, тогда как из литературных источников, посвященных различным исследованиям с Lactobacillus reuteri, авторы используют следующие значения температур и активной кислотности для культивирования микроорганизма: 38°С и рН - 6,2 ед. рН, 37°С и рН - 6,5 ед. рН, рН - (6,0 - 6,8) ед. рН, рН - 5,8 ед. рН и 37°С[15]. Исходя из вышеизложенного, в работе по подбору режимов культивирования микроорганизма Lactobacillus reuteri был взят следующий интервал значений активной кислотности рН = (5,6 - 6,6) ед. рН и температуры (32 - 41)°С. Культивирование Lactobacillus reuteri проводили в ферментерах фирмы Das Gip (Германия) на 400 мл, а затем в ферментере Prelude фирмы Biolafitt на 5 л (Франция) при постоянных значениях активной кислотности или температурах и непрерывном раскислении водным раствором NaOH с массовой долей 30%. Инокулят готовили на среде MRS и вносили в количестве 5% во всех опытах.

Через каждые 2 часа культивирования проводили отбор проб и определяли количество клеток Lactobacillus reuteri.

Количество клеток Lactobacillus reuteri определяли методом предельных разведений в среде ГМК-1 в анаэробных условиях и термостатировании в течение 3-5 дней при температуре 37°С в соответствии с Методическими рекомендациями по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях цельномолочной и молочно-консервной промышленности.

Математическая обработка данных экспериментов по влиянию вида ферментов и режимов гидролиза показала, что такие факторы, как «вид среды», «вид фермента» и «доза фермента» оказывала значимый эффект на развитие клеток L. reuteri. Было установлено, что наибольшее количество клеток было получено на гидролизате, приготовленном на обезжиренном молоке (7,941±0,209) lg КОЕ/см3, тогда как на гидролизованной сыворотке -(6,959±0,148) lg КОЕ/см3. Результаты исследований показали, что гидролизаты, полученные с использованием ферментов Alcalase, Neutrase, протосубтилин обладали практически одинаковым воздействием на накопление клеток L. reuteri в среде. На рисунке 1 представлены данные по влиянию вида фермента на накопление клеток L. reuteri.

Наибольшее количество клеток было отмечено при культивировании в течение 16-17 ч на гидролизате, полученном с использованием 1% фермента Alcalase - (7,818±0,395) lg КОЕ/см3. Тогда как для фермента Neutrase -(7,690±0,331) lg КОЕ/см3 и Протосубтилин - (7,670±0,316) lg КОЕ/см3. Исследования показали, что при повышении дозы фермента, интенсивность развития клеток возрастала. Также определено, что продолжительность ферментации среды от 1,5 до 3 часов различными ферментами не влияла на питательную ценность получаемых сред, не давая различий в количестве клеток L. reuter/Таким образом, на основании полученных данных, в дальнейших

исследованиях для получения гидролизованного обезжиренного молока был выбран протеолитический фермент А1са1аБе, с дозой внесения 3%.

С целью оптимизации состава питательной среды был разработан 5 факторный центральный композиционный план со следующим диапазоном варьирования ингредиентов: гидролизованное молоко (30 - 100) %, дрожжевой экстракт (0 - 5) %, сахароза (0 - 5) %, инулин (0 - 1) г/дм3. Проведенные исследования показали, что добавление сахарозы угнетает рост клеток гвМвп. На рис. 2 и 3 представлены поверхности отклика влияния содержания сахарозы (без добавления и при 5%) на количество клеток в питательной среде.

ЛаэзЕ гхшчтим

Ънфцшнэ

Рисунок 1 - Влияние вида фермента на накопление клеток ¡.гвМвп в гидролизованном обезжиренном молоке

Проведенные исследования показали, что наибольшее накопление клеток гви1вп было получено на питательной среде без добавления сахарозы (рис.2,3)

Рисунок 2 - Зависимость количества клеток 1..гви1вп от концентрации компонентов в среде при «Сахароза» - 0%

Рисунок 3 - Зависимость количества клеток. ¡.гви1вп от концентрации компонентов в среде при «Сахароза» - 5 %

На развитие и рост клеток в процессе культивирования влияли взаимодействие факторов «Гидролизат-Инулин» и «Дрожжевой экстракт-Цистеин». Было установлено, что с увеличением содержания инулина в составе питательной среды, количество клеток возрастало. Тогда как, ингредиенты дрожжевой экстракт и цистеин в составе питательной среды могут быть взаимозаменяемы (рис. 4).

Таким образом, было установлено, что добавление инулина (рис. 5), дрожжевого экстракта или цистеина в гидролизованное молоко стимулирует развитие L. reuteri, тогда как сахароза подавляет.

Наибольшее количество клеток было получено на гидролизованном молоке при использовании протеолитического фермента Alcalase в количестве 3% от содержания белка в среде. Оптимальный состав питательной среды, состоящий из гидролизованного молока, дрожжевого экстракта, инулина и цистеина, обеспечивал интенсивное развитие и накопление клеток Lactobacillus reuteri.

Рисунок 4 - Зависимость количества

клеток 1-. гвМвп от концентрации цистеина и дрожжевого экстракта в среде

Рисунок 5 - Зависимость количества клеток 1-. гви1вп от концентрации инулина и гидролизата в питательной среде

Проведены исследования по влиянию размножения Lactobacillus reuteri при культивировании при различных значениях активной кислотности (5,8; 6,0; 6,2 ед.рН) и температурах (32°С; 35°С; 37°С; 39°С; 41°С).

На рис.6 представлены данные по изменению роста L. reuteri при поддержании активной кислотности среды на уровне 5,8 ед. рН при различных температурах культивирования 32°С, 35°С, 37°С, 39°С и 41°С. Анализ представленных данных показывает, что наибольшее содержание клеток было получено при культивировании при температуре 35°С, 37°С и достигало до 1,4х109 КОЕ/см3 и 1,5*109 КОЕ/см3 соответственно.

На рис.7 представлены данные по изменению роста L. reuteri при поддержании активной кислотности среды на уровне 6,0 ед. рН при различных температурах культивирования 32°С, 35°С, 37°С, 39°С и 41°С.

Наибольшее количество клеток (1,6х109 КОЕ/см3 и 2,4х109 КОЕ/см3) было отмечено при культивировании при температуре 35°С и 37°С.

Рисунок 6 - Изменение содержания

клеток L. ге^еп в процессе культивирования при различных температурах при рН = 5,8 ед. рН

Рисунок 7 - Изменение содержания клеток L. rеutеr¡ в процессе культивирования при различных температурах при рН = 6,0 ед. рН

На рисунке 8 представлены данные по изменению роста L. reuteri при поддержании активной кислотности среды на уровне 6,2 ед. рН при различных температурах культивирования 32°С, 35°С, 37°С ,39°С и 41°С.

Исходя из данных, представленных на рисунке 8, видно, что при температуре 35°С, 37°С и активной кислотности рН = 6,2 ед. рН также отмечалось н высокое количество клеток в культуральной среде.

Как видно из рисунка 9 интенсивное накопление клеток происходило в течение (8 - 10) часов (при внесении 5 % инокулята), и разница в количестве клеток в стационарной фазе роста при культивировании при разных значениях активной кислотности была не велика, варьировалась в интервале (8,87 - 9,24) lg КОЕ/см3. Однако, наибольшее количество клеток было достигнуто при культивировании при более низких значениях активной кислотности, в интервале рН от 5,8 до 6,2 ед. рН. Так, при активной кислотности среды - 5,8 ед. рН, наибольшее количество клеток составило - 9,18 lg КОЕ/см3, при 6,0 ед. рН - 9,24 lg КОЕ/см3 и при 6,2 ед. рН - 9,15 lg КОЕ/см3.

По полученным данным было установлено, что наибольшее содержание клеток L. reuteri было достигнуто при температуре 37°С и активной кислотности 6,2 ед. рН.

Выводы:

1. Наибольшее количество клеток было получено при культивировании L. reuteri в питательной среде с гидролизованным молоком при использовании протеолитического фермента Alcalase в количестве 3% от содержания белка в среде. Оптимальный состав питательной среды состоял из гидролизованного молока, дрожжевого экстракта, инулина и цистеина и обеспечивал интенсивное развитие и накопление клеток Lactobacillus reuteri.

2. При исследовании влияния активной кислотности среды и температуры культивирования L. reuteri на накопление клеток было установлено, что оптимальной температурой культивирования является температура 37°С и активная кислотность 6,2 ед. рН. Количество клеток при данных параметрах составляло 9,15 lg КОЕ/см3.

Рисунок 8 - Изменение содержания клеток I 1Чви1вп в процессе культивирования при различных температурах при рН = 6,2 ед. рН

Рисунок 9 - Изменение содержания клеток при культивировании при различных значениях активной кислотности

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Reuter G. Das vorkommen von laktobazillen in lebensmitteln und ihr verhalten im mensclichen intestinaltrakt// Zbl Bac Parasit Infec Hyg I Orig. - 1965. - №197(S). -P. 468-487.

2. Kandler O., Stetter K., Kohl R. Lactobacillus reuteri sp. Nov. a new species of heterofermentative lactobacilli// Zbl. Bakt. Hyg. Abt. Orig. - 1980. - C1. - 264-269.

3. Стоянова Л.Г., Устюгова E.A., Нетрусов A.H. 2012 Антимикробные метаболиты молочнокислых бактерий: разнообразие и свойства (обзор)//Приклад. Биохим.Микробиол. Т.48, № 3, .644-650

4. Takao Mukai, Tomoko Asasaka, Eri Sato, Kenichi Mori, Mitsuyo Matsumoto, Hitoshi Ohori. Inhibition of binding of Helicobacter pylori to the glycolipid receptors by probiotic Lactobacillus reuteri //FEMS Immunology and Medical Microbiology-32(2002)-P.105-110

5. Shornikova A.V., Casas I.A., Mykkanen H., Salo E. and Vesikari T. Bacteriotherapy with Lactobacillus reuteri in rotavirus gastroenteritis// 1997 Pediatr. Infect. Dis.J.16 -P.1103-1107

6. Устюгова E.A., Федорова Г.Б.,Катруха Г.С., Стоянова Л.Г. 2011 Изучение антибиотического комплекса, образуемого Lactococcus lactis subsp. Lactis 194 вариант - К// Микробиология. Т.80. №5. С. 644-685

7. Elizete de F.R. Pancheniak. Molecular characterization and biomass and metabolite production of Lactobacillus reuteri LPB P01-001: A potential probiotic/ Elizete de F.R. Pancheniak, Maike T. Maziero, Jose A. Rodriguez-Leon, Jose L. Parada, Michele R. Spier, Carlos R. Soccol// Brazilian Journal of Microbiology. - 2012. -P. 135-147

8. Filipe Santos. Effect of amino acid availability on vitamin B12 production in Lactobacillus reuteri/ Filipe Santos, Bas Teusink, Douwe Molenaar, Maurice van Heck, Michiel Wels, Sander Sieuwerts, Willem M. de Vos, Jeroen Hugenholtz// Applied and environmental microbiology. - V. 75. - N 12. - 2009. - P. 3930-3936

9. Головач, Т.Н. Закономерности гидролиза сывороточных белков экзо- и эндопротеазами / Т.Н. Головач, Н.В. Гавриленко, Н.К. Жабанос, В.П. Курченко// Труды БГУ. - 2008. - Т. 3. - Ч. 1. - С. 1-15

10. Головач, Т.Н. Культивирование молочнокислых бактерий в питательных средах на основе гидролизатов белков молока/ Т.Н. Головач// Труды БГУ. -2010. - Т. 5. -Ч. 1. - С. 118-126

11. Головач, Т.Н. Гидролиз белков молока ферментными препаратами и протеолитическими системами молочнокислых бактерий// Труды БГУ. - 2012.

- Т.7. -Ч 1. -С. 106-120

12.Magdalena Polak-Berecka, Adam Wasko, Monicka korolowska-Wiater, Marcin Podlesny, Zdzislaw Targonski, Agnieszka Kubik-Komar. Optimization of Medium composition for enhancing growth of lactobacillus rhamnosus PEN using persponse surface methodology// Polish Journal of Microbiology, Vol.59, № 2, 2010, P. 113118

13.Раскошная T.A. Конструирование питательной среды для культивирования пробиотического микроорганизма Lactobacillus reuteri /ТА Раскошная, В.Ф. Семенихина, И.В. Рожкова, А.В. Бегунова // Молочная промышленность - 2015

- №4 - С. 26-27.

14.CHEN Guo .Influence of Conditions on Reuterin Accumulation by the Resting Cell Biotransformation Process/ CHEN Guo (РШ), YANG Daomao {ШШШ), XIAO

Yaqin (N»)and CHEN Hongwen BIOTECHNOLOGY AND

BIOENGINEERING Chinese Journal of Chemical Engineering. 2011. - № 19(6). -P. 1023—1027

15.Смирнов, E.A. Совершенствование научных и разработка практических аспектов биотехнологии моновидовых бактериальных концентратов молочнокислых микроорганизмов для сыроделия/ Е.А. Смирнов// Автореферат на соискание ученой степени кандидата технических наук - г. Вологда. - 2011

16.Бондаренко, А.Н. Влияние биостимулирования на развитие нута в условиях северо-западного прикаспия [Текст] / А.Н. Бондаренко // Вестник Башкирского государственного аграрного университета. -2015. -№4. -С. 15-18

17.Сергеев, B.C. Использование биопрепаратов и биоактивированных удобрений в качестве антистрессоров и биостимуляторов при возделывании зерновых культур [Текст] / В.С.мСергеев, О.В. Радцева, Г.М. Рахимова, Р.Ф. Исаев // Вестник Башкирского государственного аграрного университета. -2013. -№2. -С. 21-24