Разработка способа экспресс-генотипирования штаммов вируса клещевого энцефалита с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 576.856.25

Н.В. Кулакова, С.И. Беликов, Г.Н. Леонова

РАЗРАБОТКА СПОСОБА ЭКСПРЕСС-ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА С ПОМОЩЬЮ АНАЛИЗА ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИН РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ

Лимнологический институт СО РАН, Иркутск

ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, Владивосток

Показана возможность использования анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для генотипирования штаммов вируса клещевого энцефалита. С помощью рестрикта-зы 1^1Е)Е1 подтверждена принадлежность 10 из 11 проанализированных штаммов к дальневосточному субтипу. Нетипируемый этим методом штамм Р-85 дополнительно исследован с использованием эндонуклеазы ТврЮ. Показана его принадлежность также к дальневосточному субтипу вируса клещевого энцефалита.

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, генотипирование

Типирование вирусов с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализа) широко используется в мировой практике как для проведения эпидемиологических, так и клинических исследований [1, 2]. Несмотря на то, что определение субтипа вируса клещевого энцефалита (КЭ) обычно проводят с помощью анализа молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот или определения нуклео-тидной последовательности участков генома, оба способа генотипирования являются достаточно трудоемкими [3, 4, 5, 6]. Усовершенствованные методы типирования флавивирусов основаны на различных модификациях анализа амплифициро-ванных фрагментов генома (ПДРФ, ББСР, СРТР, ИЗЗ-РСИ), которые позволяют быстро проводить скрининг большого количества штаммов [7, 8, 9]. Типирование штаммов, основанное на ПДРФ-анализе, ранее не применялось для представителей группы вирусов, переносимых клещами.

Целью настоящей работы явилась оценка возможности использования ПДРФ-анализа для генотипирования штаммов вируса клещевого энцефалита.

Материал и методы исследования

В работе использованы дальневосточные штаммы Р-91, Р-85, Р-92, Р-336, Р-73, Р-82, Р-212, Р-332, Р-315, Р-253, Р-94 вируса КЭ. Исследуемые штаммы вызвали различное клиническое течение КЭ от бессимптомной инаппарантной формы до манифестных форм с различными клиническими проявлениями, среди которых были представлены стертая, лихорадочная и очаговая формы. Штаммы выделены в течение

1973-2002 гг. от больных КЭ людей и лиц с укусом клеща на территории Приморского края Дальнего Востока России.

Методы молекулярного изучения подробно описаны в ранних публикациях [4, 10], они включали в себя выделение вирусной РНК, обратную транскрипцию, полимеразную цепную реакцию, выделение и очистку амплифицированных фрагментов, определение первичной последовательности (секвенирование), анализ нуклеотидных последовательностей Е белка вируса КЭ.

Результаты и обсуждение

Полученные нами данные нуклеотидных последовательностей фрагмента 1540-1699 н.о. гена Е дальневосточных штаммов, а также опубликованные в базе данных GeneBank последовательности других известных штаммов вируса КЭ были использованы для поиска сайтов рестрикции, специфичных трем различным субтипам вируса КЭ. По данным В.И. Злобина [11], таким специфичным локусом на этом фрагменте для всех трех субтипов является кодон, расположенный в позиции 206 аминокислотных оснований белка Е. Проведен поиск эндонуклеаз, которые способны расщеплять данный участок. Причем для анализа был выбран более протяженный участок гена Е длиной 509 н.п., включающий проанализированный ранее фрагмент гена Е длиной 160 нуклеотидных оснований (н.о.) [4, 10]. Этот фрагмент у штаммов Sofjin, Neudoerfl и Vasilchenko был исследован с помощью программы Webcutter 2.0 ( http:/ /www. firstmarket.com/firstmarket/cutter / cut2.html). Данный участок расположен в позициях 1255-1763 н.о. генома штамма Sofjin, который

Кулакова Н.В. Разработка способа экспресс-генотипирования штаммов вируса клещевого энцефалита с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов /с. 29-33

Sof. Vas. Neud.

Sof. Vas. Neud.

Sof. Vas. Neud.

Sof. Vas. Neud.

Sof. Vas. Neud.

Sof. Vas. Neud.

Sof. Vas. Neud.

Sof. Vas. Neud.

фланкируется праймерами № 1766-1768 [10].

В результате анализа нук-леотидных последовательностей указанных фрагментов генома вируса КЭ было обнаружено, что все три штамма, прототипные трем субтипам, можно различить с помощью единственной эндонуклеазы BstDEI, узнающей и расщепляющей сайт C/TNAG (Рис. 1). На рисунке можно видеть, что сайтов узнавания данной эндонуклеазы нет в последовательности штамма Neudoerfl западноевропейского субтипа. Следовательно, этот штамм не будет расщепляться под действием эндонуклеазы BstDEI.

Для сибирского и дальневосточного субтипов сайт рестрикции в позиции 302 является общим. В то же время, по двум другим сайтам в позициях 333 и 431 н.о. можно дифференцировать эти оба субтипа вируса КЭ. Так, для дальневосточного штамма Sofjin предполагаемая картина рестрикции будет представлена тремя фрагментами длиной 30, 176 и 302 н.о., образующимися при расщеплении в сайтах 302 и 333 н.о. Другая картина рестрикции предполагается для штамма сибирского субтипа — Vasilchenko. В этом случае, в результате расщепления эндо-нуклеазой сайтов 222, 302 и 431 н.о. должны образоваться четыре фрагмента длиной 78, 80, 129 и 222 н.о.

В результате расщепления генома с помощью данной эндонуклеазы для штамма каждого субтипа образуется специфичный набор фрагментов различной длины, электрофореграмма которых позволяет провести типирование субтипа вируса КЭ (Таблица 1).

Теоретически можно предположить, что наиболее специфичной областью расщепления штаммов дальневосточного субтипа вируса КЭ должен быть сайт рестрикции 333 н.о., который соответствует позиции 206 а.о. белка Е. Это объясняется тем, что два из пяти нуклеотидных оснований, узнаваемых эндонуклеазой, определяют специфичную для дальневосточного субтипа аминокислоту серин (Ser). В таблице 2 показано полное

1 60 GACCAGAGTGATCGAGGCTGGGGCAACCATTGTGGATTATTTGGAAAAGGCAGCATTGTG GACCAGAGTGACCGAGGCTGGGGCAATCACTGCGGATTATTTGGAAAGGGCAGTATTGTG GATCAGAGTGATCGAGGCTGGGGCAACCACTGTGGACTGTTTGGAAAGGGTAGCATTGTG

61 120 ACCTGTGTCAAGGCGTCTTGTGAGGCAAAAAAGAAAGCCACAGGACACGTGTATGACGCT ACCTGCGTCAAGGTGGCCTGTGAGGCAAAGAAGAAGGCCACTGGACATGTGTATGACGCC GCCTGTGTCAAGGCGGCTTGTGAGGCAAAAAAGAAAGCCACAGGACATGTGTACGACGCC

121 180 AACAAAATTGTGTACACAGTCAAAGTAGAGCCGCACACGGGGGATTACGTCGCTGCTAAT AACAAGATCGTGTACACCGTTAAGGTTGAGCCACACACGGGGGACTATGTTGCCGCCAAT AACAAAATAGTGTACACGGTCAAAGTCGAACCACACACGGGAGACTATGTTGCCGCAAAC

181 222 240

GAGACTCACAGTGGAAGAAAAACCGCGTCCTTCACGGTTTCCTCGGAGAGGACCATCTTG GAAACCCACAGTGGGAGGAAGACGGCATCCTTCACGGTCTCefCS^AAAAAACCATCTTG GAGACACATAGTGGGAGGAAGACGGCATCCTTCACAATTTCTTCAGAGAAAACCATTTTG

241 300

ACCATGGGAGACTACGGAGACGTGTCCTTGTTATGCAGAGTAGCCAGCGGTGTTGACCTT ACTATGGGGGATTATGGAGATGTGTCCTTGTTGTGCAGAGTCGCCAGTGGCGTTGACTTG ACTATGGGTGAGTATGGAGATGTGTCTTTGTTGTGCAGGGTCGCTAGTGGCGTTGACTTG

301 333 360

CCGTCATCCTGGAGCTTGACAAGACQIÓÍÍaAACACCTACCGACGGCCTGGCAG .CTGTCATTCTTGAGCTTGATAAGACTCTGGAACACCTTCCGACGGCCTGGCAG GCCCAGACCGTCATCCTTGAGCTTGACAAGACAGTGGAACACCTTCCAACGGCTTGGCAG

361 420

GTCCACCGGGACTGGTTCAATGATCTGGCCCTACCGTGGAAACATGAAGGGGCACAGAAT GTCCGTCGGGACTGGTTCAATGATCTGGCTCTACCGTGGAAACACGAAGGAGCGCAACAA GTCCATAGGGACTGGTTCAATGATCTGGCTCTGCCATGGAAACATGAGGGAGCGCAAAAC

421 431 480

TGGAACAACGCGGAACGGCTGGTTGAGTTTGGAGCTCCACATGCTGTGAAAATGGACGTG TGGAACAATGÇf^^GACTGGTTGAATTTGGAGCTCCGCATGCCGTTAAAATGGATGTG TGGAACAACGCAGAAAGACTGGTTGAATTTGGGGCTCCTCACGCTGTCAAGATGGACGTG

509

Sof. Vas. Neud.

481

TACAACCTTGGAGACCAGACTGGAGTGTT TATAACCTTGGAGATCAAACTGGGGTGTT TACAACCTCGGAGACCAGACTGGAGTGTT

Рис. 1. Выровненные последовательности фрагмента гена Е штаммов трех субтипов вируса клещевого энцефалита. Дальневосточный субтип вируса с прототипным штаммом Sofjin обозначен Sof., сибирский субтип вируса с прототипным штаммом Vasilchenko обозначен Vas., западный субтип вируса с прототипным штаммом Neudoerfl обозначен Neud. Серым цветом обозначены сайты узнавания эндонуклеазой BstDEI

Таблица 1

Предполагаемые результаты расщепления эндонуклеазой Ъ8ЬОЕ1 ампликона длиной 509 н.о. штаммов вируса КЭ

Название штамма вируса КЭ Сайты рестрикции BstDEI (н.о.) Фрагменты рестрикции BstDEI (н.о.)

Sofjin 302, 333 31+176+302

Neudoerfl — —

Vasilchenko 222,302,431 78+80+129+222

Примечание: отсутствие сайтов узнавания эндонуклеазой В$1йЕ1 в последовательности фрагмента гена Е штамма ЫеийоегА

Кулакова Н.В. Разработка способа экспресс-генотипирования штаммов вируса клещевого энцефалита с помощью анализа полиморфизма длинрестрикционных фрагментов/с. 29-'33

Sof-HO

Sofjin

Osh.A-1

Osh.C-1

Osh.I-1

Osh.3-6

0sh.5-10

Osh.5-11

P-94

P-SS

P-90

P-73

P-196

P-202

P-208

P-211

P-212

P-253

P-315

P-332

P-336

P-437

P-4461

P-4486

P-4487

P-776

P- 86

P-89

P-87

P-91

P-82

P-92

205

Crimea Hehcir

Kol.-1 Kol.-19 Kol.-23 Kol.-29 Kol.-30 Kol.-31 KH98-10 KH98-2 KH98-5 KH99-m9 V199-mll Prim. -3 Prim. -4 Senzhang

286 и.о. 345

302 и.о. 333 и.о.

AGCGGCGTTGACCTTGCTCAGACCGTCATCCTGGAGCTCGACAAGACCTCAGAACACCTA

.....т.......... .....т.......... .................т........

.....т.......... .....Т. .

.....т..........

.....т..........

. . .А.Т.......... . .т......т.......т........

.с.. .

. .т............. . ,Т......Т.А.....Т........ ....Т...

.................т........

. .т............. . .Т......Т.А.....Т........ ....Т...

. л............. ....Т...

. .т............. . ,Т......Т.А.....Т........ ....т...

. .т............. ... .т.. .

. .т.............

. .т............. ....т...

. .т............. ....т...

. .т............. ...,т...

........т........т........ ... .т.. .

. .т............. . .Т......Т.А.....Т........ ...,т...

. .т............. ....тт..

. .т............. ....т...

. .т............. . .т..............т........ . ...т.. .

. .т............. . ,Т......Т.А.....Т........ ....т...

. .т............. . .Т......Т.А.....Т........ ....т.. .

.................Т........

.................Т........

.................Т........

. .т............. ....т...

. .т............. ........т........т........ ....т.. .

.G......

.G......

. GT.....

.G......

. G......

. G......

.....т.......... .................т........

.....т.......... .................т........

.................т........ ....Т...

.....т.....т.. . . ..............А. .Т..Т.....

Рис. 2. Сайты узнавания эндонуклеазой Вя(ОЕ1 нуклеотидной последовательности фрагмента гена Е штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа. Точками показаны нуклеотиды, совпадающие с последовательностью штамма БоДт-НО (Бо/-НО)

Таблица 2

Иуклеотидные последовательности штаммов вируса КЭ в позициях 333-337 и.о. ПЦР-фрагмента длиной 509 н.о.

Сайт рестрикции эндонуклеазой BstDEI Название штамма Нуклеотидная последователь-ность участка ПЦР-фрагмента 333-337 н.о. Колируемая субтин-сие-цифичная аминокислота

C/TNAG Sofjin С/ТСАС TCA-Ser

Neudoerfl АСТСС GTG-Val

Vasilclienko тетве CTG-Leu

соответствие последовател ь-ности, узнаваемой эндонуклеазой, характерной для штамма Бофп дальневосточного субтипа. Здесь же представлены отличия последовательности, узнаваемой эндонуклеазой в сайте 333 и.о., и нуклеотидных последовательностей, специфичных штаммам УавНсЬепко и Ыеис1оегП. Следует отметить, что оба сайта рестрикции эндонуклеазой ВзгГ)Е1 в позициях 302 и 333 и.о., характерные для штаммов дальневосточного субтипа вируса КЭ, расположены в области проанализированного нами фрагмента 160 н.о. гена Е.

Используя ранее полученные нами данные по этому фрагменту у 24 дальневосточных штаммов, выделенных от больных КЭ [4, 10]. и иуклеотидные последовательности штаммов, взятые из СепеВапк, был проведен сравнительный анализ 49 штаммов вируса КЭ дальневосточного субтипа. Иуклеотидные последовательности этих штаммов, приведены на рис. 2. Показано, что большинство штаммов (46) содержат два ожидаемых сайта рестрикции для В51ЭЕ1. Однако три штамма составили исключение. Так, в первом сайте рестрикции (302 н.о.) штаммы Р-85 и КН99-ш9 имеют нук-леотидную замену Т—»С, а во втором сайте (333 н.о.) штаммы Р-85 и НеЬаг несут замену С—>Т. Значит, для этих штаммов можно предположить иную, не специфичную штаммам дальневосточного субтииа картину рестрикции. Тем не менее, штамм КН99-ш9 все же можно отнести к дальневосточному субтипу, так как он содержит второй сайт рестрикции. В этом случае расщепление будет происходить только в позиции 333 н.о. и картина рестрикции должна быть представлена двумя фрагментами 176 и 333 н.о. Два штамма Р-85 и НеЬаг не могут быть типированы эндонуклеазой Вз10Е1 и требуют проведения дополнительного анализа с помощью определения первичной последовательности фрагмента генома.

В данном случае, предполагаемая картина рестрикции штаммов Р-85 и НеЬаг должна совпа-

Кулакова H.В. Разработка способа экспресс-генотипирования штаммов вируса клещевого энцефалита с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фра/ментов /с. 29-33

Рис. 3. Электрофореграмма ампликонов (ПЦР-фрагментов) штаммов вируса КЭ, обработанных эндонуклеазой ВяЮЕ!.

1-11 дорожкам соответствуют штаммы: Р-91, Р-85, Р-92, Р-336, Р-73, Р-82. Р-212, Р-332,1415, Р-253, Р-91;

М — маркер молекулярного веса

дать с картиной, характерной для штаммов западноевропейского субтипа. Как и штамм Ыеис1оегП, штаммы Р-85 п НеЬсн не содержат сайтов узнавания эндонуклеазой Г)ЕI на данном фрагменте генома. Для дифференциации штаммов западноевропейского субтипа мы провели поиск эндо-нуклеаз, специфичных для последовательности штамма Ыеис1оегП. Было обнаружено, что анализ фрагмента САО'ГС (332-336 и.о.), включающего специфичный для всех штаммов этого субтипа локус в позиции 206 а.о., позволяет дополнительно типировать штаммы западноевропейского субтипа, обрабатывая ампликоны эндонуклеазой ТврШ. В результате обработки ПЦР-фрагмен-та гена Е длиной 509 и.о. штаммов западноевропейского субтипа вируса КЭ этой эндонуклеазой должны получаться два фрагмента длиной 336 и 173 и.о. Электрофореграмма штаммов дальневосточного и сибирского субтипа вируса КЭ, обработанных таким же образом, предположительно будет представлена целевым ПЦР-фрагментом, гак как сайтов узнавания эндонуклеазой ТнрЯ1 в последовательностях анализируемого участка генома штаммов 5о1]п1 и УаяПсЬепко не обнаружено. Таким образом, не типируемые с помощью эн-донуклеазы ПЕ1 штаммы Р-85 и НеЬаг могли бы быть ошибочно отнесены к западноевропейскому субтипу вируса КЭ, однако дополнительная обработка эндонуклеазой ТэрШ теоретически позволяет дифференцировать их от штаммов западноевропейского субтипа вируса КЭ.

Для экспериментального подтверждения результатов выше представленного теоретического анализа был проведен ПДРФ-анализ 11-ти штаммов (Р-91, Р-85, Р-92, Р-336, Р-73, Р-82, Р-212, Р-332, Р-315, Р-253, Р-94) вируса КЭ, у которых нуклеотидные последовательности фрагмента гена Е длиной 160 и.о. были определены нами ранее [4, 10|. ПЦР-фрагменты длиной 509 и.о. были очищены и обработаны рестриктазой Вя10Е1.

Электрофорез ПЦР-продуктов (ампликонов' проводили в 10% полиакриламидном геле. Каь следует из результатов, приведенных на рис. 3 картина рестрикции для всех 11 штаммов совпал: с теоретически предположенной.

Как п предполагалось выше, штамм Р-85 ш дал типичной для дальневосточного субтипг вируса КЭ картины рестрикции (на рис. 3 по казан целевой ПЦР-фрагмент длиной 509 и.о.) Тнпирование этого штамма проведено нами нг основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов Е и NS5 [10]. Для все> остальных представленных на электрофореграм-ме штаммов получена специфичная картина рестрикции в виде набора фрагментов ожидаемой длины 30, 176 и 303 и.о.

Таким образом, результаты проведенногс ПДРФ-анализа показали возможность быстрого типировання исследуемых штаммов вируса КЭ с помощью одной рестрикгазы BstDEl и подтвердили принадлежность 10 из 11 проанализированных штаммов к дальневосточному субтипу. Не-типируемые этим методом штаммы должны быть дополнительно исследованы с использованием эндонуклеазы TspRI или с помощью определения нуклеотидной последовательности фрагмента гена Е. В целом, из всех 49 проанализированных штаммов с помощью выше указанного метода удалось провести типирование46 (94%) штаммов вируса КЭ. Полученные результаты показали, что благодаря предложенному подходу определения субтипа штаммов вируса КЭ можно достаточно быстро проводить скрининг большого массива изолятов, что, несомненно, представляет научно-практический интерес, как в области молекулярной эпидемиологии, так и для диагностических исследований. Кроме того, типирование штаммов вируса КЭ па основе двух реакций (ОТ-ПЦР и рестрикции) без определения нуклеотидной последовательности фрагментов генома значительно сокращает время проведения анализа, финансовые расходы исследователей, а также позволяет получить в короткий срок значительно больше информации о циркуляции тех или иных субтипов в различных ареалах вируса КЭ.

THE ELABORATION OF THE EXPRESS GENETYPING METHOD OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS STRAINS WITH THE HELP OF THE ANALYSIS OF POLYMORPHISM THE RESTRICTIVE FRAGMENTS LENGTHS

N.V. Kulakova, S.I. Belikov, G.N. Leonova

The opportunity of using the analysis of polymorphism the restrictive fragments lengths for ge-notyping of tick-borne encephalitis virus strains was shown. With the help restrictase BstDEl the belong-

Кулакова Н.В. Разработка способа экспресс-генотипирования штаммов вируса клещевого энцефалита с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов / с. 29-33

ing of 10 from 11 analysed strains to Far East subtype was confirmed. Nontyping by this method P-85 strain was additionally investigated with the using of endonuclease TspRI. Also the belonging of this strain to Far East subtype of tick-borne encephalitis virus was shown.

Литература

1. Vorndam, V. A PCR-restriction enzyme technique for determining dengue virus subgroups within serotypes / V. Vorndam, G. Kuno, N. Rosado // J. Virol. Methods.

- 1994. - Vol. 48. - P. 237-244.

2. Mota,J. Phylogenetic analysis of the envelope protein (domain III) of dengue 4 viruses / J. Mota, J. Ramos-Castaneda, R. Rico-Hesse // Salud Publica Мех. - 2002.

- Vol. 44. - P. 228-236.

3. Молекулярная характеристика популяции вируса клещевого энцефалита Южно-Сихотэ-Алиньско-го очагового региона / Г.Н. Леонова, В.Б. Кожемяко, М.И. Исаева и др. // Вопр. вирусол. — 1996. ~ № 4. -С. 154-158.

4. Молекулярное типирование штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных от людей с различной степенью тяжести инфекции на территории юга Дальнего Востока России / Г.Н. Леонова, С.И. Беликов, Н.В. Кулакова и др. // Журн. мол. генетика, микробиол. и вирусол. - 2004. - №2. - С. 32-37.

5. Cong, М. Sequence heterogeneity within three different regions of the hepatitis G virus genome / M. Cong,

M.W. Fried, S. Lambert // Virology. - 1999. - Vol. 255.

- P. 250-259.

6. Distribution and characterization of tick-borne encephalitis virus from Siberia and far-eastern Asia / D. Hayasaka, L. Ivanov, G.N. Leonova et al. // J. Gen. Virol.

- 2001. - Vol. 82. - P. 1319-1328.

7. Marshall, D.J. Determination of hepatitis С virus genotypes in the United States by cleavase fragment length polymorphism analysis / D.J. Marshall, L.M. Heisler, V. Lyamichev //J. Clin. Microbiol. - 1997. - Vol. 35. - P. 3156-3162.

8. Harris, E. Rapid subtyping of dengue viruses by restriction site-specific (RSS)-PCR / E. Harris, E. Sandoval, A.M. Xet-Mull //J. Virology. - 1999. - Vol. 253. -P. 86-95.

9. Chandler, L.J. Multiple genotypes of St. Louis encephalitis virus (Flaviviridae: Flavivirus) circulate in Harris County, Texas / L.J. Chandler, R. Parsons, Y. Randle // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 2001. - Vol. 64. - P. 12-19.

10. Генетическое типирование штаммов вируса клещевого энцефалита на основе анализа гомологии фрагмента белка оболочки / В.И. Злобин, Т.В. Демина, С.И. Беликов и др. // Вопр. вирусол. — 2001. -№ 1. — С. 16-21.

11. Кулакова, Н.В. Молекулярно-генетическая характеристика дальневосточных штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных от людей с различными формами инфекционного процесса: Автореф. дис. ... канд. биол. наук / Н.В. Кулакова. — Владивосток, 2003. - 22 с.