Применение молекулярно-генетических методик для изучения структуры штаммов вируса клещевого энцефалита Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 576.856.25:575

Л.С. Карань, Г.В. Маленко, Н.Г. Бочкова, Л.С. Левина, Г.П. Ливанова,

Н.М. Колясникова, Е.Г. Гамова, А.Г. Трухина, В.И. Злобин,

М.М. Верхозина, И.В. Козлова, Ю.П. Джиоев, Т.В. Демина, В.В. Погодина

ПРИМЕНЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДИК ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ ШТАММОВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора РФ, Москва,

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН, Москва, НИ противочумный институт Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора, Иркутск, НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва, НИИ эпидемиологии и микробиологии ГУ НЦМЭ ВСНЦ СО РАМН, Иркутск

Исследовано 11 штаммов и 8 изолятов РНК вируса клещевого энцефалита, относящихся к сибирскому и дальневосточному генотипам на полноразмерной последовательности Е гена. Период изоляции штаммов и РНК охватывает для сибирского генотипа 40 лет, для дальневосточного генотипа — 70 лет. Подтверждены полученные нами ранее данные о разделении штаммов и изолятов сибирского генотипа на две группы (азиатский и европейский топова-рианты), где азиатский вариант, в свою очередь, имеет две ветви, для одной из которых прототипным является штамм Заусаев, для другой — Васильченко. Европейский и азиатский топоварианты имеют устойчивые аминокислотные маркеры на Е гене (175 и 234 позиции). Среди изолятов, относящихся к дальневосточному генотипу, определенно можно выделить группу изолятов с японского' острова Хоккайдо — ОвЫта, проанализированные нами штаммы, изолированные на Урале, в Западной Сибири и на Дальнем Востоке, не имеют устойчивых аминокислотных маркеров, характеризующих данные региональные популяции. Получена полноразмерная нуклеотидная последовательность генома двух штаммов, один из которых — 178-79 был изолирован в 1979 году в Иркутской области от клещей I. регзикаЫз, второй — 886-84 — изолирован также в Иркутской области от С1. ги/осапт (красно-серой полевки) в 1984 году. Проведен анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей данных штаммов, в результате которого оба отнесены к дальневосточному генотипу.

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, молекулярная характеристика

Изучение генетической структуры циркулирующих штаммов вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) тесно связано с пониманием механизмов изменчивости вируса в природной среде, с его биологическими свойствами. Данный вопрос предполагает решение ряда задач: скрининг клинического материала и образцов из окружающей среды на наличие ВКЭ как уже в известных природных очагах, так и расширение изучаемого ареала; типирование изолированной РНК ВКЭ до генотипа и до группы внутри генотипа; определение нуклеотидной последовательности РНК ВКЭ как непосредственно из объекта выделения, так и из системы культивирования штамма.

Для решения этих задач нами в ЦНИИ эпидемиологии в течение последних лет были созданы и апробированы лабораторные методики для детекции и генотипирования ВКЭ в клиническом и полевом материале. Выявление вируса в исследу-

емом материале проводили с помощью ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией и с гибридиза-ционно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

Были разработаны три метода генотипирования вируса клещевого энцефалита:

— секвенирование участка Е гена длиной 211 н.п., содержащего маркерную аминокислоту в 206-й позиции, уникальную для каждого генотипа, или секвенирование полноразмерной последовательности Е гена;

— анализ полиморфизма длин рестрикцион-ных фрагментов (ПДРФ);

— ОТ-ПЦР в режиме реального времени с гиб-ридизационно-флуоресцентной детекцией с гено-типспецифическими зондами.

Данные методики были апробированы на коллекции из более чем 200 штаммов и 70 изолятов из полевого, клинического и аутопсийного мате-

риала. Каждая из методик имеет свои плюсы и минусы.

Метод прямого секвенирования. В работе были использованы праймеры TBEls GGCG TTGACTTGGCCCAGACYGTCA; TBE2s GG CGTTGACCTTGCTCAGACYGTCA; TBE6as CTTGGTTCCCTCAATGTGYGCCACAGGA А для амплификации и секвенирования участка Е гена длиной 211 н.п. и праймеры TBEEls TCACGGTGCACACATCTGGAAAA; TBEE2as CATCAGCTCCCACTCCGAGTGTCAT для амплификации и совместно с праймерами TBEls, TBE2s, TBE6as секвенирования полноразмерной копии Е гена. Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе «ABI Prism DNA Sequencer 3100» («Applied Biosystems», США) с набором «ABI Prism BigDye Terminator Kit v.1.1.». Нуклеотидные последовательности анализировали с использованием программы Mega (версия 3.1). Данным методом было охарактеризовано более 50 изолятов ВКЭ для решения задач генотипирования, обнаружения уникальных аминокислотных замен, наличия или отсутствия сайтов для эндонуклеаз рестрикции, а также для создания контрольных образцов при апробации методов ПДРФ и ОТ-ПЦР с генотипспецифичес-кими зондами. Ниже в статье будут приведены данные по филогенетическиму анализу полученных нами последовательностей ВКЭ сибирского и дальневосточного генотипов. Следует отметить, что при всех своих явных преимуществах этот метод типирования имеет определенные ограничения в использовании: он дорогостоящ, занимает достаточно продолжительное время и при наличии изолята, представляющего смесь вирусов нескольких генотипов, концентрации которых отличаются в десять и более раз, для обнаружения разных последовательностей в смеси необходимо использовать генотипспецифические праймеры для получения ампликонов, содержащих только один генотип.

Сократить финансовые и временные затраты можно при использовании метода анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), также разработанного на базе нашего института [1]. Данный метод мы апробировали на всех секвенированных нами штаммах и после получения совпадающих результатов стали использовать как скрининговый. Однако и этот метод имеет ограничения по политиповым штаммам, в которых концентрации генотипов отличаются более чем в 10 раз.

В последнее время с появлением приборов, позволяющих проводить ПЦР и детектировать ее результат в режиме реального времени или по конечной точке, появилась возмож-

ность генотипировать пробу непосредственно в результате скрининга коллекции штаммов, полевого или клинического материала. Нами был разработан метод ПЦР в режиме реального времени с генотипспецифическими флуоресцентными зондами (Рис. 1). Мишенью для праймеров (ТВЕ-291 TTCCTGGAYTTCAGAC AGGAACCAACACA ТВЕ-31.1 CATGAGCAG TTYCTCARGTCAGTGACCA) и зондов (ТВЕ-FE FAM-CATGGCAGTCCACACAGACCAGA-BQH1, TBE-FE-Ch FAM-

CATGGCAGTTCACACAGATCAGA-BQH1 (дальневосточный генотип), TBE-S FAM-CATGGCGGTCCAC ACTGACC AAA-BQH1 (сибирский генотип), ТВЕ-Е ROX-AGTGCCTGTG TCATTTTTCATTGAT-BQH2 (европейский генотип)) является участок NS1 гена. Реакция ПЦР проводилась в двух пробирках: в одной образец тестировался на присутствие кДНК ВКЭ сибирского и дальневосточного генотипов, в другой — европейского генотипа и кДНК внутреннего контрольного образца. Данный метод был адаптирован к прибору Rotor-Gene 3000 (Corbette Research, Австралия). Аналитическая чувствительность для дальневосточного и европейского генотипов ВКЭ составила 103 коп/мл, а для сибирского генотипа — 5><103 коп/мл. Данная чувствительность была определена при количественном измерении фаговых контрольных образцов клонированной РНК. Данный метод мы апробировали на коллекции штаммов ВКЭ, уже типи-рованных вышеописанными методами: сравнением нуклеотидных последовательностей и/или ПДРФ. Специфичность для всех трех генотипов ВКЭ в мультиплексной ПЦР составила 100%.

Данная методика позволяет выявлять как микст-штаммы, концентрация РНК разных генотипов в которых отличается более чем в 10 раз, так и образцы с низкой концентрацией вирусной РНК, которые трудно исследовать методом секвенирования или ПДРФ.

В результате типирования коллекции штаммов тремя вышеперечисленными методами не было обнаружено ни одного дискордантного результата. Исключение составили лишь единичные случаи нетипирования проб тем или иным методом. Например, методом ПДРФ анализа не были типированы 6 штаммов; из них в результате секвенирования 4 изолята были отнесены к сибирскому генотипу, два — к дальневосточному, в них были выявлены замены в сайтах рестрикции. Методом секвенирования и ПДРФ анализа были определены как монотиповые штаммы, содержащие последовательности ВКЭ нескольких генотипов, концентрация в которых отличается в 10 и более раз — 11 образцов. Два штамма: 178-79 и

886-84, таксономическое положение которых будет рассмотрено более подробно ниже, мы смогли типировать только методом секвенирования, так как они не имели сайтов рестрикции для ге-нотипспецифических эндонуклеаз рестрикции и имели замены в местах гибридизации всех гено-типспецифических зондов.

В результате всех вышеприведенных методов тонирования нами установлена доминирующая циркуляция ВКЭ сибирского генотипа на территории Западной и Восточной Сибири и в Центральном регионе России; на Урале выявлена смена доминирующего генотипа: среди штаммов 40-х гг. 96% принадлежат дальневосточному генотипу, из 5 исследованных штаммов ВКЭ 60-х гг. 3 отнесены к дальневосточному генотипу, два — к сибирскому. И в настоящее время при исследовании клещей I. репи/саШх нами установлено практически абсолютное доминирование

в Свердловской области сибирского генотип; ВКЭ. В Кемеровской области в 50-е — первук половину 60-х гг. два из 5 исследованных штам мов принадлежали к дальневосточному генотипу в 70-е гг. при исследовании 42 штаммов выявле ны источники с одновременным ирисутствие.\ сибирского и дальневосточного генотипов в трез случаях, отдельно ДВ генотип в одном случае, ос тальные — сибирский генотип, п в настоящее вре мя нами в клещах I. реп>и1с(ии.ч из Кемеровскгн области обнаружен только сибирский генотиг ВКЭ. В Иркутской области из 29 исследован ных штаммов, изолированных в период с 196^ по 1980 гг. были обнаружены по одному образцу европейского и дальневосточного генотипов, ос тальные — сибирского. На современном этапе ирг исследовании клещей /. регяикаШь, собранных нг Байкальском тракте, мы выявили только сибирс кий генотип ВКЭ. Для дальневосточного регион:

Norm. Floro.

ч 1

Рис. 1. Результат детекции на 4-канальном

приборе Rotor Gene 3000. А — детекция штаммов ВКЭ дальневосточного генотипа по каналу FAM, Б — детекция штаммов ВКЭ сибирского генотипа по каналу JOE, В — детекция штаммов ВКЭ европейского генотипа по каналу ROX

характерно преобладание дальневосточного генотипа.

При том, что различными методами типиро-вания в настоящее время выделяют три основные генотипа вируса клещевого энцефалита [2], при накоплении данных по изолятам из разных географически удаленных очагов, где выявляется одинаковый генотип, можно внутри генотипа выявить подгруппы. Такое исследование было проведено нами для штаммов и изолированной РНК сибирского и дальневосточного генотипов. Типируемая РНК ВКЭ относилась к изолятам как начального периода изучения ВКЭ в 30-50-е гг., так и к современным образцам.

Ранее при секвенировании нами 32 штаммов и 8 изолятов сибирского генотипа на участке Е гена длиной 211 н.п., выделенных из клещей I. рег5и\саЫ& и из крови больных с разной клинической формой заболевания или аутопсийного материала от умерших больных КЭ, нами были получены данные о формировании двух кластеров внутри сибирского генотипа, которые мы назвали «европейский» и «азиатский». Азиатский кластер также делится на две группы, в одной из них

условно прототипным штаммом является штамм Васильченко, во второй — штамм Заусаев [3]. На данном этапе мы расширили дифференциальный анализ этих подгрупп, исследовав для части из них полную нуклеотидную последовательность Е гена, и получили аналогичные прежним данные (Рис. 2). Европейская группа ВКЭ сибирского генотипа была дополнена изолята-ми РНК, выделенной нами непосредственно из клещей I. persulcatus, собранных в Вологодской и Свердловской области в 2006 г., а также изо-лятами из Финляндии и Эстонии (данные Gen Bank). Следует отметить, что штаммы европейской группы сибирского генотипа имеет устойчивый аминокислотный маркер в позиции 175 гена Е — N (аспарагин), а 5 из шести секвенирован-ных нами образцов ВКЭ из Вологды (3 штамма и 3 образца РНК, изолированной непосредственно из клещей I. persulcatus) в 234-й позиции Е гена, где остальные последовательности ВКЭ сибирского генотипа имеют аминокислоты Н (гисти-дин) или Q (глутамин), содержат тирозин [3, 4]. Данная мутация является природной, а не возникшей в результате культивирования штаммов.

DQ4 512 96-Kokkola-118 DQ4 512 91-Kokkola-7 9 DQ4 512 92-Kokkola-81 DQ4 912 9в-Kokkola-3 9 DQ451295-Kokkola-102 DQ4 512 94-Kokkola-8 6 DQ451289-Kokkola-26 DQ4 512 88 -Kokkola-2 5 DQ4512 87-Kokkola-9 DQ4512 86-Kokkola-8 DQ4 512 93-Kokkola-84 + V911-Vologda-1974 AJ415 5 65-Latvia-1-96

:V36 5 -Vologda-197 5 Ekaterinburg-2 7-11-20 Of DQ3 93 7 73-Est 54 + V14-Vologda-20 06 ф V4-Vologda-2006

V15-Vologda-2006 DQ486061-EK-328 DQ393774-Est3535 AB 04 9 348 -IR9 9- IjrI AB049350-IR99-2m3 + 20-Irkutsk-2005 1F091006-Alna L40 361-Vasilchenko 4 K34-Kemerovo-1967 1X753582-1467 4 0-ll-Kenerovo-2e05 + V658-Vologda-1975 DQ394 8 77-4 99-Novosibirsk-19 82 + Ekaterinburg-3 5-8-2 00 6 DQ3 94879-1252-HOvosibirsk-190 2 DQ3 94 8 80-3 96-Novosibirsk-19 81 DQ3 94 8 78 -6 91-Hovosibirsk-19 82 KF5 27415 -Zavsaev + Ekaterinburg-14-5-2896 Ekaterinburg-44-2-2 80 6

t- Ekaterinbarg-37-3-2006 B049 3 52-IR9 9-2f7 ÜB849349-IR9 9 1m4 U2749 5-Heudoer f1 X07755-SOÍjin X66694-0MF

'J.I) 2

~olo

Рис. 2. Уровень генетического родства штамма ВКЭ сибирского генотипа на Е гене, 1490 н.п. (/V/, Kimura-2-parameter). I — европейский топовариант, II — азиатский топовариант

Срок существования данной мутации — минимум 30 лет. Устойчивой аминокислотной заменой между группами «Васильченко» и «Заусаев» являются аминокислоты Q или Н в позиции 234 соответственно. В хронологическом порядке штаммы из европейской группы охватывают 60-летний период изучения ВКЭ, азиатской — 45 лет.

При изучении последовательностей ВКЭ, относящихся к дальневосточному генотипу и охватывающих 70-летний период изучения, как отдельные ветви можно рассматривать изоля-ты Oshima и часть изолятов Hokkaido; группу изолятов с Урала и Западной Сибири; дальневосточные изоляты (из Хабаровска и один изо-лят из Владивостока, выделенный из клещей I. persulcatus). К сожалению, единичные изоляты с европейской территории (из Ярославской области, Эстонии и Латвии) не позволяют сделать выводы об их кластеризации. Наибольшим генетическим разнообразием обладают изоляты Hokkaido (Рис. 3). Устойчивые аминокислотные замены, характеризующие группу, обнаружены только у изолятов из группы Oshima и входящих

в нее двух изолятов Hokkaido: 306 а.о. — М—► 462 а.о. V—>М. В позиции 463 гена Е в дальн восточном штамме 205, изолированном в 1973 впервые отмечена замена V—>А. Алании в этс позиции характерен для всех известных штамм< ВКЭ сибирского и европейского подтипа, а таю для многих других вирусов комплекса клещево энцефалита. Эта замена обнаруживается в бол шинстве современных японских штаммов ВК. Эстонской штамм Est 2546 и Sofjin с Дальне Востока разделяет одна нуклеотидная замена i участке в 1200 н.п. гена Е, а со штаммом из сосе, ней Латвии RK1424 у эстонского штамма уже i нуклеотидных замен. Возможно, на территория где не выявлена постоянная широкая циркулящ ВКЭ дальневосточного генотипа, данные штамм не образуют локальной региональной популяци Как показано в вышеприведенных матери, лах исследования, выявляются три основные г нотипа ВКЭ, но на сегодняшний момент суще' твовали два штамма, для которых было трудг точно определить их таксономическое положеш внутри вида. Это штамм 178-79, изолированны в 1979 г. от клещей I. persulcatus в Иркутской of

Mr- ЙВ022296-КН98-5 [~L AB022297-KH98-10 l!jJ— AB022295-KH98-2 I L AB049346-KH99~m9

I_. AB062064 -Sof jin-HO

100 L^ Ob or-4 -Khabarovsk-19 37

r- AB049345-VL99-mil-1999

4 ,- EF02 9053-Ural2 005-3

1—Ij. DQ 393 779 -Est 254 6 4 X07755-Sofjin

- AB23 7192-Kita9 87/99-Hokkaido

AF091019-T-blood-Ural-19 39 ^ Troynik-Ural-1941 AF091013-N132 + Yar-10-Yaroslavl-198 9 ihateev-Kemerоvo-IS 54 ф. Y«B-4 0-Kernerovo-1967 AF091016-RK1424

Vinokurov-Ekaterinburg-1959 '♦jrl^ Bersenev-Ekaterinburg-I960

_iLfi- DQ989 336- 20 5-Far-East-19 73

I- AY17883 3-China<DXSL5)

AF091008-Crimea

J1

.....-:

AB2 3 7188-Hiz66 0/9 7-Hokkaido AB237184-Miz416/97-Hokkaido

AB237191-Oh7ei/97 AB237190-0K698/97 AB23 718 9-Oh696/97 — ABO 22294-Oshiraa-C-1 i— AB02 229 3-0shima-ft-1 AB 0620 63~0shiina5-10 ДВ 022 290 -Oshima5-11 AB237187-Kik629/97Hokkaido AB0 222 91-Oshima3-6 L AB022292-0-1-1 j- AB237186-Kam588/97-Hokkaido 1— AB237185-Kam586/97-Hokkaido

- AB04934 7-D128 3-Khabarovsk -1998

- DQ86 2460-Glyl»innoe -Primor ye - 2004

- AY1820 09-China-Senzang

L40 361-Vasilcbenko

in

U274 95-Neudoer fl - X66 694-

OHF

Рис. 3. Уровень генетического родства штамма ВКЭ дальневосточного генотипа на Е гене, 1490 н.п. (Щ, Ктига-2-рагате1ег)

части, п штамм 886-84, изолированный в 1984 г. )т CI. rufocanus (красно-серой полевки) также в W ркутской области.

Два данных штамма были секвенированы нами ia полноразмерной геномной последовательнос-ги, и затем был проведен сравнительный анализ : другими как полноразмерными последовательностями ВКЭ (Рис. 4 а, 6), так и секвенированны-VIII на определенных участках полипротеина. В эезультате анализа с использованиием программы Mega (версия 3.1) уровня генетического родс-гва полноразмерных нуклеотидной и аминокислотной последовательностей два данных штамма 5ыли отнесены к дальневосточному генотипу. В данном анализе для выявления ппутригруппо-шх и межгрупповых расстояний полноразмер-1ые последовательности ВКЭ каждого генотипа шли объединены в группы с условными названиями ДВ, СИ Б, ЕВР соответственно генотипу. Затем было проведено их попарное сравнение с использованием алгоритма Nucleotide: p-distance 1ля нуклеотидных последовательностей и Amino: 5-distance — для аминокислотных последовательностей. Как видно из данного анализа, уровень нуклеотидных п аминокислотных замен с из-

вестными генотипами у обоих секвенированных штаммов приближается к границе разделения генотипов.

При отдельном анализе по каждому из трех структурных и пяти неструктурных генов штаммы 178-79 и 886-84 с наибольшим значением числа bootstrap кластеризовались с группой дальневосточных штаммов.

Также интересным с точки зрения молекулярной биологии является обнаружение чередования в этих штаммах аминокислот, характерных для двух или даже для трех генотипов в пределах одного гена. Ранее нами при анализе штаммов вируса омской геморрагической лихорадки, полученных с территории Омской, Новосибирской и Курганской областей, были обнаружены штаммы из Курганской (1992 г.) и Омской (2004 г.) областей, отличающиеся от остальных изолятов на 12% по нуклеотидному составу на участке Е гена длиной 580 н.п [5]. Данные штаммы имели аминокислотные замены, характерные для других вирусов комплекса клещевого энцефалита, включая и ВКЭ, на исследуемом участке. Возможно, к таким изолятам необходимо применить методы сравнительного анализа с другими

а)

£с

I» L-

- DQ989336-205

— Яв0(2вб3-0«1>1ш-3-1в

- №062064-Sofjin-H) DQ862460-Gljbinjnc

— J0íl820í9-China (Senzane)

e

- + EF4«96<1-178-79 + EF469662-886-84 DQ486861-EK-328 L4 0 361-Vasilchen£o HF527415-Zau¡>aev U39292-H*pr U27491-strain2í3 U27495-Heudoertl - HC 0Q5062-OHF

У foleta МММ шугря КДХЯЭГ4 КЮТ1Ш Уроки» :и*кх*хяу геюпагжх

ДВ 53 ДВ СИБ ЕВР 178-79

СИБ «/> ДВ

ЕВР СИБ 14.6

ЕВР 1*4

178-79 ИЗ 143 16,2

886-84 \гв IV 1*6 11,8

6)

AB062064 -Sofá in-KO . AB062063-0shima-5-10

DQ989336-203 — DQ862i60-Glyfaimoe

I- АУ1В2009-СМП4 (Senzaig)

- + EF469661-178-79

- + EF469662-886-84 DQ486861-EK-328

- L10361-VasilcJenko . AF327413-Zauaev

V27493-Heudoer£l lB7491-«train263

U39292-Hypr . HC 003062-mff-

Урогеа шеи Bíyrjr иякгопютпи У poiea 1и*ИИе*Зуг*ЮВСияИ

ДВ ДВ СИБ ЕВР 178-79

СИБ 1.7 ДВ

ЕВР 13 СИБ 5Я

ЕВР 63 S?

178-79 33 4Í 63

886-84 33 43 62 33

Puc. 4. Уровень генетического родства штаммов ВКЭ:

а) на кодирующей области полипротеина (10242 н.п.) (NJ, Kimura-2-parameter);

б) полной последовательности полипротеина (3414 а.о.) (NJ,Amino:p-distance).

Уровень замен внутри каждого генотипа и между генотипами рассчитан в программе Mega (версия 3.1) с применением модели Nucleotide: p-distance, Amino: p-distance