CC BY
14
DOI 10.31588/2413-4201-1883-241-1-95-99
УДК 619:616-001.28/29:579
РАЗРАБОТКА РАДИОМОДИФИЦИРОВАННЫХ МУТАНТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РАДИАЦИОННЫХ
ПОРАЖЕНИЙ ЖИВОТНЫХ
Ишмухаметов К.Т.1 - к.б.н., Низамов Р.Н.1 - д.в.н., профессор, Саитов В.Р.1 - д.б.н., Василевский Н.М.1 - д.в.н., профессор, Шакуров М.М.1 - к.б.н., Гасанов А.С.2 - д.б.н., профессор
1ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» 2ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины
имени Н.Э. Баумана»
Ключевые слова: e.coli, b.bifidum, радиомодификация, радиозащитные препараты Keywords: e.coli, b.bifidum, radiomodification, radioprotective drugs
Микроорганизмы, относящиеся к нормофлоре человека и животных, играют важную роль в жизнедеятельности организма-носителя, а именно в полезном воздействии продуктов метаболизма, защите против чужеродных агентов, нормализации его микробаланса [7]. Использование микробных агентов может благоприятно повлиять на исход заболевания при патологическом состоянии организма [2], снизить смертность животных при облучении, способствовать формированию радиорезистентности [3]. В процессе жизнедеятельности бактерии продуцируют ферменты, антигены, энтеро-, экзотоксины, цитокины, которые в отдельности и в сочетании друг с другом обладают радиозащитными свойствами [7]. Облучение микроорганизмов может вызвать изменение выработки метаболитов, таких как антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. [1, 4, 5, 6, 7].
Цель исследований - получение ра-диомодифицированных мутантов E.coli и B.bifidum для профилактики и лечения радиационных поражений животных.
Материал и методы исследований. В качестве исходного материала использовали лиофилизированную монокультуру «Бифидумбактерин» и лабораторный штамм Escherichia coli «ПЛ-6». Микроорганизмы культивировали при 37±1оС в питательных средах МПБ, МПА (E.coli) и Блаурокка (B.bifidum). Моделирование радиационного воздействия осу-
ществляли на гамма-установке «Исследователь» с источниками излучения 60Со и мощностью воздействия 0,022 А/кг.
Диапазон доз для E.coli составлял 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0 кГр; для B.bifidum -0,01; 0,02; 0,04; 0,08; 0,16; 0,32; 0,6; 1,2; 2,4; 4,8 кГр.
После радиационного воздействия микроорганизмы высевали в питательные среды и через 96 часов учитывали рост ко-лониеобразующих единиц (КОЕ). При наличии единичных колоний наращивание биомассы проводили повторным пересевом микробов до появления сплошного роста культуры, что свидетельствовало о развитии радиорезистентности культур.
Изучение морфологических свойств микроорганизмов проводили общепринятыми методами.
Взвеси микробов радиорезистентных вариантов E.coli (Дю) и B.bifidum (Дб) в культуральной жидкости в концентрации 1,0х10-10 м.к./мл и культуральные жидкости без бактерий были использованы для приготовления формол-препаратов, которые были инактивированы добавлением 0,3-0,5 %-ного нейтрального формалина и стабилизированы термостатированием при 37 оС в течение 30 минут.
Полученные препараты исследовали на стерильность посредством посева на питательные среды; безвредность - внут-рибрюшинным введением 0,5 см3/гол 30 белым мышам; раздражающее и сенсиби-
лизирующее действие формол-препаратов оценивали на 6 белых кроликах, которым препараты наносили на слизистую ротовой полости и глаз, проводили внутрикожную инъекцию и внутривенное двукратное введение с интервалом 22 суток.
Моделирование лучевой болезни тяжелой степени (ЛД100/30) осуществляли однократным облучением животных на гамма-установке «Пума» в дозе 7,7 Гр с мощностью 0,82 А/кг. Радиозащитную активность препаратов оценивали на 100 белых мышах массой 18-20 г, разделенных на 10 групп. Животным 1-4 групп препараты вводили за 1 сутки до облучения однократно подкожно в дозе 0,1 см3/гол, 5-8 групп - аналогично через 1 сутки после радиационного воздействия. Мыши 9-й и 10-й групп служили контролем облучения и биологическим контролем.
Результаты исследований. После облучения кишечной палочки в дозах 0,5 и 1,0 кГр наблюдали сплошной рост колоний (табл. 1); 2,0 кГр - на чашках Петри регистрировали разряженные пространства; при 4,0 кГр наблюдали единичные колонии, которые переходили в сплошной рост после пятикратного пассирования. Доза 6,0 кГр являлась стерилизующей.
Облучение B.bifidum 1 в дозах 0,010,32 кГр не повлияло на рост культуры; при дозе 0,6 кГр на столбиках 0,75 %-ного агара Блаурокка регистрировали разряженные пространства, которые выглядели менее плотным после воздействия в дозе 1,2 кГр; при дозе 2,4 кГр вырастали единичные колонии, которые после 7 пассирования образовывали сплошной рост; доза 4,8 кГр являлась стерилизующей (Табл.1).
Таблица 1 - Радиомодифицирующее действие у-лучей на бактерии (кГр)
Вид бактерий Показатели роста колоний
СР РК ЕК РО
E.coli («ПЛ-6») 0,5-1,0 2,0 4,0 6,0
B.bifidum (1) 0,01-0,32 0,6-1,2 2,4 4,8
Примечание: СР - сплошной рост колоний; РК - разреженные колонии; ЕК - единичные колонии; РО - рост отсутствует
Сравнение радиоустойчивых бактерий E.coli (R10) и B.bifidum (R6) с необлу-ченными аналогами показало следующее: E.coli (R10) на твердых средах образовывали колонии с шероховатыми краями различной величины, на препаратах микробы отличались увеличением размеров, неровностью структуры, полиморфностью и плотностью; B.bifidum (R6) были полиморфны, неоднородны, дискообразны, имели толщину 0,5-0,8 и диаметр - 1,0-1,5 мм. В суспензионной и культуральной
жидкостях E.coli (Дю) содержалось в 1,80 и 2,51 раза больше дезоксирибонуклеино-вой кислоты; пероксидазная активность была выше в 2,18 и 1,67 раза; исходные бактерии не продуцируют ферменты супе-роксиддисмутазу и каталазу, но эти свойства приобрели бактерии E.coli (Дю), в суспензионной и культуральной жидкостях которых содержалось супероксид-дисмутазы и каталазы соответственно 1,95±0,15 и 0,97±0,09 м.к.М/г и 21,51±0,75 и 27,38±0,59 м.кат/г/мл (Табл. 2).
Таблица 2 - Содержание дезоксирибонуклеиновой кислоты, ферментов супероксиддисмута-
зы, каталазы и пероксидазы у бактерий E.coli «ПЛ-6» и (R10)
Вид бактерий ДНК, мкг/1,0Е9 м.к. СОД, м.к.М/г КАТ (Е-2), м.кат/г/мл АП (Е-4), с-1 мг-1
E.coli «ПЛ-6» 8,5/3,3 0,0/0,0 0,0/0,0 1,1/0,3
E.coli (R10) 15,3/8,7 1,95/0,97 0,22/0,27 2,4/0,5
Примечание: ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; СОД - супероксиддисмутаза; КАТ каталаза; АП - пероксидаза
В культуральной жидкости радиорезистентных бактерий содержалось больше аминокислот: в 2,0 раза глицина, 1,8 раза - серина и в 2,3 раза - цистеина (Табл. 3). У радиоустойчивых бифидобак-терий, по сравнению с нативными, было зарегистрировано увеличение содержания
антиокислительного фермента перосидазы: в клеточной суспензии в 2,05 раза, в экстракте - в 2,14 раза, в культуральной жидкости - в 1,45 раза. Активность антиокислительного фермента пероксидазы в клеточной суспензии была максимальной -0,000343 с-1мг-1 (Табл. 4).
Таблица 3 - Содержание аминокислот в культуральной жидкости бактерий E.coli «ПЛ-6» и (К-ю) (с-1мг-1)_
Вид бактерий Глицин Серин Цистеин
Е.соН «ПЛ-6» 1,07±0,21 0,009±0,001 1,10±0,13
Е.соН (К10) 2,13±0,13 0,016±0,001 2,57±0,34
Таблица 4 - Пероксидазная активность бактерий B.bifidum 1 и (Кб) (с"1мг"1)
Вид бактерий Содержание пероксидазы в субстратах (1,0х10-4)
КС КЭ КЖ
B.bifidum 1 1,69±0,1 0,35±0,04 0,31±0,03
B.bifidum 1 (Кб) 3,47±0,2 0,75±0,08 0,45±0,05
Примечание: КС - клеточная суспензия; КЭ - клеточный экстракт; культуральная жидкость
Активность фермента глютати-онпероксидазы у радиоустойчивого штамма кишечной палочки была в 3,55 раза и у бифидобактерий в 5,34 раза выше. На основе полученных радиомодифицирован-ных вариантов Е.соН и B.bifidum были изготовлены 4 варианта радиопротектирую-щих препаратов, которые были исследованы на стерильность, безвредность и адге-зивность.
Образцы препаратов, помещенные в бактерийные среды, в течение 10 суток оставались стерильными - роста микробной и грибковой флоры не было зарегистрировано.
Внутрибрюшное введение формол-препаратов белым мышам не повлияло на аппетит и поведенческие реакции у животных; содержание эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов в периферической крови мышей оставалось в пределах физиологической нормы.
Нанесение препаратов кроликам на слизистые оболочки ротовой полости и глаз, внутрикожное и внутривенное применение показало отсутствие раздражающего и сенсибилизирующего действий.
Изучение противорадиационных свойств препаратов при профилактическом (за 1 сутки до) и лечебном (через 1 сутки после облучения) применении показало,
что таковые при любом их использовании повышали, как среднюю продолжительность жизни, так и процент выживших животных. Выживание 80 % животных достигалось при использовании препаратов, изготовленных из радиомодифицирован-ных бактерий Е.соН (Кю). Количество выживших животных при применении B.bifidum (Кб) составляло 60 %. Все мыши группы контроля облучения пали. Средняя продолжительность жизни животных:
- при профилактическом применении бактериальной массы Е.соН (Кю) составляла 17,5 суток;
- при профилактическом применении бактериальной массы B.bifidum (Кб) -16 суток;
- при профилактическом применении культуральной жидкости Е.соН (Кю) -15 суток;
- при лечебном применении бактериальной массы Е.соН (Дю) - 14,5 суток;
- при лечебном применении культу-ральной жидкости Е.соН (Кю) - 12,5 суток;
- при лечебном применении бактериальной массы B.bifidum (Кб) в культу-ральной жидкости - 14,5 суток;
- при профилактическом применении культуральной жидкости B.bifidum (К6) - 12,5 суток;
- при лечебном применении культу-
ральной жидкости В.Ы1Ыит (Дб) - 12,5 суток;
- средняя продолжительность жизни только облученных животных составляла 6,9 суток.
Заключение. Получены стабильные радиорезистентные бактерии E.coli (Дю), выживающие при дозе 4 кГр (превышение исходного уровня в 2,14 раза) и бактерии B.bifidum (Дб), выживающие при дозе 2,4 кГр (превышение исходного уровня в 2,5 раза).
Штаммы образовывали колонии с шероховатыми краями различной величины, отдельные микробы на препаратах отличались увеличением размеров, неровностью структуры, полиморфностью и плотностью.
У радиомодифицированных штаммов кишечной палочки, по сравнению в нативной культурой в суспензионной и культуральной жидкостях содержалось в 2,18 и 1,67 раза больше пероксидазы и в
I,80 и 2,51 раза - дезоксирибонуклеиновой кислоты; в культуральной жидкости: в 2 раза - глицина; 1,8 - серина и 2,3 раза -цистеина.
Биохимические исследования куль-туральных жидкостей исходных препаратов показали, что содержание фермента глютатионпероксидазы у бактерий Е.соН (Дю) и B.Bifidum (Дб) было в 3,55 и 5,34 раза выше, чем у исходных микроорганизмов. Формол-препараты, изготовленные из бактерийных масс и продуктов их метаболизма, обладали противорадиационными свойствами, защищая 60-80 % летально облученных животных, увеличивая среднюю продолжительность жизни павших до
II,5-17,5 дней.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бойко, С.С. Изучение влияния ультразвукового воздействия на споро- и
неспорообразующие бактерии / С.С. Бойко, Е.С. Яценко // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. - 2018. - Т. 14. - № 1. - С. 102-105.
2. Бухарин, О.В. Взаимодействие Bifidobacterium bifidum с представителями нормальной микрофлоры в микросимбио-ценозе кишечника человека / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. - 2012. - № 3. - С. 4.
3. Гребенюк, А.Н. Основы радиобиологии и радиационной медицины / А.Н. Гребенюк [и др.] // Уч. пособие. С.-П., 2012. - 225 с.
4. Данилова, А.Н. Влияние лазерного излучения на молочнокислые бактерии /
A.Н. Данилова [и др.] // Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья. -2017. - № 12. - С. 12-14.
5. Морозов, И.И. О природе явления реактивации выживаемости бактерий Echerichia coli на поздних этапах инкубации в солевом буфере после воздействия ионизирующего излучения / И.И. Морозов,
B.Г. Петин // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2008. - Т. 48. - № 5. - С. 600-605.
6. Морозов, И.И. Влияние высокоинтенсивного ионизирующего излучения на жизнеспособность бактерий Escherichia coli, культивируемых в солевом буфере без питательных добавок / И.И. Морозов, Г.В. Морозова, В.Г. Петин // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2005. - Т. 45. -№ 3. - С. 305-309.
7. Старовойтова, С.А. Иммунобио-тики и их влияние на иммунную систему человека в норме и при патологии / С.А. Старовойтова, А.В. Карпов // Биотехнология. Теория и практика. - 2015. - № 4. - С. 10-20.
РАЗРАБОТКА РАДИОМОДИФИЦИРОВАННЫХ МУТАНТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РАДИАЦИОННЫХ
ПОРАЖЕНИЙ ЖИВОТНЫХ
Ишмухаметов К.Т., Низамов Р.Н., Саитов В.Р., Василевский Н.М., Шакуров М.М., Гасанов А.С.
Резюме
Воздействием последовательно увеличивающихся доз у-излучения получены стабильные радиорезистентные бактерии, выживающие при дозах 4,0 (E.coli «R10») и 2,4 кГр (B.bifidum «R6»). В отличие от исходных микроорганизмов радиорезистентные бактерии имели большее содержание ДНК, ферментов: супероксиддисмутазы, каталазы, глютатионпе-роксидазы, аминокислот глицина, серина, цистеина. Изготовленные из радиорезистентных штаммов препараты, отвечали серологическим требованиям, обладали противорадиационными свойствами, защищали 60-80 % летально облученных животных, до 11,5-17,5 суток увеличивали среднюю продолжительность жизни павших против 6,9 суток в группе контроля облучения.
DEVELOPMENT RADIOMODIFICATING OF MUTANTS OF MICROORGANISMS FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF RADIATION INJURIES OF ANIMALS
Ishmukhametov K. T., Nizamov R. N., Saitov V. R., Vasilevsky N. M., Shakurov M.M.,
Gasanov A.S.
Summary
Stable radioresistant bacteria surviving at doses of 4 (E.coli «R10») and 2,4 kGy (B.bifidum «R6») were obtained by exposure to consistently increasing doses of gamma radiation. In contrast to the original microorganisms, radioresistant bacteria had a higher content of DNA, superoxide dismutase enzymes, catalase, glutathione peroxydaze, amino acids glycine, serine, cysteine. Made of radiorai-stetnih strains of drugs, serological answered the requirements, the area given radiation properties, protected 60-80 % lethal ob-tained the animals to 11,5 to 17,5 days increased the average life expectancy of dead animals versus 6.9 days in the control group exposure.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-241-1-99-103 УДК 619:661.982:616.61
АКТИВНОСТЬ НИТРОКСИДЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ КОШЕК И СОБАК ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ
Каримова Р.Г. - профессор, д.б.н., Белова А.А. - аспирант
ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины
имени Н.Э.Баумана»
Ключевые слова: оксид азота (II), нитроксидергическая система, хроническая почечная недостаточность, биохимический анализ, калий, натрий, хлор, мочевина, креатинин, общий белок, кошка, собака
Keywords: nitric oxide (II), nitroxydergic system, chronic renal failure, biochemical analysis, potassium, sodium, chlorine, urea, creatinine, total protein, cat, dog
В России наиболее распространен- наблюдаются различные патологии почек,
ными домашними животными являются приводящие к хронической почечной не-
кошки и собаки, у которых чаще всего достаточности (ХПН). В основном данную
