CC BY
185
УДК 619:616.98:579.843.95-078:636.2
РАЗРАБОТКА ПЦР - ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ГЕНОТИПИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА PASTEURELLACEAE*
А.Г. ГЛОТОВ, доктор ветеринарных наук, зав. отделом
А.В. НЕФЕДЧЕНКО, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник
Т.И. ГЛОТОВА, доктор биологических наук, зав. лабораторией
Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии
E-mail: glotov_vet@mail.ru
Резюме. Среди крупного рогатого скота на молочных комплексах в Сибири преобладающий генотип бактерии Pasteurella multocida - генотип А. При разработке противоэпизоотических мероприятий важно учитывать наличие циркуляции различных генотипов бактерии. Исследования проводили с целью разработки тест-системы для выявления и генотипирования бактерий на основе полимеразной цепной реакции. Для детекции генетического материала бактерий Pasteurella multocida пяти серогрупп и Mannheimia haemolytica рассчитали и синтезировали специфические олигонуклеотидные праймеры, выбранные на консервативные последовательности геномов бактерий в базе данных NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), позволяющие отличать их от близкородственных видов и серогрупп. В работе использовали три референтных штамма Pasteurella multocida №№ 1231, 681 и Т80, пробы биоматериала от больныхживотных, а также культуры бактерий, выделенные в ходе диагностических исследований. Аналитическая чувствительность полимеразной цепной реакции для Pasteurella multocida всех серогрупп составила 104 КОЕ/мл, а для Mannheimia haemolytica - 103 КОЕ/мл. Полимеразная цепная реакция эффективна на всех стадиях бактериологических исследований. С ее помощью можно дифференцировать выделенные культуры Pasteurella multocida на генотипы, а также проводить различия между Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica. Ключевые слова: крупный рогатый скот, респираторные болезни, пастереллез, полимеразная цепная реакция, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, генотипы.
Проблема респираторных инфекций приобретает большую актуальность в условиях современного промышленного животноводства. Их возникновению способствуют повышение молочной продуктивности коров, нарастающие темпы импорта крупного рогатого скота и сосредоточение большого количества животных на ограниченных территориях.
В возникновении бронхопневмоний укрупного рогатого скота (КРС) большую роль играют представители семейства Pasteurellaceae: грамотрицательные, факультативно анаэробные палочкообразные бактерии - комменсальные обитатели поверхности слизистых оболочек верхнего респираторного тракта, способные вызывать вторичные инфекции и болезни. Семейство включает 6 родов, но наибольшую роль в патологии КРС играют представители Mannheimia spp. и Pasteurella spp., а именно виды Mannheimia haemolytica и Pasteurella multocida [1]. Последний включает 5 капсульных серотипов, но бронхопневмонии у телят чаще вызывают А и С. Эти болезни распространены повсеместно, приводят к гибели, снижению скорости роста, привесов и молочной продуктивности животных. Они не имеют выраженной сезонности и регистрируются чаще у молодняка 1-6-месячного возраста [1].
Существование пяти серологических типов Pasteurella multocida затрудняет диагностику и планирование меро-
приятий по специфической профилактике болезней, особенно в хозяйствах с импортированным высокопродуктивным племенным скотом. Бактериологический метод диагностики на основании изучения биохимических свойств бактерий и определения их патогенности для белых мышей не позволяет проводить типирование патогенов.
На сегодняшний день одно из перспективных направлений развития лабораторной диагностики - разработка методов генотипирования, в частности, с использованием мультиплексной ПЦР, позволяющих одновременно выявлять все серотипы бактерий [2].
В Российской Федерации такие исследования практически не проводят. В доступной нам литературе имеется только одна работа, посвященная индикации пяти серотипов бактерии при помощи электрофорезной ПЦР [3].
Цель наших исследований разработка тест-системы на основе ПЦР для быстрого выявления и генотипирова-ния бактерий семейства Pasteurellaceae, выделенных от больных животных.
Условия, материалы и методы. В работе использовали референтные штаммы P. multocida №№ 1231, 681 и Т80, полученные из коллекции культур микроорганизмов ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (г. Москва), пробы биоматериала от больных животных, а также культуры бактерий, выделенные в ходе диагностических исследований.
Выделение чистых культур бактерий осуществляли методом последовательных десятикратных разведений. Для определения их патогенности использовали беспородных белых мышей массой 18...20 г, которым внутрибрюшинно вводили взвесь бактериальных культур в дозе не менее 0,2х1010 КОЕ/мл. Суспензии чистых культур бактерий хранили при - 80 оС.
Перед исследованием все штаммы и изоляты бактерий культивировали в течение 24.48 ч на мясопеп-тонном агаре с добавлением 5 % крови овец при 37 0С в атмосфере 5 % СО2.
Выделение ДНК проводили при помощи коммерческого набора «Рибо-преп» (Интерлабсервис).
Для детекции генетического материала бактерий P. multocida пяти серогрупп и M. haemolytica методом ПЦР были рассчитаны и синтезированы специфические олигонуклеотидные праймеры. Для этого в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) были выбраны консервативные последовательности геномов бактерий, позволяющие отличать их от близкородственных видов и серогрупп.
ПЦР проводили в реакционной смеси объемом 30 мкл следующего состава: 5 мкл ДНК; 1xTaq буфер без Mg2+ (ООО «Лаборатория Медиген»), 3,3 mM MgCl2, 0,4 mM dNTP, 0,15 цМ каждого праймера, 1,5 е.а. SmartTaq ДНК-полимераза, вода - до 30 мкл. Поверх пробы наносили минеральное масло. Амплификацию осуществляли на приборах «Терцик» (ДНК-технология) и Mastercycler pro (Eppendorf) при следующем режиме: 1 цикл 95 0С - 5 мин.; 45 циклов 950 С - 20 сек., 570 С -30 сек., 720 С - 40 сек.; 1 цикл 720 С - 7 мин. Амплифици-рованные ДНК-фрагменты разделяли в 2 %-ном агарозном геле с бромистым этидием. Для визуализации ис-
*Работа частично выполнена в рамках соглашения № 8792 между Министерством образования и науки РФ, Россельхоза-кадемией и ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии о предоставлении гранта в форме субсидии.
58 --------------------------------------- ____________ Достижения науки и техники АПК, №12-2013
пользовали фотодокументирующую систему Molecular Imager ChemiDoc XRS System 170-8170 (Bio-Rad).
Аналитическую чувствительность метода определяли, используя десятикратные разведения положительных контрольных образцов референтных штаммов бактерии с исходной концентрацией 108.. ,1010 КОЕ/мл.
Секвенирование фрагментов ДНК проводили с помощью наборов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems). Продукты анализировали методом капиллярного электрофореза в автоматическом секве-наторе ABI PRISM® 3130xl (Applied Biosystems/Hitachi), нуклеотидные последовательности - с помощью пакетов программ Vector NTI 10.3.0 (Invitrogen Corporation), а также DNASIS и Lasergene (DNASTAR, Inc.) Полученные последовательности сравнивали с представленными в базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Результаты и обсуждение. Аналитическая чувствительность ПЦР для M. haemolytica составила 103К0Е/мл, для P. multocida всех серогрупп - 104 КОЕ/мл.
Разработанная ПЦР для выявления и дифференциации 5 серогрупп бактерий P. multocida и М. haemolytica А1 обладает высокой специфичностью, а также позволяет дифференцировать М. haemolytica от бактерий близкородственных видов. Продукты амплификации соответствовали рассчитанным. Результаты исследований методом ПЦР с представителями других семейств были отрицательными.
Изучение биоматериала от больных телят показало, что геном патогенных бактерий P. multocida присутствовал в 28,1 % проб органов респираторного тракта, а M. haemolytica - в 20,2 %. P. multocida выявили в 46,8% проб легких, 18,7 % бронхиальных лимфоузлов и селезенки. M. haemolytica установили только в легких больных животных. В некоторых случаях отмечали ДНК двух бактерий одновременно.
При изучении эффективности ПЦР на этапах бактериологической диагностики геном P. multocida выявили в 14 культурах бактерий, выделенных из 15 положительных в ПЦР проб легких, и в 11 культурах, реизо-лированных из внутренних органов белых мышей. Из 4 отрицательных в ПЦР культур бактерий наличие генома P. multocida выявили в трех, полученных при первичном посеве и повторно реизолированных от белых мышей. В 4 случаях P. multocida не удалось реизолировать от мышей, зараженных положительными культурами, что, вероятно, связано с их низкой патогенностью.
При капсулярном типировании бактерий установлено, что среди них преобладают микроорганизмы с генотипом А, геном которого присутствовал в 6Q % проб легких больных телят. От них на искусственных питательных средах выделили 18 культур, но на этапе реизоляции от белых мышей ПЦР дала положительный результат только в 14 из них. В своих исследованиях мы не выявили бактерий P. multocida серогрупп В, Е и F.
Полученные результаты в общем виде согласуются с данными [2] однако постановка реакции в нашем варианте требует проведения двух раундов, что, на наш взгляд, повышает ее чувствительность и специфичность. На первом этапе для предварительной диагностики мы рекомендуем использовать диагностические группоспецифические праймеры, общие для всех серогрупп P. multocida, отдельно для генотипирования бактерий серогруппы А, D и M. haemolytica, а на втором - для генотипирования капсульных серогрупп В, Е и F. Кроме того, дополнительно мы разработали и использовали праймеры (sodA) для генотипирования изолятов M. haemolytica.
Разработанную ПЦР можно использовать в ветеринарных лабораториях как простой, доступный и легко воспроизводимый метод диагностики, который дает возможность выявлять и генотипировать бактерии семейства Pasteurellaceae на всех этапах диагностики. Кроме того, она пригодна для использования в научных целях при исследованиях по молекулярной эпизоотологии болезней, вызванных бактериями этого семейства, для изучения филогеографического распространения различных генотипов бактерий.
Выводы Чувствительность ПЦР с группоспецифическими праймерами составляет 1Q3-4 КОЕ/ мл. Реакция специфична только P. multocida и M. haemolytica.
ПЦР эффективна для выявления генома бактерий на всех стадиях бактериологических исследований проб биоматериала. С ее помощью можно различать серогруппы А, D, B, E и F бактерий P. multocida, проводить идентификацию P. multocida и M. haemolytica.
Преобладающий генотип P.multocida, циркулирующий среди крупного рогатого скота на молочных комплексах в Сибири, - генотип А. Наличие циркуляции двух различающихся генотипов бактерии среди животных на молочных комплексах необходимо учитывать при разработке противоэпизоотических мероприятий.
Литература.
1. Шегидевич Э.А. Роль пастерелл в респираторной патологии овец и крупного рогатого скота: авторефератдисс...докт. ветеринар. наук. М., 1993. 42 с.
2. Townsend K.M., Frost A.J., Lee C.W., Papadimitriou J.M., Dawkins J.S. Development of PCR assays for species-and type-specific identification of Pasteurella multocida isolates //Journal of Clinical Microbiology. 1998. № 36. Р.1096-1100.
3. Шибаев М.А. Разработка и применение методов молекулярной биологии для выявления возбудителей бактериальных респираторных инфекций крупного рогатого скота: автореферат дисс.канд. ветеринар. наук. Владимир, 2010. 16 с.
DEVELOPMENT OF PCR - TEST SYSTEM FOR DETECTION AND GENOTYPING OF BACTERIA
PASTEURELLACEAE FAMILY A.G. Glotov, A.V. Nefedchenko, T.I. Glotova
Summary. The aim was to develop a test system based on the polymerase chain reaction. To detect the genetic material of bacteria Pasteurella multocida five serogroups and Mannheimia haemolytica specific oligonucleotide primers, selected on the conserved sequences genomes of bacteria in the database NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), distinguishing them from closely related species and serogroups, were calculated and synthesized. We used three reference strains Pasteurella multocida № №: 1231, б81 and T8Q, biomaterial samples from sick animals, as well as the culture of bacteria isolated by us during the course of diagnostic studies. The results of development and study of the diagnostic efficiency of the test system based on the polymerase chain reaction for detection and genotyping of Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica, isolated from diseased animals in the territory of Siberia, were demonstrated. Analytical sensitivity of polymerase chain reaction for Pasteurella multocida all serogroups was 1Q4 CFU / ml, and for Mannheimia haemolytica -1Q3 CFU/ml. Polymerase chain reaction is effective at all stages of bacteriological -ray studies. You can use it to differentiate isolates Pas-teurella multocida on genotypes, as well as to distinguish Pasteurella multocida and Mannheimia haemolytica. The predominant genotype of cattle dairy complexes in Siberia is the genotype A bacterium Pasteurella multocida. It is important to consider the presence of different genotypes of circulating bacteria in developing anti-epizootic measures.
Keywords: cattle, respiratory disease, pasteurellosis, polymerase chain reaction, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, genotypes.
Достижения науки и техники АПК, №12-2013
Б9
