CC BY
68
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ♦ микробиология ♦
Для цитирования: Нефедченко, А.В. Поиск новых методов определения патогенности бактерии Pasteurella multocida / А.В. Нефедченко, УДК 619:579.843.95-078
А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, Т.Е. Судоргина, О.В. Семенова, С.В. Котенева, Никонова А.А. // Российский ветеринарный журнал. — 2017. — № 9. — С. 28-32.
For citation: Nefedchenko A.V., Glotov A.G., Glotova T.I., Sudorgina T.E., Semenova O.V., Koteneva S.V., Nikonova A.A., Search for New Methods for Determining the Pathogenicity of the Bacteria Pasteurella multocida, Rossijskij veterinarnyj zhurnal (Russian veterinary journal), 2017, No. 9, pp. 28-32.
Поиск новых методов определения патогенности бактерии Pasteurella multocida
A.B. Нефедченко, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии—диагностический центр ([email protected]), А.Г. Глотов, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией биотехнологии—диагностический центр ([email protected]), Т.И. Глотова, доктор ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории биотехнологии — диагностический центр ([email protected]), Т.Е. Судоргина, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии — диагностический центр ([email protected]), О.В. Семенова, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии — диагностический центр ([email protected]), С.В. Котенева, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии — диагностический центр ([email protected]), А.А. Никонова, младший научный сотрудник лаборатории биотехнологии — диагностический центр ([email protected]).
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук, Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (630501 Новосибирская область, Новосибирский район, Краснообск, а/я 463)
Бактерия Pasteurella multocida играет большую роль в патологии респираторных органов крупного рогатого скота (КРС). Протеин OmpH является протективным антигеном бактерии и хорошо изучен у штаммов, изолированных от птиц. В доступной литературе отсутствуют данные об изучении последовательностей гена этого протеина у изолятов, выделенных от КРС с респираторной патологией. Описаны только некоторые гены, ассоциированные с вирулентностью бактерии для этого вида животных. Отсутствуют сведения о частоте выявления этих генов у изолятов, выделенных из пораженных легких КРС, и их связи с патогенностью изолятов бактерии для лабораторных животных.
Цель работы. Изучить частоту выявления CJmpH-типов у изолятов P. multocida, выделенных от телят с респираторной патологией, и определить новые методы и подходы для оценки их патогенности. Материалы и методы. Работу выполняли с 2006 по 2014 гг. Исследовали изоляты P. multocida (83), выделенные на кровяном агаре с добавлением 5 % дефибринированной овечьей крови в пробирках, которые инкубировали в атмосфере 5 % СО2при 37 °С в течение 24 ч из легких телят с респираторной патологией из 23 хозяйств молочного направления различных регионов Западной Сибири. У изолятов P. multocida определяли вариабельные фрагменты гена OmpH и три гена вирулентности посредством ПЦР. Специфичность реакции подтверждали секвенированием ампликонов, используя набор реагентов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, США). Продукты реакции анализировали методом капиллярного электрофореза в автоматическом секвенаторе ABI PRISM® 3130xl (Applied Biosystems, США) с последующим выравниванием последовательностей и проведением филогенетического анализа по методу присоединения соседей в программах MEGA 5 и Lasergene 7. Определяли патогенность изолятов P. multocida для беспородных мышей.
Результаты. Все изоляты бактерии P. multocida принадлежали двум капсульным группам А (63) и D (20). Среди изолятов группы А выявили 6 OmpH-типов (А1...А6), но наиболее распространенными были А1 и А2. Изоляты группы D принадлежали одному OmpH-типу. В 16 из 23 хозяйств были выявлены изоляты только одного OmpH-типа, в 4 — двух типов, а в 3 — трех типов. Ген hgbb достоверно чаще выявляли у изолятов с высокой патогенностью для белых мышей. ПЦР на этот ген можно использовать для выявления высокопатогенных изолятов бактерии.
Ключевые слова: РазЬвшвПа тпкос1йа, полимераз-ная цепная реакция, аллели, крупный рогатый скот, гены патогенности, лабораторные животные, респираторные болезни.
Сокращения: ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, КОЕ — колониеобразующие единицы, КРС — крупный рогатый скот, ПЦР — полимеразная цепная реакция.
Введение
В условиях интенсивного ведения молочного животноводства большое значение приобретают респираторные болезни, снижающие показатели экономической эффективности отрасли. В возникновении бронхопневмоний у КРС большую роль играет бактерия Р. ти1ьоа-йа [4, 9, 10, 14]. Болезни, вызванные этой бактерией, не имеют выраженной сезонности и регистрируются чаще у молодняка 1.. .6 мес на фоне стрессов, вирусных
инфекций и неудовлетворительных условий содержания и кормления их [1, 2, 7].
РазЬвшвПа тикоайа — грамотрицательная, неподвижная, факультативно анаэробная коккобактерия, являющаяся частью комменсальной микрофлоры верхних дыхательных путей домашних и диких животных [13]. У нее выявлено 5 капсульных групп (А, В, О, Е и F), имеющих различное эпизоотологическое значение для животноводства. Штаммы бактерий капсульных групп А и О — это основные этиологические агенты «вторичного» пастереллеза, участвуют в возникновении массовых респираторных болезней у телят и реже у взрослых животных, причиняют значительный экономический ущерб скотоводству во всем мире [22], в том числе в Российской Федерации [3]. Штаммы кап-сульной группы В вызывают «геморрагическую септицемию», которая регистрируется в основном в странах Азии и Африки [13].
Один из методов профилактики болезней, вызываемых P. multocida, — иммунизация животных. В РФ для этой цели в основном применяют вакцины, изготовленные из штаммов капсульной группы В, реже А и О. Эффективность их, особенно первых, не всегда бывает высокой, что связано не только с условно-патогенной природой возбудителя, но и несоответствием между антигенными профилями вакцинных и полевых штаммов, циркулирующих в конкретном хозяйстве [8].
В последние годы для выявления бактерий P. ти1-tocida и типирования их по капсульным группам широкое применение нашла ПЦР с праймерами на ви-доспецифичный ген kmt-1 и гены капсульного синтеза (ЬуаБ, dcbF, ЬсЬБ) [6]. Эти гены не дают полного представления об антигенных свойствах изолятов и их патогенности. Чаще всего для этих целей применяют реакцию с антигенспецифическими сыворотками и биологическую пробу на лабораторных животных.
Молекулярно-генетические методы исследований позволили выявить у бактерии несколько протеинов наружной мембраны (ОтрА, ОтрР, Ота87, Р1рВ и др.) [14]. ОтрН составляет более 70 % массы клеточной стенки и вместе с капсульным антигеном выступает в качестве основного протективного антигена [18].
Определение последовательностей нуклеотидов гена ОтрН у изолятов Р. multocida позволит судить об их антигенных свойствах и родстве с вакцинными штаммами. У Р. multocida описано несколько генов, ассоциированных с ее патогенностью для разных видов животных. По данным зарубежных исследователей, 3 гена \tbpa — трансферрин связывающий протеин, р/Ьа — филаментный ген гемагглютинина, hgbb — гемоглобин связывающий протеин) чаще выявляли у изолятов, выделенных от больных телят, чем от здоровых [11, 14, 16, 17]. Нет сведений о частоте выявления этих генов у Р. multocida и их взаимосвязи с патогенностью изолятов для лабораторных животных.
Цель исследования
Изучить частоту выявления ОтрН-типов у изолятов Р. multocida, выделенных от телят с респираторной патологией, и определить новые методы и подходы для оценки их патогенности.
Материалы и методы
С 2006 по 2014 гг. выделили 83 изолята Р. multocida из легких телят с респираторной патологией из 23 хозяйств молочного направления различных регионов Западной Сибири. Для выделения бактерий использовали кровяной агар (НИЦФ, Россия) с добавлением 5 % дефибринированной овечьей крови в пробирках, которые инкубировали в атмосфере 5 % СО2 при 37 °С в течение 24 ч. Выделенные бактерии идентифицировали стандартными бактериологическими и биохимическими методами (тест на каталазу, оксидазу, индол, подвижность, уреазная активность, производство орнитин декарбоксилазы, сбраживание углеводов), а также по наличию гена кт^1 с помощью разработанной нами мультиплексной ПЦР [6]. После идентификации и определения патогенности изоляты сохраняли при -80 °С в сердечно-мозговом бульоне с добав-
• рвж •
лением 40 % глицерина. Для сравнения использовали российские референтные штаммы разных капсуль-ных групп «1231» (А), «Т-80» и «681» (В) и «AT» (D), полученные из коллекции микроорганизмов ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко.
Для выявления вариабельных фрагментов гена ОтрН, соответствующих одной из внешних петель протеина, использовали праймеры, описанные ранее [6]. Для подтверждения специфичности реакции, а также обнаружения изолятов P. multocida, нетипируемых данными праймерами, секвенировали фрагмент гена у нескольких изолятов каждого ОтрН-типа.
Для постановки ПЦР 100 мкл суспензии бактерий отмывали несколько раз в стерильной дистиллированной воде, конечный осадок ресуспендировали в 100 мкл воды, прогревали 5 минут при 95 °С, центрифугировали и надосадочную жидкость использовали для амплификации. Реакцию проводили в 30 мкл смеси, содержащей 5 мкл ДНК бактерии, 10ХПЦРбуфер, 3 мМ MgCl2, 3 мМ dNTP, 10 pM каждого праймера, 1 еа ДНК полимеразы (BIORON GmbH, Germany).
Определяли три гена вирулентности: tbpa — транс-ферринсвязывающий протеин, pfha — филаментный ге-маглютинина, hgbb — гемоглобинсвязывающий протеин в ПЦР, используя описанные ранее праймеры [12]. Специфичность реакции подтверждали с помощью сек-венирования ампликонов.
Секвенирующую реакцию проводили с использованием набора реагентов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, США). Продукты реакции анализировали методом капиллярного электрофореза в автоматическом секвенаторе ABI PRISM® 3130xl (Applied Biosystems, США). Выравнивание последовательностей, филогенетический анализ проводили по методу присоединения соседей в программах MEGA 5 и Lasergene 7. Статистическую достоверность топологии филогенетических деревьев устанавливали с помощью бутстреп-теста.
Для определения патогенности брали по 4 беспородных мыши в возрасте 3...4 нед. массой не менее 20 г на изолят. Животных содержали в контролируемых условиях со свободным доступом к воде и пище. Рацион состоял из стандартного комбикорма. Заражали мышей внутрибрюшинно в дозе 1х106 КОЕ суспензии бактерий, разведенных в 1 мл фосфатно-солевого буфера. За животными наблюдали в течение 7 дней и регистрировали сроки гибели. Культуры считали высокопатогенными, если мыши погибали в течение 3 дней после заражения, низкопатогенными — если гибель наступала на 4.7-е сутки, и непатогенными — если мыши выживали более 7 суток. Выживших животных подвергали гуманной эвтаназии путем ингаляции СО2 с последующей дислокацией шейных позвонков [5].
Статистический анализ проводили с помощью программы Statistica версия 8 (StatSoft Inc., США). Описательные статистические данные были использованы для расчета абсолютной и относительной частоты выявления генов патогенности, патогенности изолятов для лабораторных животных. Хи-квадрат тест и точный критерий Фишера был использован для изучения достоверности различий между аллельными группами, значение р <0,05 рассматривали как статистически значимые.
№ 9/2017 • 29
Результаты и обсуждение
По данным ПЦР с праймерами на гены капсульного синтеза hyaD, dcbF, bcbD все изоляты бактерии P. mul-tocida разделили на серотипы А (63) и D (20). Мы не выявили нетипируемые изоляты, а также изоляты других капсульных групп, что указывает на более важную роль изолятов капсульной серогруппы А в развитии эпизоотической ситуации в обследованных нами хозяйствах, чем капсульной группы D, и согласуется с результатами других исследователей [11, 19].
Для изучения антигенной структуры протеина OmpH и частоты распространения его отдельных антигенных вариантов среди изолятов бактерии P. multocida провели их типирование посредством аллельспецифической ПЦР с разработанными нами праймерами для выявления различий антигенных детерминант протеина, образованных двумя внешними петлями L2 и L5, на основе последовательностей гена [6]. Результаты исследований позволили разделить 60 из 63 изолятов капсуль-ного серотипа А на 3 типа, обозначенные буквами (соответствующими капсульному серотипу) и цифрами (порядок выявления аллельных вариантов): А1, А2 и А3. Три изолята принадлежали к аллельным вариантам: А4, А5 и А6 (табл. 1).
Изоляты капсульной серогруппы D и референтный штамм «АТ» были представлены одним типом — D1. Референтный штамм «1231» отнесен к варианту А3, а «Т-80» и «681» — к аллельному варианту B1. Основные различия между аллельными вариантами были выявлены в двух вариабельных областях, соответствующих внешним петлям протеина (рис.). Степень различия между отдельными штаммами каждого типа в этих областях не превышала 2 %, и изменения характеризовались синонимичными заменами.
Аллельспецифическая ПЦР для выявления OmpH-типов показала высокую эффективность, а ее результаты были подтверждены секвенированием фрагмента гена. Ее применение позволило разделить все изоляты бактерии P. multocida на 7 аллельных типов, каждый из которых формировал свою ветвь на филогенетическом дереве. Внутри группы сходство нук-леотидных последовательностей изолятов составило 98.100 %. Подобные результаты были получены B. Sellyei et al. [20].
Большой интерес представляло изучение частоты выявления отдельных OmpH-типов или их комбинаций в обследованных хозяйствах. В 16 из них выявили изоляты только одного OmpH-типа или только одной капсульной группы, в 7 — изоляты 2 и 3 OmpH-типов, в том числе разных капсульных серогрупп, что подтверждает данные J.D. Taylor et al. о гетерогенности популяции бактерии в стаде КРС [21].
Поскольку все изоляты P. multocida были выделены из пораженных легких, для оценки их пато-генности использовали модель сепсиса у мышей и оценку по маркерным генам патогенности. В тесте хи-квадрат определяли статистически достоверные различия в патогенности изолятов разных OmpH-типов бактерии. У всех исследованных изолятов выявлен хотя бы один из генов вирулентности. Распределение генов патогенности по капсульным серо-группам и аллельным вариантам бактерии представлено в таблице 2.
1. Частота выявления аллельных вариантов среди изолятов и штаммов бактерии Pasteurella multocida 1. Frequency of detection of allelic variants among isolates and strains of the bacteria Pasteurella multocida
Капсульная Количество исследованных OmpH-тип
группа изолятов и штаммов А1 А2 A3 A4 А5 А6 B1 D1
Изоляты
А 63 24 24 12 1 1 1 0 0
D 20 0 0 0 0 0 0 0 20
Штаммы
А 1 0 0 1 0 0 0 0 0
В 2 0 0 0 0 0 0 2 0
D 1 0 0 0 0 0 0 0 1
* Omsk- 13 КР212536" ■Т-14 KP2S239S
»OB-58KP212397 .
А2
100
55
— « М-2012 KY273615 ]А5
A-2013KY27J61J]A4 Öl L*N-2014 KY273616 ]А6 99j-Str. Р52 НМ117642
I Str. Razi PinOOOl CP017961 г*Str. T-80 KY273617*] ЙП*£1г.вв1 KY273618 JB1
ГМСК-13КР2123Э5 - *СР-12 KYZ73619 Sir AT KY273620
Sir. 3480 С P001409 »ВС-12 KY273612" 195L*M-13 KY273613 A3 • Sir. 1231 KY273611 _ -Str.X-73 U50807 1
- Sir HB03 СРСЮ3328
- Str. 36950 CP003022
• AGM-2013KP2123S3"
• CP-57 №212394
• |S-12 KY27361Q 1*1-13 KY273609
100
I— oil El
96 23 20
65 YK-59 KP212399
Рис. Филогенетическое дерево нуклеотидных последовательностей участка гена OmpH Pasteurella multocida. Звездами выделены штаммы и изоляты бактерии, исследованные в данной работе. Буквами и цифрами обозначены аллельные варианты гена. Топология дерева восстановлена при помощи метода ближайших соседей (Neighbor-Joining method). Матрица генетических расстояний рассчитана с применением метода Maximum Composite Likelihood. Указаны индексы статистической поддержки узлов, бутстреп-тест рассчитан для 1000 реплик. Филогенетический анализ проведен в программе MEGA5
Fig. Phylogenetic tree of nucleotide sequences of the region of the OmpH gene of Pasteurella multocida. The asterisks indicate the strains and isolates of the bacteria investigated in this work. Letters and numbers denote allelic variants of the gene. The topology of the tree is restored using the Neighbor-Joining method. The matrix of genetic distances is calculated using the Maximum Composite Likelihood method. Indices of statistical support of the nodes are indicated, the bootstrap test is calculated for 1000 replicas. Phylogenetic analysis was carried out in the MEGA5 program
Изоляты бактерии аллельных вариантов капсульной группы А различались по частоте присутствия генов pfhA и hgbB и патогенности для белых мышей. Ген pfhA чаще выявляли у изолятов аллельного типа А2, а ген
2. Результаты изучения патогенности изолятов бактерии P. multocida разных аллельных вариантов двумя методами 2. Results of studying the pathogenicity of P. multocida isolates of different allelic variants by two methods
Аллельный тип Число изолятов Выявление генов патогенности, количество изолятов, n/% Патогенность для белых мышей количество изолятов, n/%
tbpA pfhA hgbB* высокая* низкая* отсутствует*
А1 24 24/100,0 14/58,3 20/83,3 22/91,6 2/8,4 0
А2 24 24/100,0 22/91,6 10/41,7 12/50,0 8/33,3 4/16,7
A3 12 12/100,0 8/66,7 6/50,0 8/66,7 4/33,3 0
A4 1 1/100,0 1/100,0 1/100,0 1/100,0 0 0
A5 1 1/100,0 0 0 0 0 1/100,0
A6 1 1/100,0 1/100,0 0 0 0 1/100,0
D1 20 16/80,0 4/20,0 16/80,0 16/80,0 4/20,0 0
Примечание: * — различия достоверны (р<0,05). Частота выявления генов tbpa и pfhA составила 95,2 и 60,2 %, соответственно, и их чаще выявляли у изолятов капсульной группы А, чем D. Note: * — the differences are significant (p<0,05). The incidence of tbpa and pfhA genes was 95,2 and 60,2%, respectively, and they were more often detected in isolates belonging to capsule group A than D.
hgbB — у А1. Изоляты бактерии P. multocida типа А1 были более патогенными для белых мышей, чем культуры других аллельных типов.
Таким образом, результаты исследований позволили установить связь между наличием гена hgbb и патогенностью изолятов разных OmpH-типов для белых мышей. Этот ген достоверно чаще выявляли у изолятов с высокой патогенностью, чем с низкой. Тест на данный ген можно использовать в качестве маркера патогенности изолятов и замены биологической пробы на лабораторных животных. Установили также, что изоляты бактерии P. multocida, выделенные от больных животных даже одного стада, различаются антигенно и по патогенности. При планировании профилактической вакцинации необходимо учитывать наличие капсульной группы и OmpH-тип изолятов P. multocida, циркулирующих в конкретном хозяйстве.
Заключение
Результаты исследований показали, что в обследованных хозяйствах циркулируют изоляты P. multocida разных капсульных групп и OmpH-типов. Они представлены 7 антигенными группами, различающимися по протеину OmpH и капсульной серогруппе (А или D). Ни в одном случае не были выявлены изоляты капсульной серогруппы В. Среди изолятов капсульной серо-группы А выявлено 6 OmpH-типов, но наиболее распространенными являлись А1 и А2 (по 38 %). Все изо-ляты капсульной серогруппы D относились к одному OmpH- типу. Только в 16 хозяйствах все выделенные изоляты P. multocida были одной группы, а в 7 представлены двумя-тремя группами.
Из трех генов, ассоциированных с вирулентностью изолятов P. multocida для КРС, ген hgbb достоверно чаще выявляли у изолятов с высокой патоген-ностью для белых мышей. ПЦР на этот ген можно использовать для детекции патогенных изолятов бактерии P. multocida.
Библиография
1. Глотов, А.Г. Распространение вирусных респираторных болезней крупного рогатого скота / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, О.Г. Петрова [и соавт.] // Ветеринария. — 2002. — №3. — С. 17-21.
2. Глотов, А.Г. Этиологическая структура массовых респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота в хозяйствах, занимающихся производством молока / А.Г. Глотов, Т.И. Глотова, А.В. Нефедченко [и соавт.] // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. — 2008. — №3. — С. 72-78.
3. Глотов, А.Г. Гетерогенность пастерелл, выделенных от крупного рогатого скота на молочных комплексах / А.Г. Глотов, Т.Е. Терентьева, А.В. Нефедченко, Т.И. Глотова [и соавт.] // Ветеринария. — 2014. — №12. — С. 23-26.
4. Глотова, Т.И. Пастереллез крупного рогатого скота на молочных комплексах: частота выделения и характеристика культур / Т.И. Глотова, А.Г. Глотов, Т.Е. Терентьева [и соавт.] // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. — 2012. — №3. — С. 32-35.
5. Методические указания по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц: утверждены Главветуправлением №22-7/82. — М., 1992. — 12 с.
6. Нефедченко, А.В. Разработка метода идентификации и генотипирования бактерий Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica на основе полимераз-ной цепной реакции и филогенетический анализ культур бактерий, выделенных от крупного рогатого скота / А.В. Нефедченко, А.Н. Шиков, А.Г. Глотов, Т.И. Глотова [и соавт.] // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. — 2016. — №2. — С. 62-66.
7. Шегидевич Э.А. Роль пастерелл в респираторной патологии овец и крупного рогатого скота / Э.А. Шегидевич: автореф. дис. ...докт. вет. наук. (защищена 18.05.1993) — М.: ВАСХНИЛ, 1993. — 42 с.
8. Crawshaw, W.M. Field study of pneumonia in vaccinated cattle associated with incorrect vaccination and Pasteurella multocida infection / W.M. Crawshaw, G.L. Caldow // Veterinary Record. — 2015. — Vol.176. — рр.434-438.
9. Dabo, S.M. Pasteurella multocida and bovine respiratory disease / S.M. Dabo, J.D. Taylor, W. Confer // Animal Health Research Reviews. — 2007. — Vol. 8. — рр. 129-150.
10. Dagleish, M.P. Characterization and time course of pulmonary lesions in calves after intratracheal infection with Pasteurella multocida A: 3 / M.P. Dagleish, J. Finlayson, C. Bayne et al. // The Journal of Comparative Pathology. — 2010. — Vol. 142. — рр.1 57-169.
11. Davies, R.L. Characterisation of bovine strains of Pasteurella multocida and comparison with isolates of avian, ovine and porcine origin / R.L. Davies, R. Mac-Corquodale, S. Reilly // Veterinary Microbiology. — 2004. — Vol. 99. — рр. 145-158.
12. Ewers, C. Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated from different hosts with various disease status / C. Ewers, A. Lubke-Becker, A. Bethe et al. // Veterinary Microbiology. — 2006. — Vol. 114. — рр. 304-31 7.
13. Griffin, D.M. Bacterial pathogens of the bovine respiratory disease complex / D.M. Griffin, M. Chengappa, J. Kuszak et al. // Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. — 2010. — Vol. 26. — рр. 381-394.
14. Hotchkiss, E.J. Prevalence of Pasteurella multocida and other respiratory pathogens in thenasal tract of Scottish calves / E.J. Hotchkiss, M.P. Dagleish, K. Willough-by et al. // Veterinary Record. — 2010. — Vol. 167. — рр. 555-560.
15. Katsuda, K. Virulence genes and antimicrobial susceptibility in Pasteurella multocida isolates from calves / К. Katsuda, К. Hoshinoo, Y. Ueno // Veterinary Microbiology. — 2013. — Vol. 167. — рр. 737-741.
16. Lubke, A. Isolation and partial characterization of the major protein of the outer membrane of Pasteurella haemolytica and Pasteurella multocida / A. Lubke, L. Hartmann, W. Schroder et al. // Zentralblatt fur Bakteriologie. — 1994. — Vol. 281. — рр. 45-54.
17. Luo, Y. Sequence analysis of Pasteurella multocida major outer membrane protein (OmpH) and application of synthetic peptides in vaccination of chickens against homologous strain challenge / Y. Luo, Q. Zeng, J.R. Glisson // Vaccine. — 1999. — Vol. 17. — рр. 821-831.
18. Marandi, M.V. Role of Outer Membrane Protein H (OMPH)- and OMPA-specific monoclonal antibodies from hybridoma tumors in protection of mice against Pasteurella multocida / M.V. Marandi, K.R. Mittal // Infection and Immunity. — 1997. — Vol. 65. — рр. 4502-4508.
19. Purdy, C.W. Serotyping and enzyme characterization of Pasteurella haemolyti-ca and Pasteurella multocida isolates recovered from pneumonic lungs of stressed feeder calves / C.W. Purdy, R.H. Raleigh, J.K. Collins // Current Microbiology. — 1997. — Vol. 34. — рр. 244-249.
20. Sellyei, B. Characterisation of avian Pasteurella multocida strains with PCR-RFLP analysis of the ompH gene / B. Sellyei, E. Ivanics, T. Magyar // Acta Veterinaria Hun-garica. — 2013. — Vol. 61. — рр.1-8.
21. Taylor, J.D. Comparison of genotypic and phenotypic characterization methods for Pasteurella multocida isolates from fatal cases of bovine respiratory disease / J.D. Taylor, E.J. Hotchkiss, M.P. Dagleish // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. — 2010. — Vol. 22. — рр. 366-375.
22. Wilkie, I.W. Pasteurella multocida: diseases and pathogenesis / I.W. Wilkie, M. Harper, J.D. Boyce, B. Adler // Current Topics in Microbiology and Immunology. — 2012. — Vol. 361. — pp. 1-22.
References
1. Glotov А^., Glotovа Т.1., Petrova O.G. et al., Rasprostranenle vlrusnyh resplratornyh boleznej krupnogo rogatogo skota, Veterinariya, 2002, No. 3, pp. 17-21.
2. Glotov А^., Glotovа Т.1., Nefedchenko A.V. et al., Jetiologicheskaja struktura massovyh resplratornyh boleznej molodnjaka krupnogo rogatogo skota v hozjajstvah, zanlmajush-hlhsja prolzvodstvom moloka, Sibirskiy vestnik selskohozyajstvennoy nauki, 2008, No 3, рр. 72-78.
3. Glotov А^., Terentievа Т.Е., Nefedchenko A.V., Glotova T.I. et al., Geterogennost pasterell, vydelennyh ot krupnogo rogatogo skota na molochnyh kompleksah, Veterinariya, 2014, No. 12, pp. 23-26.
4. Glotova T.I., Glotov A.G., Terenteva Т.Е. et al., Pasterellez krupnogo rogatogo skota na molochnyh kompleksah: chastota vydelenlja i harakteristika kul'tur, Rossiyskiy veterinarnyiy zhurnal, 2012, No. 3, pp. 32-35.
5. Metodicheskie ukazanlya po laboratornoy diagnostike pasterellezov zhlvotnylh i ptlts (The operating instructions in laboratory diagnostics of pasteurelloses of animals and birds): utverzhdenyl Glavvetupravlenlem, No 22-7/82, Moscow, 1992, 12 р.
6. Nefedchenko A.V., Shlkov A.N., Glotov A.G., Glotova T.I. et al., Razrabotka metoda identifikacii i genotipirovanija bakterlj Pasteurella multocida i Mannheimia haemolytica na osnove pollmeraznoj cepnoj reakcll i filogeneticheskij anallz kul'tur bakterlj, vydelennyh ot krupnogo rogatogo skota, Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya, 2016, No. 2, pp. 62-66.
7. Shegidevich E.A. Role of Pasteurella in the respiratory pathology of sheep and large livestock, Extended abstract of Doctor's thesis in vet. science (it is protected 18.05.1993), Moscow, VASKHNIL, 1993, 42 p.
8. W.M Crawshaw W.M., Caldow G.L., Field study of pneumonia in vaccinated cattle associated with incorrect vaccination and Pasteurella multocida infection, Vet. Record, 2015, Vol. 176, pp. 434-438.
9. Dabo S.M., Taylor J.D., Confer W., Pasteurella multocida and bovine respiratory disease, Animal Health Research Reviews, 2007, Vol. 8. — pp. 129-150.
10. Dagleish M.P., Flnlayson J., Bayne C. et al., Characterization and time course of pulmonary lesions in calves after intratracheal infection with Pasteurella multocida A: 3, The Journal of Comparative Pathology, 2010, Vol.142, pp.157-169.
11. Davles R.L., MacCorquodale R., Rellly S., Characterisation of bovine strains of Pas-teurella multocida and comparison with isolates of avian, ovine and porcine origin, Vet. Microbiol, 2004, Vol. 99, pp. 145-158.
12. Ewers C., Lubke-Becker A., Bethe A. et al., Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated from different hosts with various disease status, Vet. Microbiol., 2006, Vol. 114, pp. 304-317.
13. Grifn D.M., Chengappa M., Kuszak J. et al., Bacterial pathogens of the bovine respiratory disease complex, Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, 2010, Vol. 26, pp. 381-394.
14. Hotchkiss E.J., Dagleish M.P., Willoughby K. et al., Prevalence of Pasteurel-la multocida and other respiratory pathogens in thenasal tract of Scottish calves, Vet. Record, 2010, Vol. 167, pp. 555-560.
15. Katsuda К., Hoshinoo К., Ueno Y., Virulence genes and antimicrobial susceptibility in Pasteurella multocida isolates from calves, Vet. Microbiol., 2013, Vol. 167, pp. 737-741.
16. Lubke A., Hartmann L., Schroder W. et al., Isolation and partial characterization of the major protein of the outer membrane of Pasteurella haemolytica and Pasteurella multocida, Zentralblatt fur Bakteriologie, 1994, Vol. 281, pp. 45-54.
17. Luo Y., Zeng Q., Glisson J.R., Sequence analysis of Pasteurella multocida major outer membrane protein (OmpH) and application of synthetic peptides in vaccination of chickens against homologous strain challenge, Vaccine, 1999, Vol.17, pp. 821-831.
18. Marandi M.V., Mittal K.R., Role of Outer Membrane Protein H (OMPH)- and OMPA-specific monoclonal antibodies from hybridoma tumors in protection of mice against Pasteurella multocida, Infection and Immunity, 1997, Vol. 65, pp. 4502-4508.
19. Purdy C.W., Raleigh R.H., Collins J.K., Serotyping and enzyme characterization of Pasteurella haemolytica and Pasteurella multocida isolates recovered from pneumonic lungs of stressed feeder calves, Current Microbiology, 1997, Vol. 34, pp. 244-249.
20. Sellyei B., Ivanics E., Magyar T., Comparison of genotypic and phenotypic characterization methods for Pasteurella multocida isolates from fatal cases of bovine respiratory disease, Acta Veterinaria Hungarica, 2013, Vol. 61, pp. 1-8.
21. Taylor J.D., Hotchkiss E.J., Dagleish M.P., Comparison of genotypic and phenotypic characterization methods for Pasteurella multocida isolates from fatal cases of bovine respiratory disease, J. of Vet. Diagn. Inv., 2010, Vol. 22, pp. 366-375.
22. Wilkie I.W., Harper M., Boyce J.D., Adler B., Pasteurella multocida: diseases and pathogenesis, Microbiology and Immunology, 2012, Vol. 361, pp. 1-22.
ABSRACT
A.V. Nefedchenko, A.G. Glotov, T.I. Glotova, T.E. Sudorgina, O.V. Semenova, S.V. Koteneva, A.A. Nikonova.
Siberian Federal Scientific Centre of Agro-BioTechnologies of the Russian Academy of Sciences, Institute of Experimentally Veterinary Sciences of Siberia and Far East (Krasnoobsk Novosibirsk region) (630501 Novosibirsk region Novosibirsk district, Krasnoobsk, post office box 463).
Search for New Methods for Determining the Pathogenicity of the Bacteria Pasteurella multocida. The
bacterium Pasteurella multocida plays an important role in the pathology of respiratory organs of cattle. Protein OmpH is a protective antigen of the bacterium and is well studied in strains isolated from birds. There is no data on the study of gene sequences of this protein in isolates allocated from cattle with respiratory pathology in the available literature. Only some genes associated with the virulence of the bacterium for cattle are described. There is no information on the frequency of detection of these genes in isolates isolated from affected lungs and their association with the pathogenicity of bacterial isolates for laboratory animals.
Purpose. To study the frequency of detection of OmpN-types in P. multocida isolates allocated from calves with respiratory pathology and to determine new methods for assessing their pathogenicity.
Materials and methods. The work was carried out in 2006 to 2014. P. multocida isolates (83) allocated by as from calves lungs with respiratory diseases from 23 dairy farms of different regions of Western Siberia on blood agar with 5 % defibrinated sheep blood in tubes incubated i n an atmosphere of 5 % CO2 at 37 °C for 24 hours. variable fragments of the OmpH gene and three virulence genes on the isolates of P. multocida were determined by PCR. The specificity of the reaction was confirmed by amplicon sequencing using the BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystems, USA) reagent kit. The reaction products were analyzed by capillary electrophoresis in an automatic sequencer ABI PRISM® 3130xl (Applied Biosystems, USA) followed by sequence alignment and phylogenetic analysis using the method of adjoining the neighbors in MEGA 5 and Lasergene 7 programs. Pathogenicity of P. multocida isolates for nonbread mice was determined.
Conclusion. All isolates of the bacteria P. multocida belonged to two capsule groups, A (63) and D (20). Among the isolates of group A, 6 OpmpN types (A1...A6) were detected, but the most common were A1 and A2. The isolates of group D belonged to a single Opmp type. In 16 out of 23 farms isolates of only one OmpN-type were identified, in 4 — two types, and in 3 — three types. The hgbb gene was significantly more often detected in isolates with high pathogenicity for white mice. PCR on this gene can be used to detect highly pathogenic bacterial isolates.
Key words: Pasteurella multocida, polymerase chain reaction, alleles, cattle, genes of pathogenicity, laboratory animals, respiratory diseases.
