CC BY
18
УДК 575.174.015.3
Хвойные бореальной зоны. 2020. Т. XXXVIII, № 5-6. С. 297-304
РАЗРАБОТКА ПАНЕЛИ ЯДЕРНЫХ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЛЕГАЛЬНОСТИ ПРОИСХОЖДЕНИЯ ДРЕВЕСИНЫ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ В КРАСНОЯРСКОМ КРАЕ*
Д. Н. Шуваев1, 2, А. А. Ибе2, Ю. Е. Щерба1, Т. В. Сухих2, Е. А. Шилкина2, Е. А. Усова1, Е. В. Лисотова1, М. В. Репях1, О. М. Ступакова1
1 Сибирский государственный университет науки и технологий имени академика М. Ф. Решетнева Российская Федерация, 660037, г. Красноярск, просп. им. газеты «Красноярский рабочий», 31
2Центр защиты леса Красноярского края Российская Федерация, 660036 г. Красноярск, Академгородок 50a, корп. 2 E-mail: denis.shuvaev@gmail.com
На основании тестирования 37 локусов ядерной микросателлитной ДНК сосны обыкновенной произведен подбор 14 наиболее перспективных локусов. Отработаны лабораторные протоколы условий амплификации данных локусов. Проведена оценка генетических параметров 5 референтных популяций сосны обыкновенной по 14 ядерным микросателлитным локусам. Ни по одному из исследованных локусов не было выявлено нулевых аллелей или неравновесия по сцеплению. Среднее число эффективных аллелей составило 3,15, что характеризовало данную маркерную панель как достаточно эффективную. Распределение изменчивости между популяциями было равномерным при низком показателе межпопуляционной дифференциации FST = 3,1 %, что позволяет использовать одинаковую маркерную панель для идентификации генотипов сосны обыкновенной в различных областях Красноярского края. Оценка вероятности случайного совпадения (PI) и вероятности обнаружения аналогичного генотипа (Q) в выборке фиксированного размера (N = 106) составили 6,8*10 и 0,007 %, соответственно. Полученные параметры мощности идентификационной панели считаются достаточными для использования в практике судебно-медицинской экспертизы.
Ключевые слова: сосна обыкновенная, идентификационная панель, нелегальные рубки, микросателлитные локусы, референтная популяция, вероятность случайного совпадения.
Conifers of the boreal area. 2020, Vol. XXXVIII, No. 5-6, P. 297-304
A PANEL OF NUCLEAR MICROSATELLITE MARKERS FOR THE IDENTIFICATION OF SCOTS PINE ILLEGAL LOGS ON THE KRASNOYARSK TERRITORY
D. N. Shuvaev1,2, A. A. Ibe2, Yu. Е. Shcherba1, T. V. Sukhikh2, E. А. Shilkina2, Е. А. Usova1, Е. V. Lisotova1, M. V. Repyah1, О. М. Stupakova1
1Reshetnev Siberian State University of Science and Technology 31, Krasnoyarsk^ rabochii prospekt, Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation 2Protection Center of the Krasnoyarsk Territory buil. 2, 50a, Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation E-mail: denis.shuvaev@gmail.com
Based on testing 37 nuclear microsatellite markers we screened 14 the most promising loci. For these loci were performed the optimization of amplification protocols. The estimation of genetic indexes was made for 5 natural reference populations of Scots pine. The analysis of 14 screened microsatellite loci did not reveal a presence of null alleles and linkage disequilibrium. The average mean of the effective number of alleles was 3.15 that allowed to consider this panel how useful. The genetic distribution between populations was almost uniform with the low index of genetic differentiation FST = 3.1 %. Therefore this panel can be used for identification Scots pine illegal logs in the different areas of Krasnoyarsk territory. Power of Inclusion (PI) and probability of detecting identical genotype (Q) for sample of fixed size (N = 106) were 6.8* 10-11 and 0.007 %, accordingly. These power parameters of identification panel are enough for forensic genetic analysis.
Keywords: Scots pine, identification panel, illegal logs, microsatellite loci, reference population, Power of Inclusion.
* Работа поддержана Красноярским краевым фондом науки в рамках реализации проекта: «Разработка метода ДНК-фингерпринтинга для оценки легальности происхождения древесины сосны обыкновенной в Красноярском крае».
Сбор материала для исследований выполнен при частичной поддержке проекта «Фундаментальные основы защиты лесов от энтомо- и фитовредителей в Сибири» (№ ЕЕЕЕ-2020-0014).
ВВЕДЕНИЕ
При расследовании фактов незаконных рубок с помощью методов молекулярно-генетического анализа основными критериями его надежности являются наличие представительной референтной базы генотипов по целевой древесной породе и хорошо охарактеризованная панель генетических маркеров. Панель маркеров служит отправной точкой при расширении референтной базы генотипов. Достоверность ДНК-идентификации зависит как от группы референтных популяций, так и от выбранной панели локусов. Среди используемых в настоящее время разновидностей генетических маркеров наиболее полно отвечают требованиям индивидуальной идентификации маркеры, основанные на последовательностях микросателлит-ной ДНК. Высокий уровень гетерозиготности, большое аллельное разнообразие, невысокие требования к качеству ДНК, относительная простота анализа с возможностью дальнейшей автоматизации делают их практически идеальным инструментом для решения задач индивидуальной идентификации применительно к расследованиям фактов незаконного оборота древесины.
Микросателлиты (SSR, простые повторы последовательности от 1 до 6 п. о. в мотиве) являются высокополиморфными генетическими маркерами для оценки популяционной структуры и дифференциации [12]. Геномная функция микросателлитов разнообразна: от селективно нейтральной до участия в организации хроматина, рекомбинации и регуляции экспрессии генов [10; 11].
Таким образом, выбор конкретных микросателлитных локусов может иметь существенное влияние на эффективность выявления популяционной структуры и дифференциации [7]. Однако при анализе генетической изменчивости видов с широким ареалом достаточно часто возникает проблема нестабильности проявления высокоизменчивых микросателлитных локусов.
Сосна обыкновенная широко распространена в лесах европейской и азиатской частей страны. Встречается по всей Европе от Скандинавии до Балканского полуострова и почти на всей территории лесной зоны России, также на Урале, в Сибири и в других районах. Вид характеризуется сложной популяционной структурой. Природные популяции сосны обыкновенной представляют собой совокупности более или менее изолированных субпопуляций. Последние могут: иметь различную численность, обмениваться генетическим материалом и быть подверженными давлению разных форм отбора [2]. Все вышеперечисленные факторы имеют отражение в генетической структуре популяций, которая зависит от распределения аллель-ных частот. Структура популяций должна в конечном счете влиять и на оценки, связанные с установлением вероятностей идентификации генотипов при расследовании фактов незаконных рубок.
Для проведения анализов по идентификации генотипа с помощью микросателлитных локусов необходимо обладать их некоторым минимальным набором с соответствующими характеристиками, главными из которых являются хорошая воспроизводимость и достаточный уровень изменчивости. Данные параметры
локусов напрямую влияют на разрешающую способность метода. Вероятность правильной идентификации вычисляется на основе данных о частотах встречаемости аллелей и генотипов анализируемой панели генетических маркеров в референтных популяциях. Для создания референтных баз данных используют популяционные выборки, собранные с учетом попу-ляционно-генетической структуры конкретных групп популяций [15].
Чем меньше референтная популяция отражает генетический пул тестируемой группы, тем больше индивидов в ней имеют аллели, отсутствующие в референтной базе данных, что приводит к значительному снижению дискриминирующей способности метода [3].
Таким образом, от частот аллелей локусов в конкретных популяциях зависит частота генотипов, а следовательно, и вероятность их случайного совпадения. Для наиболее точной оценки вероятности случайного совпадения генотипов необходимо обладать знаниями о распределении частот аллелей и популяционной структуре вида. На основе оценок генотипи-ческих частот можно рассчитать мощность идентификационной панели локусов, для которой используют следующие параметры: вероятность случайного совпадения (PI) и вероятность встречи идентичного генотипа в выборке фиксированного размера (Q). Также важным параметром локусов является эффективное число аллелей - Ne. Величина эффективного числа аллелей является функцией от доли полиморфных локусов, числа аллелей на локус и равномерности их частот. Иными словами, величина Ne косвенно характеризует потенциал разрешающей эффективности маркерной системы, как в целом, так и для отдельно взятого локуса.
Целью настоящего исследования стал подбор панели микросателлитных маркеров сосны обыкновенной и оценка распределения аллельных частот в референтных популяциях для расчета показателей мощности идентификационной панели локусов и ее эффективности в целях противодействия фактам незаконных рубок сосны обыкновенной.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Объектами исследования послужили выборки из популяций сосны обыкновенной, собранные в естественных насаждениях Красноярского края (см. рисунок). Возраст деревьев составил 60-80 лет. Всего было проанализировано 150 деревьев из 5 естественных популяций (табл. 1).
Выделение ДНК из хвои было проведено согласно стандартному протоколу экстракции ДНК из растительных тканей [6]. Осадок ДНК растворяли в 200 мкл деионизированной воды. Контроль качества полученных препаратов ДНК проводили при помощи спектрофотометра Nanodrop P330 (Implen, Франция).
На выделенных препаратах ДНК было протестировано 37 пар ПЦР-праймеров для ядерных микросателлитных локусов (табл. 2). Основным критерием отбора было стабильное и надежное проявление аллелей локусов и достаточно высокий уровень полиморфизма на тестируемой выборке.
Точки отбора материала сосны обыкновенной
Для всех праймеров был использован общий протокол постановки реакционной смеси для ПЦР. ПЦР проводили на амплификаторах серии BioRad T100 (BioRad, США) в 10 мкл реакционной смеси (GenPak®PCR Core, ООО «НПФ Генлаб», Россия), составленной согласно инструкции фирмы-производителя. Конечные концентрации праймеров в смеси составили 2,5 пкМоль. Объем образца ДНК составил 2,5 мкл.
Продукты амплификации были проанализированы методом вертикального гель-электрофореза (VE-20, Хеликон, Россия) в 6%-м неденатурирующем полиак-риламидном геле в 1Х-ТАЕ-буфере при 80 Вт в течение 3 часов с последующей окраской бромистым эти-дием и визуализацией на трансиллюминаторе (Vilber Lourmat, Франция).
Таблица 1
Характеристики точек отбора материала сосны обыкновенной
№ выборки (код) Лесничество Квартал Географические координаты
1 (КД) Казачинское 77 57°50'02.95'' N 93°32'27.71'' E
2 (ТР) Терянское 173 58°43'11.09'' N 96°14'12.48'' E
3 (МС) Манское 45 55°26'25.12'' N 93°27'55.80'' E
4 (СН) СевероЕнисейское 660 60°15'28.95'' N 94°03'34.01'' E
5 (МН) Минусинское 110 53°42'36.43'' N 91°58'04.53'' E
В качестве стандартного маркера длин фрагментов была использована ДНК плазмиды pBR322, обработанная рестриктазой HPAII (Сибэнзим, Россия). Гено-типирование проводили в программе Photo-Capt 12.4 (Vilber Lourmat, Франция).
Присутствие нуль-аллелей в локусах, а также возможные ошибки генотипирования проверяли при помощи программ MicroChecker 2.2.3 [13] и FreeNa [5]. Тесты на отклонение популяций от равновесия Хар-ди-Вайнберга и неравновесие по сцеплению были проведены в программе Fstat при 10000 пермутаций [9]. Наблюдаемую и ожидаемую гетерозиготность (HO и HE), показатели мощности идентификационной панели (PI и Q) и стандартные F-статистики рассчитывали в программе GenAlEx 6.5 [14].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Тестирование стабильности амплификации локу-сов и их отбор на основании критерия полиморфизма
позволил выделить 14 наиболее перспективных локусов ядерной микросателлитной ДНК: PtTx2146, PtTx3107, PtTx3025, PtTx3013, PtTx4001, lw_isotig07383, lw_isotig04195, lw_isotig04306, lw_isotig01420, Psyl17, Psyl42, Psyl57, SPAG7.14, SPAC11.4. Анализ данных микросателлитных маркеров в программах MicroChecker и FreeNa не выявил присутствия нуль-аллелей ни по одному из отобранных локусов. Попарное тестирование локусов не выявило неравновесия по сцеплению (P < 0,0004). Значимых отклонений от равновесия Харди-Вайнберга не было выявлено ни в одной из исследуемых популяций (P < 0,001).
Также были рассчитаны: тотальное число аллелей, эффективное число аллелей и определены их размеры (табл. 3).
Таблица 2
Характеристики протестированных микросателлитных локусов
Локус Последовательность праймера (5'—3') Мотив Результат амплификации
PtTx2123 GAAGAACCCACAAACACAAG - F (AGC)8 НА
GGGCAAGAATTCAATGATAA - R
PtTx2146* CCTGGGGATTTGGATTGGGTATTTG - F (TGC)5CGC(TGC)7CG C(TGC)7 П
ACAGACCTTCCCCGTTCCTTTTATA - R
PtTx3013* GCTTCTCCATTAACTAATTCTA - F (GTT)10 СП
TCAAAATTGTTCGTAAAACCTC - R
PtTx3020 GTCGGGGAAGTGAAAGTA - F A16(CAA)9 НА
CTAGGTGCAAGAAAAGAGTAT - R
PtTx3025* CACGCTGTATAATAACAATCTA - F (CAA)10 П
TTCTATATTCGCTTTTAGTTTC - R
PtTx3032 CTGCCACACTACCAACC - F (GAT)4AT(GAT)30 (GAC)3GAT(GAC)8... (GAC)6AAT(GAT)6 НА
AACATTAAGATCTCATTTCAA - R
PtTx3049 GAAGTGATAATGGCATAGCAAAAT - F (TG)16 НА
CAGACCCGTGAAAGTAATAAACAT - R
PtTx3107* AAACAAGCCCACATCGTCAATC - F (CAT)14 П
TCCCCTGGATCTGAGGA - R
PtTx3116 CCTCCCAAAGCCTAAAGAAT - F (TTG)7...(TTG)5 НА
CATACAAGGCCTTATCTTACAGAA - R
PtTx4001* CTATTTGAGTTAAGAAGGGAGTC - F (GT)15 П
CTGTGGGTAGCATCATC - R
PtTx4011 GGTAACATTGGGAAAACACTCA - F (CA)20 Нуль
TTAACCATCTATGCCAATCACTT - R
Psyl2 TTGCTTTTGCAGAACATTCG - F (GCT)5 М
GTCCTGCAGGCAATCAAAAT - R
Psyl16 GCTCTGCCCATGCTATCACT - F (AT)7 М
TGATGCTACCCAATGAGGTG - R
Psyl17* TGGTCTGCAAATCAATCGAA - F (TA)7 П
GGGTAGGAATGCAAGTTAGGC - R
Psyl18 ACTACCTGGCATTCGTCCTG - F (GCA)7 М
GGATCTGGTCCATTTCGTGT - R
Psyl19 GGCTGTAATTGGCACAGGTT - F (GCT)7 М
CGAGGTGGTACACAGCAACA - R
Psyl25 CAGCACGCGTTCTTTGTATC - F (GCA)5 М
ACCGTTGCTCGTTGTCTTCT-R
Psyl42* CAACTTCAGCCTTGCAACAA - F (TC)9 П
CGACTTCATTTGGAACACCA - R
Psyl44 TCCAAGTTCGGTTCCTTGTC - F (CGG)5 М
GACACGATGGATTCCCTGAT - R
Источник
[4]
[16]
Окончание таблицы 2
Локус Последовательность праймера (5'-3') Мотив Результат амплификации Источник
Р8у157* ССССЛСЛТСТСТЛСЛОТССЛЛ - Е (ЛСС)7 СП
ТОСТСТТООЛТТТОТТОСТО - я
Ы 18(^04195* ОЛОЛТСЛССОЛЛЛСЛЛСЛЛЛЛ - Е (ОЛО)5 СП [8]
ТЛСЛЛОТСССЛОСЛЛЛЛСЛЛТ - я
1№_18О1^04306* ОССЛТТТТТТТСТТСТСТССТ - Е (ТСС)7 П
ООТСООТТТСТОЛЛТТТСТЛЛ - я
Ы 1801^10603 СЛЛЛЛТСОТСТЛСТТСТССССС - Е (СЛО)7 НА
СЛЛЛОСЛЛЛЛОЛЛСТССЛЛСОЛ - я
1w_isotig21953 ЛТООТОТОТТТОЛЛОСООЛЛ - Е (ЛТООО)7 НА
ЛТТОСЛОССЛСТООТОТСТТ - я
1№_18о1^27940 ОСЛООСЛЛСЛЛСЛЛЛЛОТОЛСЛ - Е (ТООЛ)5 Нуль
ЛОСЛЛТСОЛОТООСЛЛЛТСТТС - я
1w isotig07383* СЛЛЛСЛЛЛЛЛЛСЛОТСТОСЛ - Е (ОЛТ)8 П
ЛТСОТСЛТСЛТСЛТСОТСЛС - я
1w_isotig26230 ОООСЛТТЛСЛТЛЛЛСЛСООО - Е (ТЛ)10 М
ТОСССТТОЛОСЛТТТОЛТТЛ - я
1w isotig00080 СОООСЛЛЛЛТОЛССОЛЛО - Е (ССО)6 НА
ТООЛООЛООТЛОЛООООО-я
1w_isotig01420* ТССОТОЛСССТЛТТЛСОТ-Е (СТО)5 П
СОЛТТЛОТТОСТТОССТТ - я
1w_isotig05123 ТОТОСОТЛТЛООЛООТООЛО - Е (ОЛО)6 СП
ЛТОЛЛЛООТОЛСЛЛЛОСООТ-я
БРЛС11.4* ТСЛСЛЛЛЛСЛСОТОЛТТСЛСЛ - Е (ЛТ)5(ОТ)!9 П [17]
ОЛЛЛЛТЛОСССТОТОТОЛОЛСЛ - я
БРЛС11.5 ТООЛОТООЛЛОТТТОЛОЛЛОС - Е (ЛТ)8(ОТ)!9 - (ТЛ)„ НА
ТТОООТТЛСОЛТЛСЛОЛСОЛТО - я
БРЛС11.6 СТТСЛСЛООЛСТОЛТОТТСЛ - Е (СЛ)29(ТЛ)7 НА
ТТЛСЛОСООТТООТЛЛЛТО - я
БРЛС11.8 ЛОООЛОЛТСЛЛТЛОЛТСЛТОО - Е (ТО)16 Нуль
СЛОССЛЛОЛСЛТСЛЛЛЛЛТО - я
БРЛС12.5 СТТСТТСЛСТЛОТТТССТТТОО - Е (ОТ)20(ОЛ)ю НА
ТТООТТЛТЛООСЛТЛОЛТТОС - я
БРЛ03.7 ОТТЛЛЛОЛЛЛЛТЛЛТОЛСОТСТС - Е (ТС)45 НА
ЛЛТЛСЛТТТЛССТЛОЛЛТЛСОТСЛ - я
БРЛ07.14* ТТСОТЛООЛСТЛЛЛЛЛТОТОТО - Е (ТО)17(ЛО)21 П
СЛЛЛОТООЛТТТТОЛССО - я
Примечание: НА - неспецифическая амплификация; П - полиморфный; СП - слабополиморфный; Нуль - присутствие нулевых аллелей; М - мономорфный; * - локусы, отобранные для дальнейшей работы.
Таблица 3
Характеристики аллелей микросателлитных локусов в популяциях сосны обыкновенной
Локус Число аллелей Эффективное число аллелей Размеры аллелей, п. н.
РЯх2146 11 4,1 182, 185, 191, 194, 200, 203, 206, 212, 221, 227, 236
РЯх3107 8 3,31 153, 159, 162, 165, 168, 171, 177, 183
РЯх3025 6 1,74 272, 275, 281, 284, 296, 314
РЯх3013 2 1,35 119, 125
РЯх4001 6 2,76 210, 212, 220, 222, 224, 230
Ы isotig07383 6 2,29 188, 191, 194, 197, 200, 203
1w isotig04195 4 1,5 186, 189, 192, 195
1w isotig04306 8 2,48 172, 175, 178, 181, 184, 187, 193, 196
1w isotig01420 5 2,40 171, 174, 177, 180, 186
Psy157 6 1,63 190, 193, 196, 199, 202, 205
Psy117 9 3,73 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 251, 253
Psy142 5 3,5 171, 173, 175, 177, 179
БРЛ07.14 13 7,24 180, 186, 196, 200, 204, 210, 216, 218, 220, 224, 228, 234, 240
БРЛС11.4 11 6,09 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 156, 158, 160, 162
Анализ распределения частот аллелей по локусу ^_1бо%04195 показал, что аллель 189 преобладал во всех популяциях с частотой 0,804. Приблизительно одинаковыми были значения для аллелей 192 и 195 (0,091 и 0,098, соответственно). Аллель 186 был обнаружен только в популяции Терянское с частотой 0,033. У локуса ^^о%04306 аллель 187 преобладал во всех популяциях с частотой 0,581. Однако популяция Манское обладала сниженной частотой по нему в 0,467, за счет повышенных частот аллелей 184 и 193. Приватный аллель 172 был обнаружен в популяции Северо-Енисейское с частотой 0,017. Аллель 159 локуса РЛх3107 преобладал во всех популяциях с частотой 0,487. Вторым по встречаемости был аллель 165 с частотой в 0,223. У популяций Терянское и Минусинское были обнаружены приватные аллели 177 и 183 с одинаковыми частотами 0,017, соответственно. Не было обнаружено явного преобладания какого-либо аллеля у локуса РТх2146. Четыре самых распространенных аллеля: 182, 194, 221, 227 - встречались с частотами 0,233, 0,183, 0,293 и 0,157, соответственно. Приватных аллелей было пять: 185, 203, 206, 212 и 236. У локуса РБу157 было обнаружено значительное преобладание аллеля 199 с частотой 0,777 во всех популяциях. Вторым по встречаемости был аллель 202 с частотой в 0,103. В популяции Терянское был обнаружен приватный аллель 193 с частотой 0,017. Практически равномерным было распределение частот аллелей по локусу Рву117, за исключением ал-леля 227 с частотой 0,336 и одного приватного аллеля 221 с частотой 0,017 в популяции Казачинское. Для остальных семи аллелей можно указать усредненное значение в 0,094. У локуса РБу142 аллели 177 и 179 преобладали практически в равных пропорциях с частотами 0,367 и 0,290, соответственно. С меньшими частотами, но практически в равных пропорциях, были отмечены аллели 173 и 175 (0,189 и 0,140, соответственно). Один приватный аллель 171 был обнаружен в популяции Казачинское с частотой 0,071. У локуса РЛх4001 не было обнаружено приватных аллелей и частоты четырех аллелей из шести были распределены равномерно с преобладанием аллеля 220 (частота от 0,4 до 0,667). Для аллелей 224 и 230 частоты колебались от нулевых значений в некоторых популяциях до 0,067. Локусы SPAC11.4 и SPAG7.14 характеризовались наибольшими числами аллелей, которые составили 11 и 13, соответственно. Частоты подавляющего большинства аллелей данных локусов были распределены равномерно. У локуса SPAC11.4 был обнаружен только один приватный аллель 150 в популяции Казачинское. Тогда как у локуса SPAG7.14 в той же популяции было обнаружено два приватных аллеля 228 и 234. Локус РТх3025 характеризовался преобладанием двух аллелей 272 и 284 с частотами 0,727 и 0,223, соответственно. Приватные аллели 281 и 296 были отмечены в популяциях СевероЕнисейское и Минусинское. Среди всех исследованных локусов наименьшее число аллелей было обнаружено у локуса РЛх3013. Всего было обнаружено два аллеля 119 и 125 с частотами 0,151 и 0,849. Сходная картина с доминированием какого-либо одного аллеля была обнаружена у локусов ^_180Й^7383 и
lw_isotig01420. Однако для последнего локуса следует отметить более равномерное распределение частот менее распространенных аллелей, в отличие от локуса lw_isotig07383.
Таким образом, исследование характера распределения аллельных частот 14 микросателлитных локусов в 5 популяциях сосны обыкновенной показало, что несмотря на значительное преобладание одного или нескольких аллелей по таким локусам, как PtTx3013, PtTx3025, lw_isotig04195, Psyl57 и PtTx3107 - их распределение между популяциями было равномерным. Частоты наиболее распространенных аллелей данных локусов не отличались между популяциями более чем на 25 %.
Среднее число эффективных аллелей составило 3,15, что характеризовало выбранную маркерную панель как достаточно эффективную. Однако следует отметить, что данный показатель значительно варьировал между локусами. Так, для локуса PtTx3013 было характерно значение Ne в 1,35, а для локуса SPAG7.14 данный показатель составил 7,24. При достижении маркерной панелью достаточной мощности разрешения, локусами с низкими показателями Ne можно будет пренебречь с целью экономии трудозатрат и реактивов на проведение 1 анализа.
Среди популяционно-генетических показателей изменчивости популяций одной из самых распространенных мер является гетерозиготность. Частота гете-розигот является важным показателем, так как каждая гетерозиготная особь несет разные аллели и тем иллюстрирует наличие изменчивости. Таким образом, показатель гетерозиготности можно рассматривать как показатель разнообразия популяции. Fst — это корреляция между гаметами, случайно взятыми из данной субпопуляции, относительно всех гамет популяции. Индекс фиксации FST является показателем дифференциации популяции. FIS — индекс фиксации индивидуальный; корреляция между гаметами, обусловленная инбридингом в пределах субпопуляций; вероятность, что две аллели у особи, случайно выбранной из субпопуляции, будут идентичны по происхождению. В табл. 4 приведены стандартные генетические показатели исследованных популяций.
Таблица 4
Стандартные генетические показатели популяций сосны обыкновенной
Популяция Ho He FIS
Казачинское 0,565 0,612 0,061
Терянское 0,519 0,550 0,061
Манское 0,563 0,604 0,044
Северо-Енисейское 0,540 0,562 0,024
Минусинское 0,610 0,610 —0,002
Анализ распределения изменчивости между популяциями показал, что значительных различий в уровне наблюдаемой гетерозиготности обнаружено не было - ни между крайней северной популяцией (Се-веро-Енисейское), ни между крайней южной популяцией (Минусинское). Соотношения наблюдаемых и ожидаемых гетерозиготностей внутри популяций, а также слегка повышенное значение индексов
фиксации свидетельствует о незначительном дефиците гетерозиготных генотипов (за исключением популяции Минусинское). Поскольку популяции не являлись изолированными и значение индекса дифференциации было низким (3,1 %), слабый дефицит ге-терозигот можно объяснить особенностью распространения семян сосны обыкновенной (анемохорный вид), при которой размер соседства мал, и ближайшие деревья находятся друг с другом в той или иной степени родства.
Низкий показатель индекса межпопуляционной дифференциации Г5т свидетельствует о слабой степени межпопуляционной дивергенции. Это означает, что популяции сосны обыкновенной обладают высокой степенью панмиксии. Поэтому частоты генотипов между ними различаются слабо. Следовательно, распределение аллелей имеет равномерный характер, и вероятность не учесть редкий генотип снижается.
Оценка идентификационного потенциала панели микросателлитных локусов осуществляется на основе вероятностных расчетов, базирующихся на данных о частотах встречаемости аллелей в популяции. Частоты встречаемости устанавливают опытным путем. Данные о частотах встречаемости позволяют вычислить вероятности итоговых оценок мощности идентификационной панели. Такими оценками являются вероятность случайного совпадения (Р1) и вероятность встречи идентичного генотипа в выборке фиксированного размера (0. Вероятность случайного совпадения означает вероятность того, что тот же вывод был бы сделан, если бы профиль ДНК исследуемого объекта сравнивался с генотипом любого случайного индивидуума. Величина Q зависит от размера исследуемой выборки и формулируется как вероятность того, что среди N потенциально возможных индивидуумов, найдется хотя бы один с генотипом, аналогичным профилю ДНК исследуемого объекта.
Таким образом, основными параметрами мощности идентификационной панели являются величины Р1 и р. В практике судебно-медицинской экспертизы признание факта генетической идентичности доказанным требует значений Р1 и Q на уровне 10-8 и 0,01 % [1].
Расчетное значение параметра Р1 по совокупности 14 локусов составило 6,8*10-11. Показатель Q для N = 106 составил 0,007 %, что было ниже заданного значения в 0,01 %. На практике это означает крайне низкую вероятность обнаружения в генеральной совокупности индивидуума с таким же генотипом.
ВЫВОДЫ
1. В ходе исследования из 37 пар ядерных микро-сателлитных локусов сосны обыкновенной было отобрано 14 локусов, демонстрирующих стабильную амплификацию и достаточный уровень полиморфизма на 5 референтных популяциях сосны обыкновенной.
2. Стандартные популяционно-генетические показатели свидетельствуют о том, что популяции сосны обыкновенной, произрастающие в Красноярском крае, однородны по своему составу (Г8т = 3,1 %). Следовательно, одинаковую маркерную панель для идентификации генотипов сосны обыкновенной можно
использовать в различных областях Красноярского края.
3. Оценки вероятностей PI и Q позволяют использовать разработанную панель микросателлитных ло-кусов при контроле за оборотом древесины сосны обыкновенной, так как полученные параметры мощности идентификационной панели считаются приемлемыми в практике судебно-медицинской экспертизы.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Перепечина И. О., Гришечкин С. А. Вероятностные расчеты в ДНК-дактилоскопии : метод. рекомендации. М. : ЭКЦ МВД России, 1996. 16 с.
2. Санников С. Н., Санникова Н. С., Петрова И. В. Очерки по теории лесной популяционной биологии. Екатеринбург : РИО УрО РАН, 2012. 248 с.
3. Характеристика популяций Российской Федерации по панели пятнадцати локусов, используемых для ДНК-идентификации и в судебно-медицинской экспертизе / В. А. Степанов, О. П. Балановский, А. В. Мельников и др. // Acta Naturae. 2011. Т. 3, № 2. С. 59-71.
4. Conifer Microsatellite handbook / L. Auckland, T. Bui, Y. Zhou et al. // College Station, TX, USA Texas A & M. University, 2002.
5. Chapuis M.-P., Estoup A. Microsatellite Null Alleles and Estimation of Population Differentiation // Molecular Biology and Evolution. 2007. Vol. 24, № 3. P. 621-631.
6. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers / M. E. Devey, J. C. Bell, D.N. Smith et al. // Theoretical and Applied Genetics. 1996. Vol. 92, № 6. P. 673-679.
7. Epperson B. K. Multilocus estimation of genetic structure within populations // Theoretical population biology. 2004. Vol. 65, № 3. P. 227-237.
8. Development and characterization of 25 EST-SSR markers in Pinus sylvestris var. mongolica (Pinaceae) / P. Fang, S. Niu, H. Yuan et al. // Applications in Plant Sciences. 2014. Vol. 2, № 1. P. 1-4.
9. Goudet J. FSTAT (version 1.2): a computer program to calculate F-statistics // The Journal of Heredity. 1995. Vol. 86, № 6. P. 485-486.
10. Kashi Y., Soller M. Functional roles of microsatellites and minisatellites // Microsatellites: evolution and applications. 1999. P. 10-23.
11. Microsatellites within genes: structure, function, and evolution / Y. C. Li, A. B. Korol, T. Fahima et al. // Molecular Biology and Evolution. 2004. Vol. 21, № 6. P. 991-1007.
12. Origin, evolution and genome distribution of microsatellites / E. J. Oliveira, J. G. Padua, M. I. Zucchi // Genetic and Molecular Biology. 2006. Vol. 29. P. 294-307.
13. Micro-Checker: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data / C. Oosterhout, W. F. Hutchinson, P. M. Wills Derek et al. // Molecular Ecology Notes. 2004. Vol. 4, № 3. P. 535-538.
14. Peakall R., Smouse P. E. GenAlEx V6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research // Molecular Ecology Notes. 2006. Vol. 6, № 1. P. 288-295.
15. Rowold D. J., Herrera R. J. On human STR subpopulation structure // Forensic Science International. 2005. Vol. 151, № 1. P. 59-69.
16. Novel polymorphic nuclear microsatellite markers for Pinus sylvestris L. / F. Sebastiani, F. Pinzauti, S. T. Kujala et al. // Conservation Genetics Resources. 2012. Vol. 4. P. 231-234.
17. Characterization of microsatellite loci in Pinus sylvestris L. / N. Soranzo, J. Provan, W. Powell // Molecular Ecology. 1998. Vol. 7, № 9. P. 1247-1263.
REFERENCES
1. Perepechina I. O., Grischechkin S. A. Probabilistic calculations in DNA fingerprinting : method. Recommendations. Moscow, EKTs Ministry of Internal Affairs of Russia, 1996, 16 p.
2. Sannikov S. N., Sannikova N. S., Petrova I. V. Outlines of Theory of Forest Populational Biology. Ekaterinburg, Botanical Garden Ural Branch of Russian Academy of Sciences, 2012, 248 p.
3. Characteristics of the populations of the Russian Federation according to a panel of fifteen loci used for DNA identification and in forensic medical examination / V. A. Stepanov, O. P. Balanovckii, A. V. Melnikov et al. // Acta Naturae. 2011, Vol. 3, No. 2, P. 59-71.
4. Conifer Microsatellite handbook / L. Auckland, T. Bui, Y. Zhou et al. // College Station, TX, USA Texas A & M. University, 2002.
5. Chapuis M.-P., Estoup A. Microsatellite Null Alleles and Estimation of Population Differentiation // Molecular Biology and Evolution. 2007, Vol. 24, No. 3, P. 621-631.
6. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers / M. E. Devey, J. C. Bell, D.N. Smith et al. // Theoretical and Applied Genetics. 1996, Vol. 92, No. 6, P. 673-679.
7. Epperson B. K. Multilocus estimation of genetic structure within populations // Theoretical population biology. 2004, Vol. 65, No. 3, P. 227-237.
8. Development and characterization of 25 EST-SSR markers in Pinus sylvestris var. mongolica (Pinaceae) / P. Fang, S. Niu, H. Yuan et al. // Applications in Plant Sciences. 2014, Vol. 2, No. 1, P. 1-4.
9. Goudet J. FSTAT (version 1.2): a computer program to calculate F-statistics // The Journal of Heredity. 1995, Vol. 86, No. 6, P. 485-486.
10. Kashi Y., Soller M. Functional roles of microsatellites and minisatellites // Microsatellites: evolution and applications. 1999, P. 10-23.
11. Microsatellites within genes: structure, function, and evolution / Y. C. Li, A. B. Korol, T. Fahima et al. // Molecular Biology and Evolution. 2004, Vol. 21, No. 6, P. 991-1007.
12. Origin, evolution and genome distribution of microsatellites / E. J. Oliveira, J. G. Padua, M. I. Zucchi // Genetic and Molecular Biology. 2006, Vol. 29, P. 294-307.
13. Micro-Checker: software for identifying and correcting genotyping errors in microsatellite data / C. Oosterhout, W. F. Hutchinson, P. M. Wills Derek et al. // Molecular Ecology Notes. 2004, Vol. 4, No. 3, P. 535-538.
14. Peakall R., Smouse P. E. GenAlEx V6: Genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research // Molecular Ecology Notes. 2006, Vol. 6, No. 1, P. 288-295.
15. Rowold D. J., Herrera R. J. On human STR subpopulation structure // Forensic Science International. 2005, Vol. 151, No. 1, P. 59-69.
16. Novel polymorphic nuclear microsatellite markers for Pinus sylvestris L. / F. Sebastiani, F. Pinzauti, S. T. Kujala et al. // Conservation Genetics Resources. 2012, Vol. 4, P. 231-234.
17. Characterization of microsatellite loci in Pinus sylvestris L. / N. Soranzo, J. Provan, W. Powell // Molecular Ecology. 1998, Vol. 7, No. 9, P. 1247-1263.
© Шуваев Д. Н., Ибе А. А., Щерба Ю. Е., Сухих Т. В., Шилкина Е. А., Усова Е. А., Лисотова Е. В., Репях М. В., Ступакова О. М., 2020
Поступила в редакцию 02.10.2020 Принята к печати 14.12.2020
