CC BY
27
УДК 575.174.015.3
Хвойные бореальной зоны. 2020. Т. XXXVIII, № 5-6. С. 290-296
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТОКОЛОВ ЭКСТРАКЦИИ ДНК ИЗ ДРЕВЕСИНЫ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ*
Д. Н. Шуваев1, 2, А. А. Ибе2, Ю. Е. Щерба1, Т. В. Сухих2, Е. А. Шилкина2, Е. А. Усова1, Е. В. Лисотова1, М. В. Репях1, О. М. Ступакова1
1 Сибирский государственный университет науки и технологий имени академика М. Ф. Решетнева Российская Федерация, 660037, г. Красноярск, просп. им. газеты «Красноярский рабочий», 31
2Центр защиты леса Красноярского края Российская Федерация, 660036 г. Красноярск, Академгородок 50a, корп. 2 E-mail: denis.shuvaev@gmail.com
Проведена апробация трех методов экстракции ДНК из образцов древесины сосны обыкновенной и подобран протокол, при котором качественные и количественные показатели ДНК соответствуют требованиям успешного проведения полимеразной цепной реакции для работ по ДНК-идентификации нелегально заготовленной древесины.
Наилучшие результаты экстракции ДНК из древесины были получены для образцов тканей флоэмы при использовании модифицированного протокола Devey с добавлением 4 % поливинилпирролидона (PVP). Аналогичный протокол экстракции из образцов ранней древесины продемонстрировал хорошие результаты при процедуре повторного концентрирования пробы. Контроль качественных и количественных показателей ДНК из образцов древесины проводили путем ее сравнения с ДНК, выделенной из свежего материала хвои (контроль). Чистота препаратов ДНК из образцов флоэмы и ранней древесины по соотношению поглощений при длинах волн 260 нм и 280 нм не отличалась от контроля. Количество тотальной ДНК, выделенной из образцов флоэмы и ранней древесины, было в среднем в 15 и 150 раз ниже, чем из хвои, соответственно. Тем не менее, данного количества ДНК было достаточно для успешного проведения полимеразной цепной реакции с 10 локусами ядерной микросателлитной ДНК. Успех амплификации для образцов из флоэмы составил 97,5 % - для образцов из ранней древесины - 95 %. Единичные случаи выпадения аллелей были отмечены для локусов: PtTx4001, PtTx4011, lw_isotig27940, Psyl57. К указанным локусам следует проявить повышенное внимание при анализе и интерпретации данных многолокусных генотипов.
Ключевые слова: сосна обыкновенная, древесина, нелегальные рубки, протокол экстракции, качественные показатели ДНК, микросателлиты.
Conifers of the boreal area. 2020, Vol. XXXVIII, No. 5-6, P. 290-296
THE ESTIMATION OF EFFICIENCY DNA-EXTRACTION PROTOCOLS FROM WOOD OF SCOTS PINE
D. N. Shuvaev1, 2, A. A. Ibe2, Yu. Е. Shcherba1, T. V. Sukhikh2, E. А. Shilkina2, Е. А. Usova1, Е. V. Lisotova1, M. V. Repyah1, О. М. Stupakova1
1Reshetnev Siberian State University of Science and Technology 31, Krasnoyarskii rabochii prospekt, Krasnoyarsk, 660037, Russian Federation 2Protection Center of the Krasnoyarsk Territory buil. 2, 50a, Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russian Federation E-mail: denis.shuvaev@gmail.com
We conducted the testing for three protocols of DNA-extraction from wood of Scots pine. As a result was defined protocol which showed the good estimates of quality and quantity for extracted DNA. This DNA could be used for amplification of SSR-loci with aiming to the development ofDNA-"fingerprints" methods for control of illegal logs.
The best results of DNA-extraction were found for sapwood-samples with using modified Devey-protocol with the addition of 4 % polyvinylpyrrolidone (PVP). This protocol showed the good results for early wood but only together with the using repeated sample concentration procedure. The extracted DNA from sapwood and early wood was
* Работа поддержана Красноярским краевым фондом науки в рамках реализации проекта «Разработка метода ДНК-фингерпринтинга для оценки легальности происхождения древесины сосны обыкновенной в Красноярском крае».
Сбор материала для исследований выполнен при частичной поддержке проекта «Фундаментальные основы защиты лесов от энтомо- и фитовредителей в Сибири» (№ ЕЕЕЕ-2020-0014).
Хвойные бореальной зоны. XXXVIII, № 5-6, 2020
compared with DNA from fresh needle (control samples). The absorbance (A) of wood and sapwood DNA-samples did not differ from control samples at ratio 260/280 nm. However, the average quantity of DNA from sapwood and early wood was 15 and 150 times less than for DNA from fresh needle, accordingly. Nevertheless, these quantities of DNA were enough for a successful amplification with the ten nuclear microsatellites loci. The success of amplification for sapwood-DNA and early wood-DNA was 97.5 % and 95 %, accordingly. The sporadic cases of drop out alleles were noted for loci: PtTx4001, PtTx4011, lw_isotig27940, Psyl57. These loci need for extra attention at the analysis and interpretation of multilocus genotypes data.
Keywords: Scots pine, wood, illegal logs, extraction protocol, quality indicators of DNA, microsatellite loci.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время происходит активное внедрение методов молекулярно-генетического анализа в большинство сфер хозяйственной деятельности человека. Их успешно применяют для идентификации продукции ГМО, возбудителей заболеваний, паспортизации сортов и пород в селекции, в практике судебно-медицинской экспертизы и т. д.
С резким увеличением количества информации о строении и функциях геномов древесных видов, в том числе хвойных, стало возможным применять данные методы и для решения задач лесного хозяйства.
Сохранение лесных ресурсов и их рациональное использование является приоритетным направлением в области охраны окружающей среды. Нелегальная заготовка древесины относится к одной из наиболее острых экологических и экономических проблем во всем мире. В Российской Федерации на нелегальный оборот древесины приходится от 10 до 35 % всех лесозаготовок [1]. Среди регионов России одним из крупнейших запасов лесных ресурсов обладает Красноярский край, где сосредоточено 14,2 % от общероссийского запаса леса (по данным Министерства лесного хозяйства Красноярского края за 2019 год). Согласно данным государственного лесного реестра по Красноярскому краю, сосна обыкновенная занимает второе место после лиственницы по распределению площади лесов и запасов древесины. Тем не менее, по объемам заготавливаемой древесины сосна обыкновенная практически не уступает лиственнице.
Для противодействия фактам незаконных рубок эффективным инструментом может стать применение методов анализа ДНК с целью установления законности происхождения древесины. Аналогичные методологические подходы уже длительное время используются и хорошо себя зарекомендовали в процедуре установления личности подозреваемых в совершении преступлений. В случае расследования фактов незаконных рубок, образцами с мест преступления должны служить пни и порубочные остатки. Образцами, изъятыми у подозреваемых в совершении преступления, служат образцы сортимента, не имеющие сопроводительных документов.
Однако немаловажным фактором, влияющим на успешность проведения криминалистической ДНК-экспертизы, является получение качественных препаратов ДНК. В качестве традиционного материала для экстракции ДНК из растительных объектов используют зеленые части растений (листья, хвоя и др.). Эффективность экстракции ДНК из данного материала различается в зависимости от видовой принадлежности растения, но в целом дает удовлетворительные
результаты [4]. В случае расследования фактов незаконных рубок материалом для экстракции ДНК служит древесина. Сложность экстракции ДНК из древесины хвойных пород, и в частности сосны обыкновенной, обусловлена особенностями ее строения и химического состава. Большая часть древесины состоит из мертвых клеток-трахеид, выполняющих проводящую и механическую функции [2]. Данное обстоятельство накладывает ряд ограничений на критерий получения достаточного количества матрицы ДНК с высокой степенью ее интактности. Совокупность следующих факторов, таких как прочные клеточные стенки, смоляные ходы, вторичные метаболиты, среди которых присутствуют химические соединения фенольной природы, полисахариды, высокомолекулярные спирты и др., в целом негативно влияют на успешность прохождения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ускоряют процессы деградации ДНК.
Это может приводить к ошибкам при генотипиро-вании образцов и увеличению затрат на анализ одного образца. Ошибки генотипирования потенциально могут привести и к более серьезным последствиям в форме ложных экспертных заключений по делам о проведении незаконных рубок. Поэтому тестирование протоколов экстракции ДНК из древесины и верификация панели микросателлитных локусов являются необходимыми условиями проверки пригодности разрабатываемой маркерной панели.
Можно выделить следующие основные критерии оценки препаратов ДНК:
1) масса тотальной ДНК в пересчете на нанограмм в 1 микролитре (нг/мкл);
2) степень деградации ДНК, что условно выражается в соотношении количеств низкомолекулярных и высокомолекулярных фракций ДНК;
3) чистота препаратов ДНК, т. е. минимально возможное присутствие в них различных примесей, способных ингибировать прохождение полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Препараты ДНК должны соответствовать всем вышеперечисленным критериям, так как несоответствие только одному из них может негативно влиять на прохождение ПЦР. От качества ДНК-матрицы напрямую зависит результат ПЦР. Низкое качество препаратов ДНК может привести к неспецифической амплификации, выпадению тяжелых цепей ДНК и отсутствию амплификации как таковой.
Существует достаточно большое количество методических работ, посвященных проблеме экстракции ДНК из древесины различных видов древесных растений. Однако следует отметить, что подавляющая
часть подобных исследований ограничена непосредственно самим этапом экстракции ДНК и не сосредоточена на дальнейшей верификации какого-то определенного набора генетических маркеров. В других случаях набор маркеров ограничен использованием универсальных рибосомальных последовательностей, которые имеют широкую представленность в геноме, и эффективность их амплификации не представляет значительных трудностей a priory. Данное обстоятельство имеет немаловажное значение, так как даже сравнительно простые и нетребовательные микроса-теллитные локусы ДНК имеют значительный уровень разброса в воспроизводимости результатов анализа в зависимости от качества препаратов ДНК.
Поэтому основной целью нашего исследования стал поиск эффективных протоколов экстракции ДНК из древесины сосны обыкновенной с последующей проверкой стабильности амплификации на начальной тестовой панели микросателлитных локусов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Материалом для исследования послужила древесина из кернов и хвоя 60-80-летних деревьев сосны обыкновенной, произрастающих на территории Караульного участкового лесничества Красноярского края. Объем выборки составил 30 деревьев.
Отбор образцов кернов проводили согласно следующей методике.
С помощью возрастного бурава от каждого дерева брали три керна. Сверление проводили в направлении, перпендикулярном продольной оси дерева, на высоте 1,3 м. Керны брали по одному радиусу. После забора образцов кернов с каждого дерева, желоб возрастного бурава, сверло бурава и экстрактор промывали 70 % этиловым спиртом и прокаливали в пламени спиртовки. Высверленные керны (по 3 шт.) упаковывали в отдельные полиэтиленовые пакеты и помещали в сумку-холодильник. Образцы были отправлены в лабораторию, где их хранили в низкотемпературном морозильнике при -70 °С до экстракции ДНК.
Одновременно с отбором кернов проводили сбор образцов хвои, которые представляли собой ветки длиной до 10 см. Образцы хвои также помещали в сумку-холодильник до отправки к месту анализа. По прибытию в лабораторию ДНК из свежих образцов хвои была выделена немедленно, согласно стандартному протоколу Devey [6] из 50 мг ткани. Препараты ДНК из свежего материала хвои служили стандартом сравнения (контроль).
Качество препаратов ДНК оценивали по следующим показателям: тотальное количество матрицы ДНК в пробе в микрограммах, чистота препаратов ДНК по показателям поглощения (A) при длинах волн 260 и 280 нм. Измерения проводили при помощи спектрофотометра Nanodrop P330 (Implen, Франция).
Оценку степени деградации ДНК осуществляли с помощью гель-электрофореза в 1%-м агарозном геле в 1X TAE-буфере на горизонтальных камерах (Sub-Cell GT Cell, Bio-Rad Laboratories, США). В качестве стандартного маркера длин фрагментов был исполь-
зован набор GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Fisher Scientific, США). Гели были окрашены в растворе бромистого этидия и проявлены в УФ на трансиллюминаторе (Vilber-Lourmat, Франция).
Стабильность амплификации с образцами ДНК из древесины проверяли при помощи тестовой панели из 10 ядерных микросателлитных локусов: PtTx2146, PtTx3107, PtTx3025, PtTx4001, PtTx4011 [5], lw_isotig04195, lw_isotig04306, lw_isotig27940 [7], Psyl57 [9], SPAC11.4 [10]. Для постановки полимеразной цепной реакции использовали коммерческий набор GenPakPCRCore (ООО «НПФ Генлаб»), согласно инструкции фирмы-производителя.
Продукты амплификации анализировали методом вертикального гель-электрофореза (VE-20, Хеликон, Россия) в 6%-м неденатурирующем полиакриламид-ном геле в 1Х-ТАЕ-буфере при 80 Вт в течение 3 часов с последующей окраской бромистым этидием и визуализацией на трансиллюминаторе (Vilber Lourmat, Франция). В качестве стандартного маркера длин фрагментов была использована ДНК плазмиды pBR322, обработанная рестриктазой OTAII (Сибэн-зим, Россия). Генотипирование проводили в программе Photo-Capt 12.4 (Vilber Lourmat, Франция).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Образцы хвои являлись контрольными. ДНК из свежих образцов хвои была выделена согласно стандартному протоколу экстракции ДНК из растений [6] и служила в качестве стандарта сравнения.
Каждый образец керна был разделен на две части для проведения отдельных процедур экстракции ДНК.
Первая часть представляла образец луба (флоэмы) (50 мг). ДНК из флоэмы выделяли согласно модифицированному протоколу Devey [6] с добавлением 4 % PVP (поливинилпирролидон) в буфер для экстракции.
У сосны обыкновенной многочисленные и крупные смоляные ходы обычно расположены в поздней древесине годичного слоя [2]. Поэтому был проведен целенаправленный отбор стружки ранней древесины при помощи стерильной бритвы, избегая зон темно-окрашенной и более плотной поздней древесины. Таким образом, вторая часть керна была представлена образцами стружки ранней древесины заболони. Масса каждого образца древесной стружки составила 250-300 мг. Использование большего количества образца древесины для процедуры выделения нецелесообразно ввиду невозможности дальнейшей очистки ДНК от полифенолов [8].
ДНК из ранней древесины экстрагировали согласно трем протоколам: стандартный протокол Devey, модифицированный протокол Devey с добавлением 4 % PVP и модифицированный протокол Devey с добавлением 4 % PVP и процедурой повторного концентрирования пробы, которая заключалась в повторной (2--3-х кратной) промывке измельченного с толченым стеклом до пастообразного состояния образца древесины с буферным раствором и 5 M раствором хлорида натрия. Таким образом, супернатант после центрифугирования был отобран 2-3 раза, что позволяло довести общий объем раствора ДНК в буфере до 1 мл.
Хвойные бореальной зоны. XXXVIII, № 5-6, 2020
ДНК из хвои и флоэмы растворяли в 200 мкл деи-онизированной воды. ДНК из древесины с процедурой концентрирования пробы была растворена в 50 мкл деионизированной воды. В остальных вариантах экстракции ДНК из древесины препараты растворяли в 25 мкл деионизированной воды.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка показателей чистоты и массы препаратов тотальной ДНК
Измерение концентрации и расчет массы тотальной ДНК, выделенной из хвои, флоэмы и ранней древесины показало, что усредненные значения массы значительно варьировали (табл. 1). Масса ДНК из хвои в среднем выше аналогичного показателя для ДНК флоэмы в 15 раз, а для ДНК из ранней древесины в варианте протокола с концентрированием пробы в 150 раз. Экстракция ДНК из ранней древесины без применения процедуры концентрирования пробы да-
вала недостаточные количества ДНК - менее нижней границы чувствительности прибора (5 нг/мкл).
Средняя масса препаратов тотальной ДНК из древесины была низкой и составила 1,13 мкг. Однако при пересчете на концентрацию ДНК она составила 22,6 нг/мкл, что соответствует приемлемому значению при постановке полимеразной цепной реакции [3].
Отношение поглощения при длинах волн 260 и 280 нм показывает чистоту препарата ДНК. Препарат считается чистым, если отношение A260/A280 приблизительно равно или превосходит значение 1,8. В случае меньших значений показателя препарат содержит большое количество примесей, имеющих максимум поглощения при 280 нм (например, соединения фенольной природы) [4].
Отношение поглощений A260/A280 не менее 1,8 наблюдается для всех препаратов ДНК, выделенных из хвои, флоэмы и древесины с 4 % PVP и повторным концентрированием пробы.
Таблица 1
Качественные и количественные показатели ДНК в зависимости от протокола экстракции и типа ткани
№ Свежая хвоя Флоэма, 4 % PVP Древесина, 4 % PVP, Древесина, Древесина, стан-
повторное конц. пробы 4 % PVP дартныи протокол
A260/ Масса A260/ Масса A260/ Масса A260/ Масса A260/ Масса
A280 ДНК, мкг A280 ДНК, мкг A280 ДНК, мкг A280 ДНК, мкг A280 ДНК, мкг
1 2,00 100 1,85 2,40 1,85 1,20 1,72 - 1,56 -
2 1,85 119 1,97 6,90 2,07 1,45 1,86 - 1,11 -
3 1,94 164 1,96 10,40 2,14 1,13 1,75 - 1,53 -
4 1,88 189 2,00 6,60 1,90 0,95 1,94 - 1,56 -
5 1,89 151 1,98 9,10 1,89 2,08 1,71 - 1,65 -
6 2,01 197 2,00 8,80 2,00 0,50 1,84 - 1,55 -
7 1,82 186 1,96 9,20 1,91 1,00 1,79 - 1,33 -
8 1,90 160 1,95 8,40 2,00 1,25 1,95 - 1,50 -
9 2,04 165 1,92 9,80 1,89 2,13 1,69 - 1,50 -
10 1,82 168 1,93 11,00 1,90 2,70 1,79 - 1,27 -
11 1,99 126 1,96 15,50 1,92 1,83 1,77 - 1,40 -
12 1,89 124 1,94 10,10 2,05 2,00 1,73 - 1,44 -
13 1,82 166 1,94 13,60 1,94 1,55 1,77 - 1,54 -
14 1,87 164 1,96 13,70 1,91 2,05 1,89 - 1,93 -
15 1,83 127 1,85 6,10 1,89 1,23 1,83 - 1,76 -
16 1,81 108 1,92 9,40 1,84 0,68 1,91 - 1,67 -
17 1,81 179 1,92 13,71 1,81 0,14 1,87 - 1,41 -
18 1,96 195 1,95 8,43 1,89 0,97 1,87 - 1,54 -
19 1,96 112 1,82 7,16 1,84 0,23 1,95 - 1,49 -
20 2,07 172 1,84 16,07 1,95 1,22 1,75 - 1,46 -
21 1,90 173 1,91 10,99 1,96 1,26 1,85 - 1,58 -
22 1,89 140 1,96 14,06 1,88 0,53 1,77 - 1,47 -
23 2,07 160 1,88 6,53 1,87 0,17 1,83 - 1,27 -
24 2,00 184 1,94 9,30 1,86 0,21 1,90 - 1,48 -
25 1,93 158 1,81 13,49 1,91 1,35 1,82 - 1,44 -
26 1,88 155 1,84 14,35 1,93 1,33 1,83 - 1,46 -
27 1,94 123 1,87 10,22 1,84 1,11 1,85 - 1,65 -
28 1,91 158 1,85 10,08 1,82 0,91 1,94 - 1,30 -
29 2,03 115 1,84 12,31 1,89 0,53 1,73 - 1,57 -
30 1,80 103 1,92 10,71 1,87 0,25 1,84 - 1,28 -
^ 1,92 151 1,91 10,28 1,91 1,13 1,82 - 1,49 -
Примечание: ^ - среднее арифметическое значений.
Несколько более низкие значения соотношений A260/A280 были обнаружены у препаратов ДНК, выделенной из древесины с 4 % PVP, но без процедуры концентрирования пробы. Это можно объяснить значительно более низкой концентрацией ДНК в препаратах, что увеличивает относительную фоновую флуоресценцию примесей. Препараты ДНК из древесины, выделенные без использования поливинил-пирролидона, продемонстрировали соотношения A260/A280 ниже приемлемого уровня в 1,8, что указывает на их малую пригодность для дальнейших процедур анализа с помощью полимеразной цепной реакции. Сниженный показатель A260/A280 указывает на фенольное загрязнение. Также было отмечено побурение осадка ДНК после высушивания, что служит дополнительным признаком повышенной концентрации полифенолов в конечном препарате.
Следует отметить, что в рамках одного источника экстракции (хвоя, флоэма, древесина) наблюдается 2-5-кратный разброс значений массы тотальной ДНК. Причиной могло послужить отсутствие автоматизации на стадии гомогенизации образцов. При экстракции ДНК из материала хвои данное обстоятельство не является критическим, вследствие «избыточной» концентрации ДНК даже у образцов с самым низким ее показателем. Однако при выделении ДНК из флоэмы и древесины - это может послужить причиной отсутствия продукта амплификации.
Оценка степени деградации матрицы ДНК
Следующим этапом оценки качества препаратов стала проверка степени деградации матрицы ДНК по соотношению ее высоко- и низкомолекулярных фракций с помощью электрофореза в агарозном геле. Для данного анализа были отобраны препараты ДНК
из хвои, флоэмы и древесины в варианте протокола с концентрированием пробы.
Присутствие высокомолекулярных фракций ДНК в диапазоне от более 10 тыс. п. о. до 4-5 и 1 тыс. п. о. было отмечено почти во всех образцах ДНК из хвои и флоэмы. Относительные количества вышеуказанных фракций для флоэмы были ниже, чем для ДНК из хвои, что согласуется с результатами измерений концентрации суммарной ДНК. Практически все препараты из древесины показали отсутствие следов высокомолекулярной фракции ДНК, за исключением образцов 14 и 15, для которых были отмечены незначительные количества фракции в области 1 тыс. п. о. (рис. 1).
Теоретически, обнаруженные различия свидетельствуют о малой пригодности препаратов ДНК из древесины для исследования изменчивости длинных фрагментов повторяющейся ДНК (например, анализ минисателлитных локусов). Однако анализ коротких фрагментов ДНК, таких как микросателлитные локу-сы, менее требователен к степени деградации ДНК.
Верификация панели микросателлитных локусов ядерной ДНК
Последним этапом проверки пригодности препаратов ДНК для целей анализа в расследовании фактов незаконных рубок стало сопоставление их электрофо-ретических спектров со спектрами продуктов полиме-разной цепной реакции, полученными из ДНК образцов хвои, с помощью панели 10 ядерных микросател-литных локусов (рис. 2).
Основными критериями оценки амплификации послужили: общий успех амплификации локусов, выраженный через отношение числа образцов, для которых амплификация прошла к общему числу образцов (%), и локусы, для которых было отмечено выпадение аллелей (табл. 2).
тшшшшшшт *%»»ц»пп1
м 1 2 3 4 5 6 7 S м 9 10 11 12 13 14 15 16
1 2 3 4 М 5 6 7 8 9 10 11 12 М 13 14 15 16 Рис. 1. Электрофореграмма тотальной ДНК в агарозном геле:
А - хвоя; Б - флоэма; В - ранняя древесина; М - маркер молекулярного веса (1-10 тыс. п. о.); 1-16 - порядковые номера образцов
А Б В
Рис. 2. Результаты амплификации ядерных микросателлитных локусов: А - хвоя; Б - флоэма; В - ранняя древесина
Таблица 2
Оценка амплификации ядерных микросателлитных локусов на препаратах ДНК
№ Наименование локуса Хвоя, % Флоэма, % Древесина, %
1 PtTx2146 100 93,75 100
2 PtTx3025 100 100 100
3 PtTx3107 100 100 93,75
4 PtTx4001 100 87,5 100
5 PtTx4011 100 93,75 75
6 lw isotig04306 100 100 100
7 lw isotig27940 100 100 100
8 lw isotig04195 100 100 100
9 Psyl57 100 100 100
10 SPAC11.4 100 100 81,25
Общий успех амплификации 100 97,5 95
Из приведенной таблицы следует, что наиболее сложными для амплификации микросателлитными локусами оказались РТх4001 и РТх4011. Для данных локусов также было отмечено по одному случаю выпадения аллелей. Единичные случаи выпадения аллелей были обнаружены для ДНК из флоэмы у локуса lw_isotig27940 (рис. 2, б) и для ДНК из ранней древесины у локуса Psyl57 (рис. 2, в). При проведении генетического анализа данные локусы требуют повышенного внимания, ввиду возможности выпадения аллелей, что может привести к неправильной идентификации генотипа дерева. У остальных локусов выпадения аллелей не было обнаружено. Пониженные значения успеха амплификации для локусов 8РЛС11.4, Р0х3107 и РОХ2146 можно объяснить систематической ошибкой в процессе проведения анализа, что корректируется повторной процедурой экстракции ДНК и постановкой ПЦР.
Аналогичные реакции ПЦР с маркерной панелью локусов были проведены также и для препаратов ДНК, выделенных из древесины без процедуры концентрирования пробы. Для большинства локусов результаты показали полное отсутствие продуктов амплификации. У трех локусов: lw_isotig04306,
lw_isotig04195 Psyl57 продукты амплификации были представлены гомозиготными генотипами, т. е. случаем с полным выпадением тяжелых аллелей.
ВЫВОДЫ
Таким образом, основываясь на совокупности изложенных результатов исследования качественных и количественных показателей ДНК, мы предлагаем следующие рекомендации при проведении работ по экстракции ДНК из древесины сосны обыкновенной:
1) для использования микросателлитного анализа в расследовании фактов незаконных рубок сосны обыкновенной наибольший интерес, как материал для экстракции ДНК с точки зрения ее выходных качественных и количественных показателей, представляет флоэма;
2) в случае отсутствия возможности использовать ткань флоэмы для экстракции ДНК, следует проводить экстракцию из ранней древесины по модифицированному протоколу Devey с 4 % PVP и процедурой повторного концентрирования пробы;
3) тестирование препаратов ДНК с помощью панели из 10 ядерных микросателлитных локусов показало высокий общий процент успеха амплификации
при использовании рекомендуемых протоколов экстракции ДНК. Однако были обнаружены случаи выпадения аллелей у локусов PtTx4001, PtTx4011, lw_isotig27940 и Psyl57, что следует принять во внимание при их использовании.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЕ ССЫЛКИ
1. Кузьмичев Е. П., Трушина Е. Г., Лопатин Е. В. Объемы незаконных рубок лесных насаждений в Российской Федерации // Лесохоз. информ. : электрон. сетевой журн. 2018. № 1. С. 63-77.
2. Леонтьев Л. Л. Строение древесины : учеб. пособие по курсу «Древесиноведение с основами лесного товароведения» ; СПбЛТА. СПб., 2002. 82 с.
3. Падутов В. Е., Баранов О. Ю., Воропаев Е. В. Методы молекулярно-генетического анализа. Минск : Юнипол, 2007. 176 с.
4. Рябушкина Н. А., Омашева М. Е., Галиакпаров Н. Н. Специфика выделения ДНК из растительных объектов // Биотехнология. Теория и практика. 2012. № 2. С. 9-26.
5. Conifer Microsatellite handbook / L. Auckland, T. Bui, Y. Zhou et al. // College Station, TX, USA Texas A & M. University, 2002.
6. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers / M. E. Devey, J. C. Bell, D. N. Smith et al. // Theoretical and Applied Genetics. 1996. Vol. 92, № 6. P. 673-679.
7. Development and characterization of 25 EST-SSR markers in Pinus sylvestris var. mongolica (Pinaceae) / Fang, S. Niu, H. Yuan et al. // Applications in Plant Sciences. 2014. Vol. 2, № 1. P. 1-4.
8. An optimized mini-preparation method to obtain high-quality genomic DNA from mature leaves of sunflower / J. T. Li, J. Yang, D. C. Chen et al. // Genetics and Molecular Research. 2007. Vol. 6. P. 1064-1071.
9. Novel polymorphic nuclear microsatellite markers for Pinus sylvestris L. / F. Sebastiani, F. Pinzauti, S. T. Kujala et al. // Conservation Genetics Resources. 2012. Vol. 4. P. 231-234.
10. Characterization of microsatellite loci in Pinus sylvestris L. / N. Soranzo, J. Provan, W. Powell // Molecular Ecology. 1998. Vol. 7, № 9. P. 1247-1263.
REFERENCES
1. Kuzmichev Е., Trushina I., Lopatin Е. Volumes of illegal Forest Loggingin Russian Federation // Forestry information. 2018, No. 1, P. 63-77.
2. Leontiev L. L. Wood structure: Textbook for the course "Wood science with the basics of forest commodity science" ; SPbLTA. Saint-Petersburg, 2002, 82 p.
3. Padutov V. Е., Baranov О. Yu., Voropaev Е. V. Molecular genetic analysis methods. Minsk, Unipol, 2007, 176 p.
4. Ryabushkina N. А., Omasheva М. Y., Galiakparov K K Specificity of DNA extraction from plant objects // Biotechnology Theory and Practice. 2012, No. 2, P. 9-26.
5. Conifer Microsatellite handbook / L. Auckland, T. Bui, Y. Zhou et al. // College Station, TX, USA Texas A & M. University, 2002.
6. A genetic linkage map for Pinus radiata based on RFLP, RAPD, and microsatellite markers / M. E. Devey, J. C. Bell, D. N. Smith et al. // Theoretical and Applied Genetics. 1996, Vol. 92, No. 6, P. 673-679.
7. Development and characterization of 25 EST-SSR markers in Pinus sylvestris var. mongolica (Pinaceae) / P. Fang, S. Niu, H. Yuan et al. // Applications in Plant Sciences. 2014, Vol. 2, No. 1, P. 1-4.
8. An optimized mini-preparation method to obtain high-quality genomic DNA from mature leaves of sunflower / J. T. Li, J. Yang, D. C. Chen et al. // Genetics and Molecular Research. 2007, Vol. 6, P. 1064-1071.
9. Novel polymorphic nuclear microsatellite markers for Pinus sylvestris L. / F. Sebastiani, F. Pinzauti, S.T. Kujala et al. // Conservation Genetics Resources. 2012, Vol. 4, P. 231-234.
10. Characterization of microsatellite loci in Pinus sylvestris L. / N. Soranzo, J. Provan, W. Powell // Molecular Ecology. 1998, Vol. 7, No. 9, P. 1247-1263.
© Шуваев Д. Н., Ибе А. А., Щерба Ю. Е., Сухих Т. В., Шилкина Е. А., Усова Е. А., Лисотова Е. В., Репях М. В., Ступакова О. М., 2020
Поступила в редакцию 02.10.2020 Принята к печати 14.12.2020
