РАЗРАБОТКА НОВЫХ АНТИГЕНОВ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТРИПАНОСОМОЗОВ ЖИВОТНЫХ И ПРИМЕНЕНИЕ ИХ ДЛЯ ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА

Христофис Г.

УДК 619:616.993.192

DOI: 10.31016/1998-8435-2021-15-1-71-78

Оригинальная статья

Разработка новых антигенов для серологической диагностики трипаносомозов животных и применение их для эпизоотологического мониторинга

Цель исследований - разработка способа получения эритроцитарных ДНК-содержащих и не содержащих антигенов Trypanosoma equiperdum и T. evansi, которые в дальнейшем могут быть использованы в серологических реакциях для дифференциации этих видов трипаносом.

Материалы и методы. Исследования выполняли в лаборатории протозоологии и Вышневолоцком филиале ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, а также в животноводческих хозяйствах Российской Федерации и других стран с использованием клинических, микроскопических, гематологических, паразитологических, молекулярно-биологических и серологических методов.

Результаты и обсуждение. Проведенные впервые исследования показали, что можно использовать эритроцитар-ные ДНК-содержащие антигены T. equiperdum и T. evansi, полученные после 3-кратного введения мышам и кроликам смеси из трипаносомного антигена с добавлением 1,0 мл адьюванта (гидрогись алюминия) и обескровливания животных после 25-30 сут. Полученный осадок использовали как антиген для серологических исследований. Опыты показали, что кровь для приготовления позитивной сыворотки можно брать, когда антитела в РДСК находятся в титрах 1:20, в РНГА и ИФА - не ниже 1:400, отрицательной - когда сыворотка крови лошадей отрицательно реагирует в РДСК, РНГА и ИФА с антигенами T. equiperdum и T. evansi. Приготовленные нами тест-системы РДСК, РНГА и ИФА с антигенами, содержащими и не содержащими ДНК T. equiperdum и T. еvansi, привели к созданию универсальной тест-системы (РНГА) для дифференциации T. equiperdum от T. evansi.

Ключевые слова: протозойные болезни, трипаносомоз, Trypanosoma evansi, T. equiperdum, антиген, экзоантиген

Прозрачность финансовой деятельности: автор не имеет финансовой заинтересованности в представленных материалах или методах

Конфликт интересов отсутствует

Для цитирования: ГеоргиуХ. Разработка новых антигенов для серологической диагностики трипаносомозов животных и применение их для эпизоотологического мониторинга // Российский паразитологический журнал. 2021. Т. 15. № 1. С. 71-78.

https://doi.org/10.31016/1998-8435-2021-15-1-71-78

Георгиу Христофис

ФГБНУ ФНЦ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной

ветеринарии им. К. И. Скрябина и Я. Р. Коваленко РАН, Россия,

109428, Москва, Рязанский проспект, 24, кор. 1, e-mail: Chgeorgiou@rambler.ru

Поступила в редакцию: 10.09.2020; принята в печать: 12.01.2021

Аннотация

Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License. The content is available under Creative Commons Attribution 4.0 License.

Original article

Development of new antigens for serologic diagnosis of animal trypanosomosis and their use for epizootic monitoring

Ch. Georgiou

Federal State Budget Scientific Institution "Federal Scientific Centre VIEV RAS", 24 Ryazansky prospect, Bldg. 1, Moscow, 109428, Russia, e-mail: Chgeorgiou@rambler.ru

Received on: 10.09.2020; accepted for printing on: 12.01.2021

Abstract

The purpose of the research is developing a method for obtaining erythrocyte antigens containing and not containing Trypanosoma equiperdum and T. evansi DNA, which can later be used in serological reactions to differentiate these types of Trypanosoma.

Materials and methods. The studies were conducted in the Protozoology Laboratory and the Vyshnevolotsk Branch of the Federal State Budget Scientific Institution "Federal Scientific Centre VIEV RAS", as well as livestock farms of the Russian Federation and other countries using clinical, microscopic, hematological, parasitological, biomolecular and serological methods.

Results and discussion. Studies carried out for the first time have shown that it is possible to use erythrocyte antigens containing the T. equiperdum and T. evansi DNA obtained after 3-fold administration to mice and rabbits of a mixture of trypanosomal antigen with addition of 1.0 ml of an adjuvant (aluminum hydroxide), and bleeding of animals at 25 to 30 days. The formed precipitate was used as an antigen for serological tests. Experiments have shown that blood for preparation of positive serum can be taken when antibodies are in titers of 1:20 in the Prolonged Complement Fixation Test, and at least 1:400 in the Indirect Hemagglutination Test and ELISA, and for negative serum when horse blood serum reacts negatively with antigens of T. equiperdum and T. evansi in the Prolonged Complement Fixation Test, Indirect Hemagglutination Test and ELISA. The test systems of the Prolonged Complement Fixation Test, Indirect Hemagglutination Test and ELISA prepared by us with antigens containing and not containing T. equiperdum and T. evansi DNA resulted in creating a universal test system (Indirect Hemagglutination Test) for differentiating T. equiperdum from T. evansi.

Keywords: protozoal diseases, trypanosomosis, Trypanosoma evansi, T. equiperdum, antigen, exoantigen

Financial Disclosure: The author has no financial or property interest in any material or method mentioned

There is no conflict of interests

For citation: Georgiou Ch. Development of new antigens for serologic diagnosis of animal trypanosomiasis and their use for epizootic monitoring. Rossiyskiy parazitologicheskiy zhurnal=Russian Journal of Parasitology. 2021; 15 (1): 71-78. (In Russ.).

https://doi.org/10.31016/1998-8435-2021-15-1-71-78

Введение

Трипаносомы - одноклеточные простейшие жгутиковые паразиты класса кинетопластид. На территории России встречаются возбудители случной болезни однокопытных (Т еquiperdum) и суры лошадей и верблюдов (Т. еуатг).

По данным МЭБ случную болезнь, вызываемую Т. еquiperdum, регистрируют в Южной Африке, на юге Западной Европы, в Южной

Америке, КНР, Среднем Востоке, Средней Азии (Киргизии, Узбекистане) и в России (Сибири). У лошадей случная болезнь протекает наиболее тяжело с высоким уровнем смертности (30-50%) [6, 13, 15, 17].

Т. evansi широко распространена в Азии, Северной Африке, Центральной и Южной Америке. К ней восприимчивы большинство видов домашних и многие виды диких животных. У непривитых лошадей и верблюдов

вызываемая этой трипаносомой болезнь сура (су-ауру), как правило, заканчивается летально [6, 14, 16, 18].

По международным правилам, ввоз лошадей из неблагополучных по случной болезни стран разрешен только при условии исключения у них данного трипаносомоза. С этой целью в основном применяют серологические тесты (чаще реакцию связывания комплемента и дополнительно иммуноферментный анализ), микроскопию и биопробу на лабораторных животных.

При проведении диагностических исследований особую сложность представляет видовая дифференциация T. equiperdum и T. evansi, поскольку они неразличимы морфологически, имеют перекрестно реагирующие антигены и многочисленные сходные участки генома [1, 2, 4, 5, 7, 10, 12].

В некоторых лабораториях в качестве дополнительного подтверждающего теста используют ПЦР с праймерами к гену RoTat1.2 VSG, гену субъединицы 5 NADH дегитрогена-зы (nad5) и другим участкам кинетопласта [4]. Однако, эти праймеры позволяют установить лишь принадлежность к подроду Trypanozoon, по меньшей мере, трех видов: T. equiperdum, T. brucei и Т. evansi [1, 3, 4, 5, 8, 9, 11]. До сих пор

никому не удалось создать универсальную тест-систему для дифференциации этих видов трипаносом методом ПЦР.

В настоящее время методы молекулярной диагностики пока не нашли широкого применения для диагностики трипаносомозов животных. Ими пользуются преимущественно в исследовательских целях.

Для оценки филогенетического сходства использовали выборку из 10-13 последовательностей миникольца кинетопласта представителей разных видов трипаносом: T. evansi, T. equiperdum и T. brucei [данные из GenBank]. На дендрограммах (рис. 1, 2) можно, с одной стороны, установить родство между пробами 13, 55, G, с другой - охватить как можно более длинный фрагмент, чтобы получить более достоверные результаты. Все исследуемые пробы 13, 55, G оказались на одной эволюционной ветви с представителями T. evansi.

Две ветви, представляющие разные группы T. evansi, и ветвь T. equiperdum, довольно близки между собой эволюционно-дивергенция между ними не превышает 0,02-0,03, и равноудалены от Т. brucei на гораздо большее расстояние, составляющее 0,26-0,27.

Оба антигена при исследовании сывороток крови лошадей показывают одинаковый

Рис. 1. Дендрограмма фрагмента в 410 н. п. из области миникольца кинетопласта, построенная методом ближайшего соседа с повторной выборкой n = 1000 в бутстрепном анализе в программе Mega 4.

Статистическая достоверность соответствующих узлов дерева приведена в процентах. Шкала делений отражает эволюционное расстояние -число замен нуклеотидов на сайт. Эволюционное расстояние рассчитано методом максимального правдоподобия. Кружками помечены пробы, исследованные в настоящей работе

Рис. 2. Дендрограмма фрагмента в 724 н. п. (см. описание к рис. 1)

результат и пока не удается дифференцировать с их помощью положительные сыворотки T. equiperdum от таковых T. evansi. Поэтому нами приготовлена серия антигенов, с помощью которых можно дифференцировать трипаносомы. Кроме применяемых в мировой практике антигенов, мы использовали и эритроцитарные ДНК-содержащие антигены T. equiperdum и T. evansi, полученные после трёхкратного введения мышам и кроликам АГ трипаносомного + 1,0 мл АГА (адьювант: гидрогись алюминия) и обескровливания после 25-30 сут.

С помощью этих антигенов изготовлены наборы компонентов для диагностики трипаносомозов лошадей в РДСК, РНГА и ИФА с ДНК-содержащими и не содержащими антигенами; положительные сыворотки, полученные от мышей, кроликов и лошадей, зараженных референтными штаммами и отрицательные - от отрицательно реагирующих лощадей.

Цель исследований - разработка способа получения эритроцитарных ДНК-содержащих и не содержащих антигенов T. equiperdum и T. evansi, которые в дальнейшем могут быть использованы в серологических реакциях для создания универсальной тест-системы для дифференциации этих видов трипаносом.

Материалы и методы

Научные исследования выполняли в лаборатории протозоологии и Вышневолоцком филиале ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН, а также в животноводческих хозяйствах Российской Федерации и других стран с использованием клинических, микроскопических, гематологических, паразитологических, молекулярно-биологических и серологических методов в соответствии с Методическими рекомендациями для серологической диагностики случной болезни лошадей с применением экзоантиге-нов T. equiperdum в ИФА (2006, 2011), Методическими рекомендациями по диагностике трипаносомозов лошадей (T. equiperdum и Т. evansi) в РНГА (2009), Временным настав -лением по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в РДСК (1997), Способом получения трипа-носомного антигена для серологической диагностики у животных (патент на изобретение RUS 2327169 20.07.2006), и современного оборудования: микроскопы Olympus, BX53 и

CARL ZEISS, низкотемпературный холодильник HAIER, INDESIT, универсальный водный термостат BWT-U BIOSAN, весы GX200, термостат MIR 262 и центрифуга MPW-380 - с вентиляцией, ИФА-ридер, термостатируемый шейкер.

Получены содержащие и не содержащие ДНК антигены T. equiperdum и Т. evansi и эри-троцитарные с ДНК-содержащими антигенами и положительные и отрицательные сыворотки обоих видов трипаносом.

Сублимационное высушивание приготовленных серий позитивных сывороток проводили без защитной среды.

Реакцию длительного связывания комплемента (РДСК) ставили согласно «Временному наставлению по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в РДСК»; реакцию непрямой гемагглю-тинации (РНГА), иммуноферментный анализ (ИФА) - согласно «Методическим рекомендациям по диагностике трипаносомозов лошадей (T. equiperdum и T. evansi).

Результаты и обсуждение

Установлено, что объектом исследования были лиофильно высушенные трипаносом-ные с ДНК содержавшими и белковыми компонентами и высокими титрами антигенами T. equiperdum и T. evansi (табл. 1).

Установлено, что присутствие и отсутствие ДНК в исследуемых пробах антигенов не влияет на белковые компоненты и на титры антигенов. Во всех исследуемых пробах титры антигенов были высокие: от 1:32 до 1:64. В дальнейшем, эти антигены могут быть использованы в серологических реакциях, таких как РДСК, РНГА и ИФА с целью создать универсальную тест-систему для дифференциации T. equiperdum и T. evansi.

Кроме выше описанных антигенов, нами использованы и эритроцитарные с ДНК-содержащими антигенами T. equiperdum (13 и 14, табл. 1) и T. evansi (55, табл. 1), полученные после трёхкратного введения мышам и кроликам АГ трипаносомного + 1,0 мл АГА (адью-вант: гидрогись алюминия) и обескровливания после 25-30 сут.

Способ заключается в том, что полученную кровь от зараженных мышей или кроликов с последующей 2-3-кратной отмывкой их с помощью центрифугирования, разрушения путем

Таблица 1

Характеристика препаратов трипаносом и результаты их исследования в ПЦР

Материал Результаты ПЦР с праймерами

Проба Описание T1 и Tr2 (температура отжига 48 оС) T1 и Tr2 (температура отжига 50 оС)

13 T. equiperdum (штамм Альфорт), изначально получен из Германии. Перевивается на собаках. Кровь после центрифугирования (надоса-дочная жидкость), лиофильно высушенная Присутствие ДНК. Присутствие белковых компонентов. Титр антигена в РДСК - 1:32-1:64 Отсутствие ДНК. Присутствие белковых компонентов. Титр антигена в РДСК - 1:32-1:64

14 T. equiperdum (штамм Альфорт), изначально получен из Германии. Перевивается на собаках. Кровь после центрифугирования (осадок), лиофильно высушенная Присутствие ДНК. Присутствие белковых компонентов. Титр антигена в РДСК - 1:32 Отсутствие ДНК. Присутствие белковых компонентов. Титр антигена в РДСК - 1:32

55 T. evansi, изначально выделена от верблюдов, перевивается на мышах. Кровь после центрифугирования (осадок), лиофильно высушенная Присутствие ДНК. Присутствие белковых компонентов. Титр антигена в РДСК - 1:16-1:32 Отсутствие ДНК. Присутствие белковых компонентов. Титр антигена в РДСК - 1:16-1:32

2-3-кратного замораживания и оттаивания, концентрировали и титровали в РДСК с положительными и отрицательными сыворотками.

После трёхкратного введения мышам и кроликам трипаносомный антиген использовали для серологической диагностики в РДСК случной болезни и суры (су-ауру). Надоса-дочную жидкость, которая образуется после первого центрифугирования лизированных эритроцитов, обрабатывали 20-25%-ным раствором полиэтиленгликоля, взятого в равном объеме, после чего полученную смесь оставляли при комнатной температуре на 12-15 мин., повторно центрифугировали при 6000 об/мин 15-20 мин, затем надосадочную жидкость удаляли, а полученный осадок использовали как трипаносомный антиген в серологических реакциях.

Плазму крови трёхкратно иммунизированных животных, которая образуется после первого центрифугирования и удаления осадка, обрабатывали 20-25% раствором по-лиэтиленгликоля, взятого в равном объеме.

Полученную смесь оставляли при комнатной температуре на 12-15 мин., повторно центрифугировали при 6000 об/мин 15-20 мин., затем надосадочную жидкость удаляли, а полученный осадок использовали как трипаносомный зкзоантиген в серологических реакциях.

В дальнейшем, содержащие и не содержащие ДНК антигены Т. equiperdum и Т. еуап$1 использовали для приготовления тест-системы РДСК, РНГА и ИФА (наборы компонентов) для диагностики трипаносомозов. Эти тест-системы использовали для мониторинга эпизоотической ситуации по случной болезни на территории РФ, для титрования изготовленных позитивных и негативных сывороток крови лошадей, кроликов, верблюдов, козлов и зебр.

Для изготовления позитивных трипаносом-ных сывороток необходимо было брать кровь от зараженных кроликов и мышей и от иммунизированных кроликов и мышей в тот момент, когда специфические антитела в РДСК находятся в титрах 1:20 и выше, в РНГА и ИФА - не ниже 1:400 (табл. 2). Для приготовления негативной

Таблица 2

Титры нативных сывороток (позитивных и негативных) крови зараженных кроликов и мышей после трёхкратного введения антигена в РДСК, РНГА и ИФА

№ серии Вид животного Рабочий титр в

РДСК РНГА ИФА

1 Зараженные мыши 1 : 40 1 : 800 1 : 800

2 Зараженные кролики 1 : 40 1 : 800 1 : 1600

3 Иммунизированные мыши 1 : 20 1 : 400 1 : 800

4 Иммунизированные кролики 1 : 40 1 : 800 1 : 800

5 Контрольные кролики - - -

6 Контрольные мыши - - -

сыворотки можно использовать только кровь от здоровых животных.

Позитивные серии сывороток были активными и не антикомплементарными. Негативные сыворотки были отрицательными и не антикомплементарные в РДСК, РНГА и ИФА.

При исследовании положительно реагирующих на случную болезнь, сыворотки с Т. гуат1 антигеном давали отрицательный результат (табл. 3) и, наоборот, давали положительный результат при исследовании их на антиген Т. equiperdum.

Таблица 3

Определение специфичности T. еvansi антигена в РДСК

Происхождение сывороток Показатель при разведении сывороток

1 : 5 1 : 10 без антигена

Фабричная сыворотка (Омская) № 1 от лошади, зараженной Т. еquiperdum Отр. Отр. Отр.

Положительная сыворотка от кроликов, зараженных Т. еvansi Пол. Пол. Пол.

Положительная сыворотка от мышей, зараженных Т. еvansi Пол. Пол. Отр.

Положительная сыворотка от кроликов, иммунизированных Т. еquiperdum Отр. Отр. Отр.

Положительная сыворотка от мышей, зараженных Т. еquiperdum Отр. Отр. Отр.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Здоровые кролики Отр. Отр. Отр.

Здоровые мыши Отр. Отр. Отр.

Таблица 4 Определение специфичности T. еquiperdum антигена в РДСК

Происхождение сывороток Показатель при разведении сывороток

1 : 5 1 : 10 без антигена

Фабричная сыворотка (Омская) № 1 от лошади, зараженной Т. еquiperdum Пол. Пол. Отр.

Положительная сыворотка от кроликов, зараженных Т. еvansi Отр. Отр. Отр.

Положительная сыворотка от мышей, зараженных Т. еvansi Отр. Отр. Отр.

Положительная сыворотка от кроликов, иммунизированных Т. еquiperdum Пол. Пол. Отр.

Положительная сыворотка от мышей, зараженных Т. еquiperdum Пол. Пол. Отр.

Здоровые кролики Отр. Отр. Отр.

Здоровые мыши Отр. Отр. Отр.

В дальнейшем антигены, позитивные и негативные сыворотки крови лошадей с целью длительного хранения высушивали. После высушивания сыворотки разводили в 1 мл физиологического раствора и вновь титровали в сравнении с негативными с высушенными антигенами. Высушенные антигены, положительные и отрицательными сыворотки крови сохраняли свою активность и не были антикомплементарными.

Заключение

Впервые показано, что кроме соматических и экзоантигенов можно использовать и эритроцитарные с ДНК содержащими антигенами Т. equiperdum и Т. evansi, полученными после трёхкратного введения мышам и кроли-

кам АГ трипаносомного + 1,0 мл АГА и обескровливания после 25-30 сут.

Впервые был отработан способ получения положительных и отрицательных сывороток крови от зараженных Т. equiperdum и Т. evansi мышей и кроликов, и от иммунизированных мышей и кроликов. Опыты показали, что кровь для приготовления позитивной сыворотки можно брать, когда антитела в РДСК находятся в титрах 1:20, в РНГА и ИФА не ниже 1:400, негативной - когда сыворотка крови лошадей отрицательно реагирует в РДСК, РНГА и ИФА с антигенами Т. equiperdum и Т. evansi.

Приготовленные нами тест системы РДСК, РНГА и ИФА с содержащими и не содержащими ДНК антигенами Т. equiperdum и Т. еvansi, привели к созданию универсальной

тест-системы (РНГА) для дифференциации этих видов трипаносом. Исследования имеют большое экономическое значение. С их помощью можно различать T. equiperdum от Т. evansi и положительно реагирующих на суру животных лечить, продавать и использовать как здоровых лошадей.

Литература

1. Василевич Ф. И., Георгиу Х., Белименко В. В., Гулюкин М. И. Практическое руководство по борьбе с кровепаразитарными болезнями домашних животных. М.: ЗооВетКнига, 2015. 86 с.

2. Георгиу Х. ИФА для диагностики трипаносомоза (дурина) лошадей // Ветеринарная патология. 2003. № 1. С. 99-101.

3. Георгиу Х. Получение высокоактивных и высокоспецифичных трипаносомных сывороток // Ветеринария и кормление. 2014. № 1. С. 26-28.

4. Георгиу Х., Белименко В. В., Самойловская Н. А. Паразитарные болезни животных из Списка МЭБ. Монография. М.: Инфра-М, 2016. 88 с.

5. Гулюкин М. И., Заблоцкий В. Т., Белименко В. В., Христиановский П. И., Саруханян А. Р. Крове-паразитарные болезни домашних животных. М.: ЗооВетКнига, 2013. 86 с.

6. Гулюкин М. И., Георгиу Х., Заблотский В. T., Ломакина Н. Ф., Юров K. П., Туратье Л. Генетические анализы для дифференциальной диагностики трипаносомозов лошадей: дурин и сурра // Ветеринария и кормление. 2015. № 2. С. 16-19.

7. Ломакина Н. Ф., Георгиу Х., Заблоцкий В. Т., Гулюкин М. И., Туратье Л. Изучение генома возбудителей трипаносомозах лошадей (T equiperdum и T. evansi) // Ветеринария. 2013. № 3. С. 29-33.

8. Ломакина Н. Ф., Георгиу Х., Гулюкин М. И. Трудности дифференциации трипаносом T. evansi и T. equiperdum // «Молекулярная диагностика»: Сборник трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. М., 2014. Т. II. С. 491-492.

9. Юров К. П., Алексеенкова С. В., Гулюкин М. И., Георгиу Х., Амирбеков М. А., Аноятбеков М. А., Махмадшоев А. Н., Шодмонов И. Ш., Давятова М. Д., Туратье Л. Дифференциальная диагностика трипаносомозов у лошадей и филогенетический анализ возбудителя сурры (Т. evansi) в Республике Таджикистан // Материалы докладов VI Международного ветеринарного конгресса. М., 2016. С. 320-322.

10. Claes F., Buscher P., Touratier L., Goddeeris B. M.

Trypanosoma equiperdum: master of disguise or

historical mistake? Trends Parasitol. 2005; 21 (7): 316-321.

11. Claes F., Radwanska M., Urakawa T. et al. Variable surface glycoprotein RoTat 1.2 PCR as a specific diagnostic tool for the detection of Trypanosoma evansi infections. Kinetoplastid Biol. Dis. 2004; 3; 3.

12. Clausen P. H., Chuluun S., Sodnomdarjaa R. et al. A field study to estimate the prevalence of Trypanosoma equiperdum in Mongolian horses. Vet. Parasitol. 2003; 115. 9-18.

13. Lai D. H., Hashimi H., Lun Z. R. et al. Adaptations of Trypanosoma brucei to gradual loss of kinetoplast DNA: Trypanosoma equiperdum and Trypanosoma evansi are petite mutants of T. brucei. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105 (6): 1999-2004.

14. Li Fj, Gasser R. B., Lai D. H., Claes F. et al. HCR approach for the detection of Trypanosoma brucei and Tr. equiperdum and their differentiation from T. evansi based on maxicircle kinetoplast DNA. Mol. Cell. Propes. 2007; 21 (1): 1-7.

15. Young R., Taylor J. E., Kurioka A., Becker M. et al. Isolation and analysis of the genetic diversity of repertoires of VSG expression site containing telomeres from Trypanosoma brucei gambiense, T. brucei and T. equiperdum. BMC Genomics. 2008; 9. 385.

16. Zablotskij V. T., Georgiu C., De Waal T. et al. The current challenges of dourine: difficulties in differentiating Trypanosoma equiperdum within the subgenus Trypanozoon. Rev. Sci. Tech. 2003; 22 (3): 1087-1096.

17. OIE Terrestrial Manual 2012. Chapter 2.1.17. P.213. http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/ Health_standards/tahm/2.01.17_TRYPAN0_ SURRA.pdf.

18. OIE Terrestrial Manual. 2008. Chapter 2.5.3. P. 845 - 851. http://www.oie.int/fileadmin/ Home/eng/Health_standards/tahm/2.05.03_ DOURINE.pdf.

References

1. Vasilevich F. I., Georgiou Ch., Belimenko V. V., Gulyukin M. I. Practical guidelines to control hemoprotozoan diseases of domestic animals. M.: ZooVetKniga, 2015; 86. (In Russ.)

2. Georgiou Ch. The ELISA for the diagnosis of equine trypanosomosis (dourine). Veterinarnaya patologiya = Veterinary pathology. 2003; 1: 99-101. (In Russ.)

3. Georgiou Ch. Obtaining highly active and highly specific sera from Trypanosoma-infected animals.

Veterinariya i kormleniye = Veterinary Medicine and feeding. 2014; 1: 26-28. (In Russ.)

4. Georgiou Ch., Belimenko V. V., Samoilovskaya N. A. Parasitic diseases of animals from the OIE List. Monograph. M.: Infra-M, 2016; 88. (In Russ.)

5. Gulyukin M. I., Zablotsky V. T., Belimenko V. V., Khristianovsky P. I., Sarukhanyan A. R. Hemoprotozoan diseases of domestic animals. M.: ZooVetKniga, 2013; 86. (In Russ.)

6. Gulyukin M. I., Georgiou Ch., Zablotsky V. T., Lomakina N. F., Yurov K. P., Touratier L. Genetic analyzes for differential diagnosis of equine trypanosomosis: dourine and surra. Veterinariya i kormleniye = Veterinary Medicine and feeding. 2015; 2: 16-19. (In Russ.)

7. Lomakina N. F., Georgiou Ch., Zablotsky V. T., Gulyukin M. I., Touratier L. Studying the genome of the causative agents of equine trypanosomiasis (T. equiperdum and T. evansi). Veterinariya = Veterinary Medicine. 2013; 3: 29-33. (In Russ.)

8. Lomakina N. F., Georgiou Ch., Gulyukin M. I. Difficulties in differentiating trypanosomes T. evansi and T. equiperdum. «Molekulyarnaya diagnostika»: Sbornik trudov VIII Vserossiyskoy nauchno-prakticheskoy konferentsii s mezhdunarodnym uchastiyem "Molecular diagnostics": Proceedings of the VIII All-Russian Scientific and Practical Conference with International Participation. M., 2014; II. 491-492. (In Russ.)

9. Yurov K. P., Alekseenkova S. V., Gulyukin M. I., Georgiou Ch., Amirbekov M. A., Anoyatbekov M. A., Makhmadshoev A. N., Shodmonov I. Sh., Davyatova M. D., Touratier L. Differential diagnosis of trypanosomiasis in horses and phylogenetic analysis of the causative agent of surra (T. evansi) in the Republic of Tajikistan. Materialy dokladov VI Mezhdunarodnogo veterinarnogo kongressa = Proceedings of the VI International Veterinary Congress. M., 2016; 320-322. (In Russ.)