Разработка мультиплексных наборов SSR-маркеров для генотипирования сортов абрикоса обыкновенного (prunusarmeniacal. )

Степанов Илья Владимирович; Супрун Иван Иванович; Анатов Джалалудин Магомедович; Лободина Елена Вадимовна; Володина Екатерина Алексеевна

УДК 575.22: 634.22 06.01.00 Агрономия

РАЗРАБОТКА МУЛЬТИПЛЕКСНЫХ НАБОРОВ SSR-МАРКЕРОВ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ СОРТОВ АБРИКОСА ОБЫКНОВЕННОГО (PRUNUS ARMENIACA L.)

Степанов Илья Владимирович1 младший научный сотрудник SPIN-код (РИНЦ): 3968-1982

Супрун Иван Иванович1 к.б.н., зав. лабораторией SPIN-код (РИНЦ) :7124-5304 [email protected]

Анатов Джалалудин Магомедович2 к.б.н., старший научный сотрудник SPIN-код (РИНЦ): 7931-5160

Лободина Елена Вадимовна1 младший научный сотрудник SPIN-код (РИНЦ):5485-5500

Володина Екатерина Алексеевна1 младший научный сотрудник SPIN-код (РИНЦ): 6714-4924

'ФГБНУ Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства, виноградарства, виноделия, лаборатория генетики и микробиологии, Краснодар, Россия.

2ФГБУН Горный ботанический сад ДНЦ РАН, Лаборатория флоры и растительных ресурсов, г. Махачкала, Россия

Генетические исследования абрикоса обыкновенного являются актуальным направлением в генетике плодовых культур. В связи с этим пополнение коллекции SSR-маркеров для генотипирования данной культуры является объективно значимой задачей. Была проведена апробация 16 SSR-маркеров, созданных ранее на миндале обыкновенном (PdUnchar2, PdSLD1, PdGMGT 1, PdTrTFGT1, PdUnchar2, PdSLD1, PdGMGT 1, PdTrTFGT1) и абрикосе сибирском (A3-72, A1-63, H2-22, A3-7-1, H2-5, A1-7, A3-9, H2-45), с целью оценки перспективности их применения для генотипирования сортов абрикоса обыкновенного. Оценка маркеров, проведенная на 3-х сортах различного происхождения, выявила маркеры и их комбинации оптимальные для их применения. В процессе исследования все апробированные SSR-маркеры были объединены в мультиплексные наборы, сформированные из 4 маркеров каждый. Это дает возможность осуществлять генотипирование по 4 маркерам при проведении единичной ПЦР. Один маркер

UDC 575.22: 634.22 Agronomy

DEVELOPMENT OF MULTIPLEX SETS OF SSR MARKERS FOR GENOTYPING APRICOT VARIETIES (PRUNUS ARMENIACA L.)

Stepanov Ilya Vladimirovich1 Junior Researcher SPIN-code (RSCI): 3968-1982

Suprun Ivan Ivanovich1 Cand.Biol.Sci., head of the laboratory SPIN-code (RSCI): 7124-5304 [email protected]

Anatov Dzhalaludin Magomedovich2 Cand.Biol.Sci., Senior Researcher SPIN-code (RSCI): 7931-5160

Lobodina Elena Vadimovna1 Junior Researcher SPIN-code (RSCI): 5485-5500

Volodina Ekaterina Alekseevna1 Junior Researcher SPIN-code (RSCI): 6714-4924 1 North-Caucasian Federal Research Center of Horticulture, Viticulture and Vine production, Krasnodar, Russia

2Mountain Botanical Garden of Dagestan Scientific Centre of Russian Academy of Sciences, Makhachkala, Russia

Genetic studies of apricot are the actual direction in the genetics of fruit crops. In this regard, the improvement of the collection of SSR markers for the genotyping of this culture is an objectively significant task. In a study for the 16 SSR-markers previously developed on almonds (PdUnchar2, PdSLD1, PdGMGT 1, PdTrTFGT1, PdUnchar2, PdSLD1, PdGMGT 1, PdTrTFGT1) and Siberian apricot (A3-72, A1-63, H2-22, A3- 7-1, H2-5, A1-7, A3-9, H2-45), approbation and evaluation of the prospects of using for genotyping Prunus armeniaca L. were performed. Approbation, performed on 3 varieties of different origin, revealed markers and their combinations optimal for their use. During the study, all tested DNA markers were grouped into multiplex sets, including 4 markers. This allows carrying out genotyping simultaneously on 4 loci in the formulation of one reaction. One marker (PdUnchar2) from the studied sample included in the multiplex set did not show amplification. Five markers gave a monomorphic product. The remaining 11 SSR markers allowed us to obtain polymorphic, cultivar-

(PdUnchar2) из исследованной выборки включенный в мультиплексный набор не дал амплификации. Пять маркеров дали мономорфный продукт. Остальные 11 SSR маркеров позволили получить полиморфные сортоспецифичные SSR-фингерпринты для всех изученных сортов. Полученные в работе мультиплексные наборы будут применены в исследовательской практике, связанной с изучением полиморфизма сортов абрикоса обыкновенного

specific SSR fingerprints for all the studied cultivar. These multiplex sets are proposed for use in studying the genetic polymorphism of the species Prunus armeniaca L.

Ключевые слова: PRUNUS ARMENIACA, SSR-МАРКЕРЫ, ГЕНОТИПИРОВАНИЕ, АПРОБАЦИЯ ДНК-МАРКЕРОВ

Keywords: PRUNUS ARMENIACA, SSR MARKERS, GENOTYPING, APPROBATION OF DNA MARKERS

Doi: 10.21515/1990-4665-144-013

Введение SSR-маркеры, в настоящее время являются наиболее востребованным методом генотипирования плодовых культур, в том числе и косточковых. Перспективность использования SSR-генотипирования в исследовательской практике во многом обусловлена целым перечнем полезных в практике характеристик данного метода.

Одна из наиболее важных положительных характеристик SSR-маркирования это высокая степень воспроизводимости результатов генотипирования, позволяющая проводить сопоставление ДНК-фингерпринтов полученных в разных лабораториях. Этот факт делает данный метод более надежным и стабильным источником информации, нежели такие методы ДНК-маркирования к RAPD, ISSR, AFLP, IRAP.

Во многом это связано с высокой восприимчивостью перечисленных мультилокусных типов ДНК-маркеров к изменениям условий проведения ПЦР. В связи с этим сопоставление ДНК-фингерпринтов полученных с применением данных методов в различных лабораториях сильно затруднено и зачастую на практике не осуществляется. Применение же SSR маркеров позволяет избежать этого при оценке результатов анализа. В ходе установления размера амплифицированных областей SSR-маркеров ошибки в оценке данных незначительны и зависят от точности метода визуализации результатов

ПЦР. Применение наиболее эффективных методов для этих целей, включая анализ с использованием автоматических генетических анализаторов, позволяет получить наиболее точные и достоверные данные.

Высокий уровень полиморфизма является также одним из важных преимуществ микросателлитных ДНК-маркеров. Он обусловлен тем, что мутации происходят в микросателлитах на порядок чаще, чем в структурных генах, что связано с уникальным процессом вставки и выпадения тандемных повторов в микросателлитных последовательностях. Благодаря данной особенности, для большинства микросателлитных локусов свойственно значительное аллельное разнообразие. Кодоминантность является еще одной ключевой характеристикой SSR-маркеров. Для проверки достоверности родословной с помощью ДНК-маркеров это немаловажно, так как позволяет отслеживать вклад каждого и родителей в генотип потомка [1].

В настоящее время актуальной задачей в прикладной генетике растений остается разработка микросателлитных маркеров и апробация их на близкородственных видов для проведения дальнейших генетических исследований.

В первых работах, направленных на изучение генетического разнообразия абрикоса с применением SSR-маркеров [2; 3; 4], были задействованы наборы маркеров, предназначенных главным образом для персика и других видов Prunus [5; 6; 7]. В целом, 50-60% SSR-маркеров, разработанных для персика дали успешную амплификацию [5; 3] и выявили значительные уровни генетическое разнообразие в абрикосе [2; 4; 3; 8]. Позднее были получены наборы праймеров с использованием информации о последовательности абрикоса [9; 10]. Первая значительная работа по генотипированию крупной выборки сортов была осуществлена

коллективом Maghuly et al. [11]. Данный исследовательский коллектив представил результаты, полученные с применением 10 полиморфных абрикосовых SSR-маркеров на коллекции из 133 сортов абрикоса. Так же оценка генетического разнообразия абрикоса и характеристики генплазмы абрикоса были выполнены с использованием молекулярных маркеров и в других работах [8; 12, 13; 14; 15]. Крупное исследование, в ходе которого было изучено генетическое разнообразие 183 генотипов абрикоса североафриканского происхождения (Алжир, Марокко и Тунис) с использованием 24 ядерных микросателлитных маркеров, было проведено в 2013 году [16].

Очевидно, что выявление эффективных микросателлитных маркеров для абрикоса обыкновенного, из перечня ДНК- маркеров, разработанных для других видов рода Prunus, является эффективным подходом в исследовательской практике. Это позволяет сократить время и финансовые издержки, необходимые для идентификации микросателлитных локусов в геноме de novo и создания эффективных праймерных пар, позволяющих получать продукты амплификации с данных SSR-последовательностей.

Исходя из актуальности вопроса пополнения базы эффективных SSR маркеров для использования в генетических исследования абрикоса обыкновенного, нами были поставлены следующие задачи:

- Провести апробацию SSR-маркеры, разработанные ранее для абрикоса сибирского и миндаля обыкновенного, на представителях вида абрикос обыкновенный;

- Сформировать мультиплексные наборы SSR-маркеров, позволяющие генотипировать образцы абрикоса обыкновенного одновременно по трем-четырем SSR-маркерам, в рамках одной ПЦР.

Материал и методы исследования Проведена апробация микросателлитных маркеров на трех сортах абрикоса, относящихся к

разным эколого-географическим группам: Шалах (Ирано-Кавказская группа), Изцюй (Китайская группа), Краснощекий (Европейская группа). Экстракцию проб ДНК проводили методом ЦТАБ [17] из тканей листа в фазу распускания. Для осуществления ПЦР был произведен подбор оптимальных параметров, таких как концентрация компонентов и температурного режима реакции. В результате был определен следующий оптимальный протокол: в общий объем ПЦР смеси 25 цЬ входили 50 нг ДНК, 0,25мМ dNTPs, 0,2 цМ каждого праймера; 2,5 цЬ 10-х буфера (ООО «Сибэнзим»), 1 u Taq-полимеразы. Проводилась ПЦР по следующей программе: начальная денатурации - 3 минут при 94°С, далее 35 циклов: денатурация при 94°С - 45 секунд, этап отжига при 58°С - 45 секунд, элонгация при 72°С - 45 секунд; заключительный этап -элонгация 4 минуты 30 секунд при 72°С. На приборе ABI prism 3130 была осуществлена оценка размеров ПЦР продуктов. Полученные результаты были обработаны в программе Gene Mapper 4.1. В работе апробировали 16 SSR-маркеров, разработанных на абрикосе сибирском: A3-72, A1-63, H2-22, A3-7-1, H2-5, A1-7, A3-9, H2-45 и на миндале обыкновенном: PdUnchar2, PdSLD1, PdGMGT1, PdTrTFGT1, PdUnchar2, PdSLD1, PdGMGT1, PdTrTFGT1 [19, 20].

Результаты. При формировании мультиплексных наборов, размер ПЦР-продуктов SSR-маркеров является базовой характеристикой, учет которой позволяет подобрать оптимальные комбинации маркеров. В мультиплексный набор желательно включать микросателлитные маркеры с различающимися по размерам диапазонами аллелей. В ситуации, когда продукты ДНК-амплификации включенные в мультиплексную смесь обладают сходными размерами, достоверная интерпретация полученных результатов затруднена из-за эффекта наложения сигналов от флоурофорных меток. Единая температура отжига праймеров, маркеров из мультиплексного набора, является

необходимым условием качественного прохождения ПЦР в мультиплексной смеси.

Каждый SSR-маркер, включенный в мультиплексный набор, имеет характерный флуоресцентный краситель: 6-карбоксиродамин ^60), карбоксифлуоресцеин (БАМ), тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA), карбокси-Х-родамин ^ОХ), с разной длиной волн флуоресценции. Каждый из выше приведенных флуоресцентных красителей обладает своим уникальным оптическим спектром, отличным от остальных красителей задействованных в наборе. В работе были применены 16 SSR маркеров, которые были сформированы в 4 мультиплексных набора каждый по четыре маркера. В первый мультиплексный набор вошли маркеры А3-72, А1-63, Н2-22, А3-7-1; ко второму мультиплексному набору отнесены маркеры Н2-5 А1-7 А3-9 Н2-45; третий мультиплексный набор включает SSR маркеры PdUnchar2, PdSLD1, PdGMGT1, PdTrTFGT1; четвертый мультиплексный набор состоит из маркеров PdBSL3, PdshkC, PdPER, PdUnchar3. Перечисленные мультиплексные наборы отражены в таблице 1.

Для всех SSR-маркеров, приведенных в таблице, указана информация о типе флуоресцентного красителя и диапазоне размеров продуктов амплификации, полученных в нашей работе. Видно, что в большинстве случаев диапазоны размеров ПЦР продуктов по отдельным маркерам, входящим в один мультиплексный набор, не перекрывается. Это обеспечивает надежную интерпретацию данных по генотипированию образцов. Только по одному маркеру (PdUnchar2) из общей выборки не прошла амплификация.

Научный журнал КубГАУ, №144(10), 2018 года Таблица 1 Мультиплексные наборы маркеров.

№ Маркер Флуорофор Диапазон (п. н.)

1 А3-72 ЯОХ 148*

А1-63 ТАМЯА 177-193

Н2-22 ЯбО 225-230

А3-7-1 БАМ 294-306

2 Н2-5 БАМ 163-169

А1-7 ТАМЯА 192*

А3-9 ЯбО 213-217

Н2-45 ЯОХ 251-257

3 РШпсИаг2 ЯбО 1

Рё8ЬБ1 ЯОХ 145-154

РёОМОТ1 ТАМЯА 196-209

РёШТОТ1 БАМ 236*

4 РёБ8Ь3 ЯОХ 141*

РёБИкС БАМ 151*

РёРБЯ ЯбО 261-273

РШпсИаг3 ТАМЯА 220-272

*У всех генотипов выявлена одна аллель 1 Отсутствует продукт амплификации

Ь«р://д .kubagro.ru/2018/10/рёШ3 .р^

Пять маркеров дали мономорфный продукт амплификации по трем сортам абрикоса (А3-72, Н2-5, РёТгТЕОТ1, РёБ8Ь3, РёБИкС). Однако, можно предположить, что данные маркеры могут проявить себя как полиморфные в случае расширения количества исследованных сортов.

File Edit View Tools Alleles Help

Plot Setting: [Microsatellite Default_v ] [P

J jfi^ Sto^S Ä

3 мялами! ал.м litfi, ттш

3-4_2018-03-20_1 .fsa

АЗ-72

Н2-22

АЗ-7-1

А1-63

...... т.---- . г. л • . jAVJ L_,«iw.ii j._L ..............je_&________а^! » . ......J . . â

Рисунок 1 Генотипирование сорта Шалах с применением мультиплексной смесь №1 включающей маркеры A3-72, A1-63, H2-22, A3-7-1.

На представленной электрофореграмме видно, что для всех микросателлитных маркеров, включенных в данный мультиплексный набор, идентифицируются ПЦР-продукты, которые не перекрываются по размерам. Они отображенные в виде пиков характерных цветов. Для всех трех сортов в ходе генотипирования были получены достоверно идентифицируемые ПЦР-продукты, что определено наличием четки, дискретных пиков на электрофореграмме. Видно, что по маркеру A1-63 детектировано одновременно два пика. Это соответствует гетерозиготности по данному микросателлитному локусу.

Как видно из представленных результатов мультиплексного фрагментного анализа, оптимальное сочетание ДНК-маркеров в

мультиплексных наборах, а также использование оптимизированных экспериментальных параметров (режим ПЦР - программы, концентрации праймеров, уровень разведения ПЦР - проб при проведении денатурации в ходе пробоподготовки для выполнения анализа на приборе АБ1рпвт3130), позволило безошибочно идентифицировать целевые пики на электрофореграммах. Очевидно, что применение мультиплексного анализа дало возможность провести генотипирование одновременно по нескольким маркерам.

В ходе работы для сортов-объектов исследования были получены 88Я-фингерпринты, представленные в таблице 2. Указан размер амплифицированных фрагментов в парах нуклеотидов. Два одинаковых значения характеризуют гомозиготность по искомому локусу, два разных значения - гетерозиготность.

Таблица 2 88Я-фингерпринты 3 сортов абрикоса по 16 маркерам

Сорта PdUnchar2 PdSLD1 PdGMGT1 PdTrTFGT1

Краснощекий - 145:145 196:209 236:236

Шалах - 145:145 209:209 236:236

Hong Yu - 145:154 209:209 236:236

PdBSL3 PdshkC PdPER PdUnchar3

Краснощекий 141:141 151:151 264:273 220:272

Шалах 141:141 151:151 261:261 220:272

Hong Yu 141:141 151:151 261:274 220:272

A3-72 A1-63 H2-22 A3-7-1

Краснощекий 148:148 189:189 230:230 294:294

Шалах 148:148 177:189 230:230 294:294

Hong Yu 148:148 191:193 225:225 304:306

H2-5 A1-7 A3-9 H2-45

Краснощекий 164:166 192:192 214:214 251:253

Шалах 163:167 192:192 219:219 251:251

Hong Yu 167:169 192:192 213:217 257:257

Из результатов, представленных в таблице, видно, что каждый сорт обладает уникальным 88Я-фингерпринтом.

Таким образом, сформированные и апробированные в работе мультиплексные наборы могут быть в дальнейшем применены в генетических исследованиях абрикоса обыкновенного. О высоком уровне кросс-воспроизводимости микросателлитных ДНК-маркеров, разработанных на виде абрикос сибирский и миндаль обыкновенный, при их использовании для генотипирования вида абрикос обыкновенный свидетельствует то факт, что из 16 апробированных ДНК-маркеров только один не дал амплификацию - PdUnchar2. Это позволяет говорить о перспективности использования такой стратегии поиска новых, информативных SSR-маркеров, перспективных для генотипирования сортов абрикоса. SSR-фингерпринты сортов, полученные в ходе работы, могут быть использованы в дальнейшем при необходимости уточнения родословных сортов, полученных с участием сортов Шалах, Краснощекий и Hong Yu в качестве одной из родительских форм, а также при возникновении спорных вопросов о сортовой принадлежности образцов.

Литература

1 Глазко В. И. ДНК-технологии в генетике и селекции: Курс лекций / В. И. Глазко, Т. Т. Глазко. // Краснодар: ВНИИ риса 2006 - 399 с.

2 Hormaza, J.I. Molecular characterization and similarity relationships among apricot (Prunus armeniaca L.) genotypes using simple sequence repeats. Theor. Appl. Genet., 2002. - 104, 321-328.

3 Zhebentyayeva, T.N. Simple sequence repeat (SSR) analysis for assessment of genetic similarity in apricot germplasm. / T.N. Zhebentyayeva, G.L. Reighard, V.M. Gorina et al // Theor. Appl. Genet. 2003. - №106, - P.435-444.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

4 Romero, C. Genetic diversity of different apricot geographical groups determined by SSR markers. / C. Romero, A. Pedryc, V. Munoz et al // Genome 2003. - №46, - P.244-252.

5 Cipriani, G AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach [Prunus persica (L.) Batsch]: isolation, characterisation and cross-species amplification in Prunus. / G. Cipriani, G. Lot, W-G Huang, et al // Theor Appl Genet, - 1999 - №99 P.65-72

6 Testolin, R. Microsatellite DNA in peach (Prunus persica L. Batsch) and its use in fingerprinting and testing the genetic origin of cultivars. / R. Testolin, M.T. Marrazzo, G. Cipriani et al // Genome 2000. - №43, - P.512-520.

7 Aranzana, M.J. Development and variability analysis of microsatellite markers in peach. / M.J. Aranzana, J. Garcia-Mas, J. Carbo, et al // Plant Breed. - 2002. - №121, -P.87-92

8 Sanchez-Perez, R. Application SSR markers in apricot breeding: molecular characterization, protection and genetic relationships. / R. Sanchez-Perez, D. Ruiz, F. Dicenta, et al // Sci. Hortic. - 2005. - №103, P.305-315.

9 Lopes, M.S. Identification of microsatellite loci in apricot. / M.S. Lopes, K.M. Sefc, M. Laimer et al // Mol. Ecol. Notes - 2002. - №2, - P.24-26.

10 Messina, R. New set of microsatellite loci isolated in apricot. / R. Messina, O. Lain, M.T. Marrazzo et al // Mol. Ecol. 2004. - Notes 4, - P.432-434.

11 Maghuly, F. Microsatellite variability in apricots (Prunus armeniaca L.) reflects their geographic origin and breeding historyt. / F. Maghuly, E.B. Fernandez, Sz. Ruthner et al // Tree Genet. Genomes - 2005. №1, - P.151-165.

12 Yilmaz, K.U. Morphological diversity of the turkish apricot (Prunus Armeniaca L.) germplasm in the irano-caucasian ecogeographical group. / K.U.Yilmaz, S. Paydas, -Kargi, S. Kafkas et al // Turk. J. Agric. For. - 2012a. - №36, - P.688-694.

13 Yilmaz, K.U. Genetic diversity analysis based on ISSR, RAPD and SSR among Turkish apricot germplasms in Iran Caucasian eco-geographical group. / K.U.Yilmaz, S. Paydas, -Kargi, S. Dogan et al // Sci. Hortic. 2012b. - №138, - P.138-143.

14 Raji, R. Investigation of variability of apricot (Prunus armeniaca L.) using morphological traits and microsatellite markers./ R. Raji, A. Jannatizadeh, R. Fattahi et al // Sci. Hortic. 2014. - №176, - P.225-231.

15 Krichena, L., Assessing the genetic diversity and population structure of Tunisian apricot germplasm. / Krichena, L., J.M. Audergonb, , N. Trifi-Faraha // 2014. Sci. Hortic. №172, - P.86-100.

16 Bourguiba H. Genetic relationships between local North African apricot (Prunus armeniaca L.) germplasm and recently introduced varieties Scientia Horticulturae / //2013 №152 P.61-69.

18 Murray, M. G., Thompson, W. F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Research, 1980. V. 10. P. 4321-4325.

19 Wang, Z. Mining new microsatellite markers for Siberian apricot (Prunus sibirica L.) from SSR-enriched genomic library / Z. Wang, H. Liu, J. Liu et al // Scientia Horticulturae -2014.- №166. - P.65-69.

20 Alisoltani, A. Parallel consideration of SSRs and differentially expressed genesunder abiotic stress for targeted development of functional markersin almond and related Prunus species. / A. Alisoltani, S. Ebrahimi, S. Azarian et al // Scientia Horticulturae 2016. - №198(26), P.462-472

References

1 Glazko V. I. DNK-tekhnologii v genetike i selektsii: Kurs lektsiy / V. I. Glazko, T. T. Glazko. // Krasnodar: VNII risa 2006 - 399 s.