Научная статья на тему 'Разработка методологии получения растворимой формы рекомбинантной n-ацетилтрансферазы-2 человека'

Разработка методологии получения растворимой формы рекомбинантной n-ацетилтрансферазы-2 человека Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
211
52
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Биомедицина
ВАК
RSCI
Ключевые слова
N-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗA-2 (NAT2) / ФЕРМЕНТ / ГЕЛЬ-ЭЛЕКТРОФОРЕЗ / ЧЕЛОВЕК / N-ACETYLTRANSFERASE-2 (NAT2) / ENZYME / METHOD OF SDS-PAGE ELECTROPHORESIS / HUMAN

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Дуля М. С., Шевченко Е. Д., Петрова Н. В.

В работе представлена разработка методологии и оптимизация условий получения рекомбинантной N-ацетилтрансферазы-2 человека ( hNAT2 ), найдены оптимальные параметры наработки фермента в растворимой форме и в достаточном количестве для in vitro биоаналитических экспериментов. В статье приводятся данные о дизайне генетической конструкции для эффективной экспрессии рекомбинантного фермента N-ацетилтрансферазы-2 человека, методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях подтверждается молекулярная масса белка (34-35 кДа), указывается количественное содержание фермента (3,14 мг/мл).

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Дуля М. С., Шевченко Е. Д., Петрова Н. В.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Development of methodology for production of a soluble form of recombinant human N-acetyltransferase-2

The work presents the development of a methodology and optimization of recombinant N-acetyltransferase-2 of human (hNAT2), found the optimal parameters of use of the enzyme in a soluble form and in sufficient quantity for the in vitro bioanalytical experiments. The paper presents data on the design of genetic constructs for efficient expression of recombinant enzyme human N-acetyltransferase 2, by the method of SDS-PAGE electrophoresis confirmed the molecular weight of the protein (34-35 kDa), indicated quantitative content of enzyme (3.14 mg/ml).

Текст научной работы на тему «Разработка методологии получения растворимой формы рекомбинантной n-ацетилтрансферазы-2 человека»

Биомедицина • № 2, 2015, С. 47-52

Разработка методологии получения растворимой формы рекомбинантной ^ацетилтрансферазы-2 человека

М.С. Дуля, Е.Д. Шевченко, Н.В. Петрова

ФГБУН«Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская область Контактная информация:Дуля Максим Сергеевич, mdulya@gmail.com

В статье представлена разработка методологии и оптимизация условий получения рекомбинантной 1Ч-ацетилтрансферазы-2 человека (hNAT2), найдены оптимальные параметры наработки фермента в растворимой форме и в достаточном количестве для in vitro биоаналитических экспериментов. Приводятся данные о дизайне генетической конструкции для эффективной экспрессии рекомбинант-ного фермента Ы-ацетилтрансферазы-2 человека, методом гель-электрофореза в денатурирующих условиях подтверждается молекулярная масса белка (34-35 кДа), указывается количественное содержание фермента (3,14 мг/мл).

Ключевые слова: Ы-ацетилтрансфераза-2 (NAT2), фермент, гель-электрофорез, человек.

Введение

Биотрансформация ксенобиотиков и лекарственных средств в подавляющем большинстве случаев осуществляется под контролем ферментов. Ферменты, участвующие в метаболизме ксенобиотиков, локализованы главным образом в печени, хотя немаловажную роль могут играть ферменты кишечника, лёгких, почек, кожи и других тканей.

Внимание нашего исследования посвящено условиям экспрессии ферментов второй фазы биотрансформации -М-ацетилтрансфераз. Ацетилирование эволюционно является одним из ранних механизмов адаптации, т.к. эта реакция необходима для синтеза жирных кислот, стероидов, функционирования цикла Кребса, метаболизма ксенобиотиков (лекарственных препаратов, бытовых и промышленных ядов). Процессы фер-

ментативного ацетилирования арилги-дразинов и ариламинов - как у прокариот, так и у эукариот - осуществляются с помощью NAT.

У человека известно три гена NAT, один из которых является псевдогеном. Два экспрессирующихся гена NAT1 и NAT2 расположены на одной хромосоме и кодируют N-ацетилтрансфера-зу-1 (NAT1) и ^ацетилтрансферазу-2 (NAT2), которые имеют 81% идентичности, и оба проявляют генетический полиморфизм. В настоящее время известно четыре изоформы NAT: NATI, NAT2, NAT3, NAT4 соответственно. У изоформ NAT1 wNAT2 было обнаружено большое разнообразие аллельных вариантов [1]. Данные об аллельном полиморфизме генов NAT1 и NAT2 позволили выделить в человеческой популяции носителей мутаций, обладающих фенотипом мед-

ленных и быстрых ацетнляторов [2]. Соотношение «быстрых» и «медленных» ацетиляторов значительно варьирует в популяциях с различным этническим и географическим происхождением.

Также установлена ассоциация полиморфизма гена ЫЛТ2 с различными заболеваниями и различной чувствительностью к лекарственным препаратам [4]. Так, например, наличие «медленного» фенотипа ацетилирования является фактором риска развития рака молочной железы и рака мочевого пузыря. Кроме того, генетический полиморфизм ЫЛТ2 может определять токсикологическое и фармакологическое действие лекарственных препаратов, которые подвергаются М-ацетилированию посредством данного фермента [3]. Например, «медленные» ацетиляторы характеризуются более продолжительным фармакологическим эффектом и, в то же время, обнаруживают повышенную чувствительность к некоторым лекарственным препаратам и побочным иммунотокси-ческим эффектам ариламинов и гидразинов.

Процессы ацетилирования М-ацетил-трансферазами сосредоточены главным образом в печени, но также этот фермент обнаруживают в легких, толстом кишечнике, почках, мочевом пузыре и даже в головном мозге.

Оба фермента играют важную роль в нейтрализации ксенобиотиков, катализируя перенос ацетильной группы с ацетил-кофермента А (ацетил СоА) на концевой атом азота арилгидразинов и ариламин-содержащих лекарственных препаратов и канцерогенов. Типичными примерами лекарственных средств, подвергающихся катаболизму М-ацетил-трансферазами, являются сульфанила-

миды, противотуберкулёзные средства, транквилизаторы, психостимуляторы и многие другие. Число новых субстратов NAT постоянно растёт. Единственным известным на сегодняшний день эндогенным субстратом NAT1 является п-аминобензоилглутамат - продукт катаболизма фолиевой кислоты.

Активность ферментов NAT может быть управляема субстратоспецифич-ными агентами (селективно для NAT1 и NAT2) в каскадах реакций ацетилирования субстратов, приводящих к ацетилированным промежуточным ин-термедиатам и конечным метаболитам. Ингибирующее действие на фермент определяется фермент-субстратной реакцией и зависит от аффинности связывания с активным центром фермента ковалентными или нековалентными взаимодействиями.

Считается, что NAT2 обладает меньшей специфичностью и метаболизирует более широкий круг веществ, чем и привлекает наше внимание.

Подробное изучение субстратной специфичности и лекарственной биоактивации, как и другие исследования, требуют большого количества очищенного NAT. Первоначально этот фермент получали из животных источников, но из человеческих и животных тканей получать NAT2 в достаточном объёме невозможно.

Целью исследования стала разработка методологии и оптимизация условий получения рекомбинантного NAT2 человека в растворимом биологически активном виде в достаточном количестве для дальнейших исследований.

Материалы и методы

В работе по получению рекомби-

Разработка методологии получения растворимой формы рекомбинантной №ацетилтрансферазы-2 человека

нантного белка ^ацетилтрансферазы-2 человека (hNAT2) были использованы следующие методы:

• молекулярное клонирование фрагмента гена NAT2;

• моделирование и конструирование экспрессионого вектора;

• трансформация компетентных клеток, отбор клонов;

• выращивание культуры в селективных условиях;

• выделение и очистка целевого белка.

В качестве реципиентных клеток использовали бактерии Е. Coli компании «NewEnglandBioLabs». Генотип штамма: fhuA2 A(arg-lacZ)U169 phoAglnV44 980A(lacZ)M15 gyrA96 recAl relAl

endAl thi-1 hsdR17. Штамм с чувствительностью к ампициллину, канамици-ну, стрептомицину, спектиномицину, тетрациклину, хлорамфениколу и ни-трофурантиону.

Для экспрессии hNAT2 в бактериальной культуре была сконструирована экс-прессионнаяплазмида (рис. 1).

ПлазмидарЕТ-30 (b) hNAT2 сконструирована с целью выделения нативного белка NAT2 совместно со всем пулом бактериальных белков Е. Coli и последующего очищения с помощью гель-хроматографии. Для этого вектор NAT2 клонировали в полилинкер по сайтам рестрикции Kpnl и BamHI под контроль экспрессии лактозного оперона. Также плазмида несёт селективный маркер-ген устойчивости к канамицину.

Рис. 1. Кольцевая карта плазмиды рЕТ-30 (b), содержащая цельноразмерный ген hNAT2, 887 п.о. (фиолетовый цвет). Показаны основные рестриктазы, для которых имеются сайты узнавания на плазмиде.

Работа выполнена совместно с ЗАО «Евроген».

Следующим этапом работы явилась трансформация клеток экспрессионной плазмидой. Для этого использовали метод нагрева-оттаивания. Бактериальные клетки (100 мкл) в смеси с рекомби-нантной плазмидой (5 мкг/мл) подвергали непродолжительному нагреву на водяной бане при 42°С в течение 1 мин, затем последующему выдерживанию во льду в течение 5 мин и инкубированию при 37°С в течение 1 ч с добавлением питательной среды SOC до конечного объёма 1 мл.

После стадии восстановления клетки разводят в 100 раз средой SOC и высеивают либо на твёрдую среду, содержащую антибиотик, агарозу и индуктор экспрессии, либо в жидкую среду, также содержащую антибиотик и индуктор экспрессии. Бактериальные клетки культивируют при температуре 37°С.

Выбор индуктора и его оптимальная концентрация была найдена в следующем эксперименте. В культуры трансформированных клеток были добавлены

два индуктора IPTG и лактоза в разных концентрациях (рис. 2), культивирование проходило 16 ч, после чего была замерена оптическая плотность (OD600) во всех образцах (Multiscan GO, Thermo Scientific).

По результату эксперимента в качестве индуктора было решено использовать IPTG с концентрацией 0,1 mM.

Бактериальные клетки культивировали при 37°С и непрерывном перемешивании до OD=0,8-1. Затем бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 3700 об/мин в течение 10 мин, удаляли супернатант и ресуспендировали осадок в буфере TBS (6,06 гТрис и 8,76 rNaCl). Процедуру повторяли 3 раза, с каждым разом уменьшая объём отмывочного буфера. Пробирки с клетками помещали в ледяную баню и обрабатывали ультразвуком в течение 3 мин. Затем центрифугировали образцы на максимальной скорости при 4°С, супернатант отбирали и замораживали.

Далее из клеточного лизата выделяли плазмидную ДНК и белковую

Я IPTG

I LAC

mM

Рис. 2. Зависимость оптической плотности бактериальных клеток в жидкой питательной среде от концентрации индуктора (лактозы и 1РТО).

Разработка методологии получения растворимой формы рекомбинантной N-ацетилтрансферазы^ человека

фракцию. Выделение плазмидной ДНК проводили двумя независимыми способами: методом щелочной экстракции и с помощью набора «ДНК-Сорб» («АмплиСенс»). Для выделения бактериальных плазмид методом щелочной экстракции готовили растворы буферов для ресуспендирования и лизиса. Второй метод выделения бактериальной плазмиды был осуществлён с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб» («АмплиСенс») в соответствии с протоколом производителя.

Измерение концентрации суммарной ДНК проводили на флуориметре Quibit 3,0 LifeTechnologies в соответствии с протоколом производителя. После процедуры выделения плазмидной ДНК концентрация ДНК в образцах, выделенных по протоколу щелочной экстракции, составила 19680 нг/мл и 53600 нг/мл по протоколу набора «ДНК-Сорб».

Для оценки уровня экспрессии гена hNAT2 и локализации белка из лизи-рованных клеток выделяли белковую фракцию. Для этого лизат центрифугировали при 4000 об/мин для отделения растворимой фракции от фракции, содержащей белок в тельцах включений, и подвергали очистке на мембранном катридже 30 кДа.

Для визуализации качественного и количественного состава белковой фракции образцы наносили на 12% гель для белкового электрофореза в системе ДСД-ПААГ (Mini-Protean Tetra, «BioRad»).

Оценку количественного состава белковых фракций на геле проводили с помощью программы ImageLab («BioRad») в соответствии с интенсивностью представленных полос белковых компонентов на электрофореграмме.

Результаты исследований

Электрофореграммы разделения белкового пула представлены на рис. Зи4.

Рис. 3. Анализ продукции белка hNAT2 методом электрофореза в полиакриламид-ном геле. Детекция в камере Gel/ChemiDoc («Bio-Rad»). 1-я дорожка - маркеры молекулярных масс; 2-я,3-я дорожки - неочищенная на мембране растворимая фракция белков после лизирования бактериальных клеток Е. Coli.

Рис. 4. Анализ продукции белка hNAT2 методом электрофореза в полиакриламидном геле. Детекция в камере Gel/ChemiDoc («BioRad»). 1-я дорожка - очищенная на мембране 10 кДа фракция белка клеток Е. coli; 2-я, 3-я дорожки - без нагрузки образцами; 4-я дорожка - маркеры молекулярных масс.

Область молекулярной массы целевого белка hNAT2 имеет выраженную интенсивность флуоресценции и выделена в области 34-35 кДа.

Из 6,29 г бактериальной культуры удалось выделить белковую фракцию с концентрацией 3,14 мг/мл общего белка.

Анализ белковой фракции hNAT2 электрофорезом в полиакриламидном геле показал, что очищенная фракция была неоднородна по составу и содержала набор белков с молекулярной массой -45 кДа, -20 кДа, -17 кДа, -10 кДа.

Выводы

В ходе исследования по разработке методологии и оптимизации условий получения рекомбинантного NAT2 человека найдены оптимальные параметры наработки фермента в растворимой форме и достаточном количестве для биоаналитических in vitro экспериментов.

Данные результаты позволят использовать рекомбинантный фермент hNAT2 в серии постановок для оценки сравнительной ферментативной активности in vitro, а также проводить сравнительную оценку активности видоспецифичных

выделенных ферментов NAT-семейства лабораторных животных (мыши, крысы, мини-свиньи) с активностью полученного рекомбинантным способом фермента NAT2 человека.

Предварительно очищенная методами препаративной гель-проникающей и металл-аффинной хроматографии белковая фракция hNAT2 позволит проводить скрининговую оценку молекул-кандидатов в последующих исследованиях регуляции активности NAT2 человека (ингибиторов, активаторов).

Список литературы

1. Каркищенко H.H., Петрова Н.В., Слобо-денюк В.В. Высокоспецифичные видовые праймеры к генам Natl и Nat2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных // Биомедицина. 2014. № 2. С. 4-16.

2. Кукес В.Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико-фармакологические аспекты. - М.: Реафарм. 2004. 144 с.

3. Grant D.M., Blum М., Meyers U.A. Polymorphisms of N-acetyltransferase genes // Xenobiotica. 1992. № 22. P. 1073-1081.

4. Hein D.W. Molecular genetics and function of NAT1 and NAT2: role in aromatic amine metabolism and carcinogenesis // Mutation Research. 2002. № 506-507. P. 65-77.

Development of methodology for production of a soluble form of recombinant human N-acetyltransferase-2

M.S. Dulya, E.D. Shevchenko, N.V. Petrova

The paper presents the development of a methodology and optimization of recombinant N-acetyltransferase-2 of human (hNAT2), found the optimal parameters of use of the enzyme in a soluble form and in sufficient quantity for the in vitro bioanalytical experiments. Presents data on the design of genetic constructs for efficient expression of recombinant enzyme human N-acetyltransferase 2, by the method of SDS-PAGE electrophoresis confirmed the molecular weight of the protein (34-35 kDa), indicated quantitative content ofenzyme (3.14 mg/ml).

Key words: N-acetyltransferase-2 (NAT2), enzyme, method of SDS-PAGE electrophoresis, human.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.