CC BY
11УДК 57.087.3
Angelina A. Romanova, Aleksandra Sagaidak, Milena Yu. Lvova, Tatiana A. Grigoreva
DEVELOPMENT OF A HIGHCONTENT ANALYSIS PROCEDURE FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF PROAPOPTOTIC ABILITY OF SMALL MOLECULE COMPOUNDS
St Petersburg State Institute of Technology (Technical University), Moskovskiy Pr., 26, St Petersburg, Russia e-mail: agurangelina@mail.ru
The article presents the development of conditions for cell experiments using the Operetta CLS™ imaging system. The significance of high-content analysis parameters is substantiated. The optimal concentration and time parameters for the treatment of the cell culture of human colorectal carcinoma HCT116 by MDM2-p53 protein-protein interaction inhibitors were selected. The effect of the studied substances on cell growth was analyzed using Operetta CLS™.
Keywords: High-content Screening, small molecular weight Compounds Screening, MDM2-p53, HCT116, Nutlin-3а.
DOI: 10.36807/1998-9849-2020-55-81-58-61
Введение
«High-Content Screening» (HCS) или высокосодержательный анализ (ВСА) в настоящее время широко применяется в масштабных биологических исследованиях и разработке лекарственных препаратов. Он сочетает в себе эффективность высокопроизводительного анализа со способностью фиксировать и обрабатывать количественные данные, полученные при изучении сложных биологических систем [1].
ВСА включает в себя автоматическую микроскопию, как правило с использованием цветных маркеров, и компьютерный анализ полученного массива данных. Благодаря применению флуоресцентных меток с различными максимумами поглощения и излучения можно проводить мультиплексную фиксацию данных. Среди задач, решаемых с помощью ВСА, следует отметить морфологический анализ клеток, подсчет ядерных, цитоплазматических или мембранных маркеров, анализ структуры клеточных ядер [2].
В НИЛ «Молекулярная фармакология» СПбГТИ(ТУ) для ВСА соединений-кандидатов, обладающих направленной биологической активностью, используется прибор Operetta CLS™ (PerkinElmer Inc., США). С его помощью изучается влияние низкомолеку-
Романова А.А., Сагайдак А., Львова М.Ю.,
Григорьева Т.А.
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ ВЫСОКОСОДЕРЖАТЕЛЬНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОАПОПТОТИЧЕСКОИ СПОСОБНОСТИ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр. 26, Санкт-Петербург, Россия. е-таН:адигапдеПпа@таН.ги
В статье представлена разработка условий проведения клеточных экспериментов с использованием ими-джинговой системыы Operetta CLS™. Обоснована значимость параметров вы/сокосодержательного анализа. Подобраныы оптимальные концентрационные и вре-менны/е параметры/ обработки клеточной культурыы рака толстой кишки человека HCT116 ингибиторами белок-белкового взаимодействия MDM2-p53. Проведен анализ влияния исследуемых веществ на рост клеток с помощью Operetta CLS™.
Ключевые слова: высокосодержательный анализ, скрининг низкомолекулярных соединений, MDM2-p53, HCT116, Nutlin-За.
Дата поступления -15 июня 2020 года
лярных соединений на фенотип клеток, чувствительных к ингибированию белок-белкового взаимодействия р53^М2.
Белок р53 является ключевым онкосупрессо-ром опухолей у млекопитающих. Его биологическая роль заключается в поддержании стабильности генома и генетической однородности клеток организма. Активность р53 проявляется в ответ на повреждения ДНК, нарушения функционирования клетки или заражение вирусами [3]. При нормальных условиях в клетках поддерживается низкий уровень р53, что обеспечивается убиквитин-зависимой деградацией в протеа-сомах, первым этапом которой является связывание р53 с Е3-убиквитин-лигазой MDM2 [4]. Гиперэкспрессия MDM2 приводит к ингибированию транскрипционной активности р53 и соответственно - к подавлению его антионкогенных свойств. Таким образом, клетка с пониженным уровнем р53 становится уязвимой к онко-трансформации. Нейтрализация Е3-лигазной активности MDM2 за счет взаимодействия с низкомолекулярным ингибитором приводит к стабилизации р53 и стимуляции его противоопухолевой активности [5].
Создание противоопухолевых низкомолекулярных соединений - ингибиторов белок-белкового
взаимодействия p53-MDM2 является актуальной задачей, над которой работают сотрудники НИЛ «Молекулярная фармакология» [6]. Использование ВСА является критически необходимым элементом общего процесса создания лекарственных препаратов и позволяет не только ускорить процесс разработки, но и обеспечить разносторонний анализ большого количества экспериментального материала.
Несмотря на применение мультиплексного анализа и возможность компьютерной обработки данных с помощью программного обеспечения Harmony 3.1, достоверность, воспроизводимость и точность получаемых в ходе скрининга результатов требует тщательного дизайна и разработки методики эксперимента.
Экспериментальная часть
HCT116wt (клеточная линия рака толстой кишки человека, «ЗАО БИОКАД», Санкт-Петербург) рутинно культивировали в питательной среде DMEM (Gibco, США) на чашках Петри (63,5 см2) при 37 °C в Со2-инкубаторе согласно рекомендациям ATCC [7].
Для проведения ВСА клетки рассевали на 96-луночный планшет, внося по 100 мкл суспензии клеток в DMEM и культивировали в СО2-инкубаторе при 37 °C. Спустя 24 ч заменяли DMEM на раствор исследуемого низкомолекулярного соединения в среде для оптических измерений Opti-MEM (Gibco, США).
Исследуемые вещества: ингибиторы p53-MDM2 Nutlin-3a (Hoffman-La Roche, Швейцария) и собственная разработка НИЛ «Молекулярная фармакология» AP53. Навески низкомолекулярных соединений растворяли в ДМСО до концентрации 0,008 ммоль/л. В микропробирки вносили по 995 мкл среды Opti-MEM и по 5 мкл растворов исследуемых веществ. Полученные растворы с концентрацией 40 мкмоль/л использовали для приготовления серии последовательных разведений в питательной среде с 0,5 % ДМСО (40, 20 и 5 мкмоль/л). В качестве контроля использовали оптическую среду с 0,5 % ДМСО без добавления экспериментальных ингибиторов.
Для оценки влияния низкомолекулярных соединений на рост HCT116 проводили измерения кон-флюэнтности монослоя с помощью системы многопараметрического имиджинга клеток Operetta CLS™ и ПО «Harmony 3.1» (PerkinElmer Inc, США) в режиме прижизненного анализа [8]. Объектив 20х, режим «Brightfield».
Анализировали по 11 полей в 3 повторностях, в расчетах использовали медианы. На диаграммах результаты представлены в относительных величинах (отношение количества объектов в анализируемой лунке к количеству объектов в контрольной лунке).
Результаты и обсуждения
Выбор оптимальной концентрации клеток для 96-луночного планшета. Характер проводимых клеточных экспериментов определяет необходимую плотность посева клеток в лунках планшета. В случае чрезмерного разрастания колонии снижается точность анализа в связи с ограничениями оптики (рис. 1). В ходе работы было установлено, что оптимальные условия достигаются при внесении в 100 мкл исследуемого раствора суспензии клеток в концентрации 5х103 ± 1х103 кл/мкл.
Разработка метода анализа неокрашенных клеток. Важной процедурой при проведении ВСА является окрашивание клеток. Красители используются для визуализации и обеспечивают возможность компьютерного анализа клеточных структур, который предполагает проведение дополнительных манипуляций: либо фиксацию клеток в каждой интересующей исследователя временной точке, либо в случае прижизненной окраски - использование соединений, влияющих на пролиферацию и клеточную активность.
а)
б)
Рис. 1. Изображения густого посева HCT116, меченого флуоресцентными красителями: а) прижизненная окраска двухце-почечной ДНК (красный, DRAQ5); б) Двойная окраска проли-ферирующих клеток (красный, Alexa Fluor 647) на фоне общего количества клеток (синий, Hoechst 33342)
Оснащение прибора Operetta CLS позволяет, тем не менее, проводить анализ неокрашенных клеток в режиме просвечивания «Brightfield». Использование флуоресцентных красителей возможно либо в виде низкомолекулярного соединения, либо в виде конью-гата с антителами. Диапазон длин волн возбуждения флуоресценции - от 355 до 675 нм, эмиссии - от 430 до 760 нм.
В данной работе разрабатывался метод количественного анализа клеток HCT 116 без использования красителей. Было установлено, что тщательное диспергирование позволяет обеспечить аккуратный рассев клеток и избежать образования клеточных агрегатов, которые могут быть неверно обсчитаны в автоматическом режиме (рис. 2).
Было показано, что при анализе числа клеток, как экспериментального параметра, окрашивание не является обязательным, если использовать подходящую частоту рассева клеток и избегать переноса клеточных агрегатов в лунки. Такая методика анализа позволяет проводить анализ роста клеток без внесения дополнительных химических компонентов, влияющих на фенотип клеток.
Продолжительность эксперимента. Время отклика клетки на изменяющийся состав среды дает важную информацию о механизме действия низкомолекулярного соединения и определяет продолжительность эксперимента. Быстрая гибель клеток может свидетельствовать о токсичности соединения, в то время как более продолжительная - о возможной реактивации р53-зависимого апоптоза.
Рис. 2. Распознавание клеток ПО «Harmony 3.1» (PerkinElmer Inc, США) после съемки в режиме «Brightfleld» без использования красителей, красным выделена область нераспознанных агрегатов
Для определения временного диапазона, необходимого для проявления проапоптотического действия низкомолекулярных соединений, проявляющегося за счет активации генов-мишеней р53, проводили инкубацию НСТ116 в оптической среде с добавлением Nutlin-3a в течение трех суток (рис. 3).
Рис, 4, Накопление продуктов клеточной жизнедеятельности спустя 50 ч инкубирования клеток НСТ116 в среде с ЫиШп-За
Рис. 3. Диаграмма зависимости относительного количества неповрежденных клеток НСТ116 от времени инкубации с ЫиО'ш-За
Продолжительность эксперимента определялась исходя из интенсивности накопления продуктов клеточного метаболизма и загрязнения среды клеточными фрагментами. Это приводит к тому, что прибор ошибочно обсчитывает их в качестве клеток. Визуальный контроль позволил установить, что существенное накопление посторонних элементов происходит уже к 50 ч инкубирования клеток (рис. 4).
Влияние посуточной замены питательной среды с исследуемыми веществами на активацию р53-зависимой гибели клеток. Поскольку в ходе роста клетки потребляют питательные вещества, генерируют метаболиты, стареют и разрушаются (рис. 4), при рутинном культивировании клеток необходимо осуществлять регулярное обновление питательной среды.
Для того чтобы оценить влияние замены питательной среды на результаты, получаемые в ходе клеточного скрининга, мы проанализировали рост клеток НСТ116 при обработке ^Нп-За. При этом объекты были разделены на 2 группы: в первой свежая порция среды с исследуемым веществом вносилась один раз и не заменялась (рис. 5а), а в другой - заменялась через 24 ч (рис. 5б).
На рис. 5а и 5б показано, что в случае клеточной линии НСТ116 при проведении экспериментов продолжительностью 48 ч замена среды не является необходимой - зависимость количества клеток от концентрации препарата сохраняется в обоих случаях. При этом результаты, получаемые сразу после смены среды во второй группе (24 ч), хоть и различаются между группами, но отражают единую концентрационную зависимость.
Рис. 5. Диаграммы/ влияния ингибитора МйМ2 ЫчИт-За на относительный рост клеточной линии НСТ116: а) без смены! среды; б) с посуточной сменой среды/
Определение оптимальной концентрации исследуемых веществ в растворе
Ключевым параметром при скрининге химических кандидатов на биологическую активность является их рабочая концентрация. Очевидно, что при изучении противораковых веществ использование высоких концентраций будет приводить к тотальной гибели клеток, что не позволит проанализировать клеточные механизмы и концентрационные эффекты.
На рис. 6 представлены диаграммы обработки НСТ116 ингибиторами МЭМ2 1ЧШ:!1п-3а (рис. 6а) и АР53 (рис. 6б) в одинаковых концентрациях. Очевидно, что ^Пп-За оказывает ингибирующее действие на рост клеток при всех исследованных концентрациях.
а)
1 4
о
5 1,2
1 1 0,8
± Ё 0.6
ё 2 0.4
| 0,2
0
-40 мкмоль/л -20 мкмоль/л -5 мкмоль/л
24 Время,
б)
Рис. 6. Диаграммы обработки НСТ116 ингибиторами МЭМ2: а) ^Шп-3а; б) АР53
В случае вещества АР53 при концентрации 5 мкмоль/л наблюдался эффект, соизмеримый с результатом обработки ^Нп-За в аналогичной концентрации. Однако дальнейшее сравнение результатов в более высоких концентрациях оказалось недостоверным. По рис. 6б можно предположить, что при высоких концентрациях АР53 стимулирует рост клеток, однако детальное исследование микрофотографий позволило установить, что растворы Ар53 нестабильны при концентрациях выше 10 мкмоль/л - в условиях эксперимента начинается кристаллизация, приводящая к существенному падению концентрации раствора (рис. 7).
Рисунок 7. Изображение лунки спустя 24 часа инкубирования клеток HCT116 с AP53 в концентрации 40 мкмоль/л, красным отмечен осадок, жёлтым - клетки
Как уже было отмечено ранее, подсчет клеток без использования красителей является достаточно чувствительным методом анализа, поэтому контроль состояния растворов в лунке является обязательным. Очевидно, что даже в случае адекватного подсчета клеток, выводы о влиянии низкомолекулярного соединения будут некорректными, поскольку истинная концентрация вещества в растворе, как и особенности взаимодействия клеток с кристаллами, неизвестны.
Заключение
Анализ фенотипических изменений с помощью прибора ВСА Operetta CLS™ позволяет проводить множество различных исследований на биологическую активность химических веществ.
В данной работе показано, что возможно применение прибора для проведения клеточных скринингов без использования красителей, что позволяет упростить работу и избежать использования дополнительных реактивов, потенциально влияющих на жизненный цикл клеток. При этом тщательная пробопод-готовка позволяет сделать анализ не только быстрым, но и точным.
Оптимизация параметров анализа клеточного роста под воздействием исследуемых веществ показала, что при правильном подборе объёма клеточной суспензии вносимого в лунку планшета, концентрации исследуемых веществ и времени обработки клеток можно добиться достоверных и воспроизводимых результатов.
Исследование вы>/полнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-3370250
Литература
1. Zanella F, Lorens J.B. High content screening: seeing is believing // Trends in Biotechnology. 2010. Vol. 28. P. 237-245. D01:10.1016/j.tibtech.2010.02.005.
2. Usaj M, Styles E, Verster A. [et. a/.]. Highcontent screening for quantitative cell biology // Trends in Cell Biology. 2016. Vol. 8. P.598-611. D0I:10.1016/j.tcb.2016.03.008.
3. Чумаков П.М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме // Успехи биологической химии. 2007. Т. 47. С. 3-52. (Chumakov P. P53 protein and its universal functions in cellular organism // The success of biological chemistry. 2007. № 47. P. 3-52).
4. Honda R. Oncoprotein MDM2 is a ubiquitin ligase E3 for tumor suppressor p53 // Genes Dev. 1993. № 7. Р. 1126-1132. D0I:10.1016/s0014-5793(97)01480-4
5. Davidovich P., Aksenova V,, Petrova V. [et. al.]. Discovery of novel isatin-based p53 inducer // ACS MedChemLett. 2015. R. 6. P. 856-860. D0I:10.1021/acsmedchemlett.5b00011.
6. Gureev M, Novikova D., Grigoreva T [et. a]. Simulation of MDM2 N-terminal domain conformational lability in the presence of imidazoline based inhibitors of MDM2-p53 protein-protein interaction // Journal of Computer-Aided Molecular Design. 2020. Vol. 34. № 1. P. 5570. D0I:10.1007/s10822-019-00260-6.
7. Методика культивирования HCT116 URL: https://www.atcc.org/products/all/CCL-247.aspx (дата обращения: 15.02.2020).
8. Tovar C, Graves B. MDM2 small-molecule antagonist RG7112 activates p53 signaling and regresses human tumors in preclinical cancer models // Cancer Res. 2013. № 8. P. 2587-2597. D0I:10.1158/0008-5472.CAN-12-2807.
Сведения об авторах:
Романова Ангелина Алексеевна, мл. науч. сотр. НИЛ «Молекулярная фармакология», Angelina A. Romanova, junior research scientist, Laboratory of Molecular Pharmacology, agurangelina@mail.ru
Сагайдак Александра, мл. науч. сотр. НИЛ «Молекулярная фармакология»; Aleksandra Sagaidak, junior research scientist, Laboratory of Molecular Pharmacology; HYPERLINK, aleksandrasagaidak@yandex.ru.
Львова Милена Юрьевна, инженер НИЛ «Молекулярная фармакология», Milena Yu. Lvova, engineer, Laboratory of Molecular Pharmacology, HYPERLINK, milenalwowa@yandex.ru
Григорьева Татьяна Алексеевна, канд. хим. наук, ст. науч. сотр. НИЛ «Молекулярная фармакология», Tatiana A. Grigoreva, Ph.D. (Chem.), senior researcher, Laboratory of Molecular Pharmacology, rozentatiana@gmail.com
