CC BY
127
УДК 615.074,615.072
РАЗРАБОТКА МЕТОДА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОСАХАРОВ В ПЛОДАХ ЧЕРЁМУХИ ПОЗДНЕЙ - РШвБЕВОГШ(БИВИ.) ДОДКОИ
Предложена методика количественного определения моносахаров в плодах черёмухи поздней - Раёыв Бвтойпа (Ектк.) Лдатёк методом УФ-спектрофотометрии, позволяющая дифференциально определять содержание гексоз и кетоз. Для определения гексоз в пересчёте на глюкозу использована реакция с фенолом в присутствии кислоты серной концентрированной. Содержание глюкозы в плодах Р. Бвтойпа (Ектк.) Лдатёк составило 13,34±0,36%. Кетозы в пересчёте на фруктозу определяли с использованием в качестве реактивов резорцина в присутствии кислоты хлористоводородной разведённой (реакция Селиванова). Содержание фруктозы в плодах Р. Бвтойпа (Ектк.) Лдатёк составило 3,54±0,04%.
Ключевые слова: моносахара, глюкоза, фруктоза, плоды черёмухи поздней, УФ-спектрофотометрия.
Д.И. Писарев О.О. Новиков М.Д. Безменова ЕА Томчаковская В.Н. Сорокопудов
Белгородский государственный университет
e-mail: Pisarev@bsu.edu.ru
Углеводы входят в состав клеток всех живых организмов и вместе с белками, липидами и нуклеиновыми кислотами определяют специфичность их строения и функционирования. Углеводы участвуют во многих метаболических процессах, но прежде всего они являются основными поставщиками энергии. Главными моносаха-ридными компонентами пищи являются глюкоза и фруктоза, основными источниками которых служат растения [1].
Существует ряд методов количественного определения моносахаров в растениях, все они имеют преимущества и недостатки. Нами взяты за основу ранее существовавшие методы количественного определения моносахаров в растениях - фенольный метод для 2глюкозы и определение фруктозы по Кульку [2]. Данные методы нами усовершенствованы и предложены в варианте прямой спектрофотометрии. Расчёт концентрации проводился с использованием стандартных образцов глюкозы и фруктозы соответственно.
Целью настоящего исследования явилась разработка метода количественного определения моносахаров - альдоз и кетоз в плодах Р. эвтоЫпа (Ектк.) Лдатйк по-отдельности.
Для реализации поставленной цели было необходимо подобрать соответствующие условия для проведения количественного определения моносахаров в растительном сырье.
В основу количественного определения глюкозы в исследуемом объекте положена реакция взаимодействия оксиметилфурфурола с фенолом в среде кислоты серной концентрированной [3]. Сначала под воздействием кислоты серной концентрированной глюкоза дегидратируется с образованием оксиметилфурфурола:
H H OH H
л
O
у
HO-CH-C—C—C—C—C -------► HO-CH
л
O
'2 C C C C C " HO CH~ V. /------------C + 3HO
2 \ 2 \ 2 I I I I H O H
OH OH H OH H H
глюкоза
оксиметилфурфурол
А далее при действии фенола на оксиметилфурфурол образуется ауриновый краситель, имеющий в видимой области спектра максимум поглощения Хшах = 483 -485 нм (рис. 1).
1Я
оя
Ой 0.4 02 оя
350 400 450 500 550 600
Рис. 1. Продукт взаимодействия оксиметилфурфурола со стандартным образцом глюкозы
Образование конечного продукта происходит в течении часа, он достаточно стабилен во времени, что позволяет использовать его для фотометрического определения.
На первом этапе проведения анализа было получено исследуемое водное извлечение плодов черёмухи. Для этого точную навеску сырья, предварительно измельченного и просеянного сквозь сито с диаметром отверстий 3 мм массой 1,0 г, помещали в плоскодонную колбу и заливали 20 мл воды, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на водяной бане в течение 30 минут с момента закипания воды в бане. Извлечение охлаждали и фильтровали через вату в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию сырья проводили ещё четыре раза порциями по 20 мл, собирая фильтрат в ту же мерную колбу на 100 мл. После охлаждения объём извлечения доводили водой до метки и перемешивали.
Полученное извлечение использовали для количественного определения глюкозы и фруктозы.
Определение глюкозы. В пробирку вносили 1 мл извлечения, приливали 0,05 мл водного раствора фенола (92 г свежеперегнанного фенола и 8 мл воды) и 5 мл химически чистой кислоты серной концентрированной (H2SO4 d — 1,84) (раствор А). Содержимое пробирок перемешивали и давали отстояться в течение 1 ч. 0,1 мл раствора А доводили до метки в мерной колбе вместимостью 5 мл кислотой серной концентрированной, перемешивали (раствор Б). Параллельно в тех же условиях готовили контрольный раствор сравнения [2].
Полученный раствор Б фотометрировали на УФ-спектрофотометре СФ-56 в кювете толщиной 10 мм в диапазоне длин волн 350 - 600 нм.
Параллельно готовили стандартный раствор глюкозы.
0,0625 г глюкозы растворяли в воде в мерной колбе на 25 мл (раствор А), 1 мл раствора А разводили в мерной колбе на 5 мл (раствор Б). К 0,1 мл раствора Б приливали 0,05 мл водного раствора фенола (92 г свежеперегнанного фенола и 8 мл воды) и 5 мл химически чистой кислоты серной концентрированной (H2SO4 d — 1,84). Параллельно готовили контрольный раствор сравнения.
Полученные результаты приведены на рис. 2.
Рис. 2. УФ-спектр поглощения продуктов реакции исследуемого раствора и стандарта глюкозы с фенолом и кислотой серной концентрированной
1 - УФ-спектр поглощения исследуемого раствора
2 - УФ-спектр поглощения стандарта глюкозы
Для расчетов использовали формулу (с учетом разбавления исследуемого раствора и раствора стандарта):
где Сст — концентрация стандартного раствора глюкозы; Ах - оптическая плотность
исследуемого раствора; АсТ - оптическая плотность стандартного раствора глюкозы; - общий объем извлечения из сырья, мл; Щ — объем извлечения после разбавления,
мл; а - масса сырья, г; - аликвота, взятая для разбавления, мл; В - влажность сырья.
Таблица 1
Результаты количественного определения глюкозы в плодах Р. ввгоґіпа (Екгк.) АдагйИ.
X (%) X - X,. (X - X, )2 Метрологические характеристики
13,00 0,34 0,1156 X = 13,34% - X )2 = 0,42734
13,58 -0,24 0,0576
13,72 -0,38 0,1444
13,36 -0,02 0,0004 „ - X,)2 0,11935
13,01 0,33 0,1089 Х "У и(и -1) А^ = Бх ■ їх = 0,306 є = 2,3%
13,39 0,021 0,000441
Х=13,34 2=0,42734
Таким образом, содержание глюкозы в плодах Р. ввгвЫпа (ЕИтИ..) ЛдаМН составило 13,34±0,36%.
Определение фруктозы. Фруктоза относится к кетозам, поэтому в отличие от глюкозы реагирует с резорцином в присутствии кислоты хлористоводородной концентрированной (реакция Селиванова). Фруктоза при нагревании с кислотой теряет три молекулы воды и превращается в оксиметилфурфурол, который при взаимодействии с резорцином образует продукт вишнёво-красного цвета, имеющий в видимой области спектра максимум поглощения Лшах = 4!5 - 420 нм (рис. 3):
Рис. 3. УФ-спектр поглощения продукта взаимодействия оксиметилфурфурола с резорцином
При нагревании альдоз с кислотами также образуется оксиметилфурфурол. Однако эта реакция протекает медленнее, чем с кетозами, что обусловливает достаточную специфичность реакции Селиванова [3].
Реактив на кетозы: раствор А — 0,05% раствор резорцина в 96% этиловом спирте; раствор Б - в 1 л НС1 (Д= 1,18) растворено 0,216 г РеКН4(804)2-12Н20.
Методика опыта. В пробирку вносили 1 мл извлечения, добавляли по 3 мл растворов А и Б. Параллельно готовили раствор сравнения, состоящий из 3 мл раствора А и 3 мл раствора Б. Пробирки соединяли с воздушным холодильником и помещали на 40 мин в водяную баню при 80°С. По окончании нагревания пробирки охлаждали под струей водопроводной воды [2]. По 2 мл полученных растворов доводили до метки в пикнометрах вместимостью 25 мл 96%-ным этиловым спиртом.
Параллельно в аналогичных условиях готовили стандартный раствор фруктозы, для чего 0,05 г фруктозы растворяли в 100 мл воды, и далее поступали, как описано выше.
Полученные результаты приведены на рис. 4.
Рис. 4. УФ-спектр поглощения продуктов реакции исследуемого раствора и стандарта фруктозы с резорцином и кислотой хлористоводородной концентрированной
1 - УФ-спектр поглощения стандарта фруктозы
2 - УФ-спектр поглощения исследуемого раствора
Расчет проводили по формуле:
Ах х С,т хВДх№2х 100 : . — ■■ - ■ -______=______ , 1
1:0 - 3' ’
где О™ - концентрация стандартного раствора фруктозы; Ах - оптическая плотность исследуемого раствора; Аст - оптическая плотность стандартного раствора фруктозы;
Щ — общий объем извлечения из сырья, мл; №2 - объем извлечения после разбавления, мл; а - масса сырья, г; Ц - аликвота, взятая для разбавления, мл; В - влажность сырья.
Таблица 2
Результаты количественного определения фруктозы в плодах P. serotina ^ЬтЬ) Agardh
X (%) X - X,. (X - X, )2 Метрологические характеристики
3,50 0,04 0,0016 X = 3,54% £(X - X )2 = °,°°74
3,58 -0,04 0,0016
3,52 -0,02 0,0004
3,56 -0,02 0,0004 „ fZ(X-X,)2 0,0157 x у n(n-1) AX = Sx ■ tx = 0,04 є = 1,14%
3,51 0,03 0,0009
3,59 -0,05 0,0025
Х=3,54 £=0,0074
Содержание фруктозы в плодах P. serotina (Ehrh.) Agardh составило 3,54±0,04%. ^
Выводы. В результате проведённых исследований предложена методика количественного определения моносахаров методом УФ-спектрофотометрии, позволяющая дифференциально определить содержание гексоз и кетоз. Для определения гексоз в пересчёте на глюкозу использована реакция с фенолом в присутствии кислоты серной концентрированной, максимум поглощения которой лежит в области Xmax = 483 - 485 нм. Содержание рассчитывали с использованием стандартного образца глюкозы, которое в плодах P. serotina (Ehrh.) Agardh составило 13,34±0,36%. Кетозы в пересчёте на фруктозу определяли с использованием в качестве реактивов резорцина в присутствии кислоты хлористоводородной разведённой (реакция Селиванова), максимум поглощения реакции находится в области 415 - 420 нм. Содержание фруктозы рассчитывали также с использованием стандартного образца фруктозы, которое в плодах P. serotina (Ehrh.) Agardh составило 3,54±0,04%.
Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг., государственный контракт №П425 от 12.05.2010 г.
Литература
1. Биохимия : учебник / под ред. Е.С. Северина. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. - 784 с.
2. Петров, К.П. Методы биохимии растительных продуктов / К.П. Петров. - Киев: Изд. объединение «Вища школа». - 1978. - 224 с.
3. Практикум по химии углеводов/ под ред. Ю.А. Жданова. - Изд. 2-е, перераб. и доп. -М.: Высшая школа. - 1973. - 204 с.
THE DEVELOPMENT OF A METHOD FOR QUANTITATIVE DETERMINATION OF MONOSACCHARIDES IN THE FRUIT CHERRY LATE - PADUS SEROTINA (EHRH.) AGARDH
The technique of quantitative determination of monosaccharides in the fruit cherry late - Padus serotina (Ehrh.) Agardh by UV spectrophotometry allows the differential to determine the content of hexoses and keto-sis. To determine the hexoses in terms of glucose used by reaction with phenol in the presence of concentrated sulfuric acid. Glucose content in the fruits of P. serotina (Ehrh.) Agardh was 13,34 ± 0,36%. Ketosis in terms of fructose were determined using as reagents resorcinol in the presence of diluted hydrochloric acid (reaction Selivanova). Fructose in fruit P. serotina (Ehrh.) Agardh was 3,54 ± 0,04%.
D.I. Pisarev O.O. Novikov M.D. Bezmenova EA Tomchakovskaya V.N. Sorokopudov
Belgorod State University
e-mail: Pisarev@bsu.edu.ru Key words: monosaccharides, glucose, fructose, fruit cherry later,
UV-spectrophotometry.
