CC BY
1
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
УДК 631.86:632.937 DOI: 10.24412/1029-2551-2022-3-011
РАЗРАБОТКА МЕТОДА ХРАНЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ТРИХОДЕРМИН
Н.И. Кириллова, Е.А. Прищепенко, к.с.-х.н., И.А. Дегтярева, д.б.н., Т.В. Кошпаева, В.Л. Новичков, к.с.-х.н.
Татарский НИИ агрохимии и почвоведения - обособленное структурное подразделение ФИЦКазНЦРАН, e-mail: niiaxp2@mail.ru, e-mail: nadyakirillova13@gmail.com
Исследование направлено на разработку нового метода хранения биофунгицида Триходермин на основе Trichoderma viride, произведенном в филиале ФГБУ «Россельхозцентр» по Республике Татарстан. Препарат предназначен для обработки семян широкого спектра сельскохозяйственных культур и внесения в почву. Исследован пролонгирующий эффект природных минералов (диатомит, глауконит, цеолит) и сапропеля. В качестве субстрата использован верховой торф, изготовленный в ОАО «Параньгинское торфопредприятие» Республики Марий Эл. Присутствие в торфе T. viride определено на 21, 42, 63 и 84 сутки. Полученные данные о содержании T. viride свидетельствуют о ее хорошей сохранности на торфяном субстрате, что свидетельствует о быстрой адаптации микромицета и хорошей приживаемости. На 84 сутки в варианте с глауконитом отмечен минимальный эффект действия на рост T. viride (25%). Количество T. viride в варианте с добавлением сапропеля составляет 45%. Максимальное пролонгирующее действие на рост T. viride оказывают цеолит и диатомит, при внесении которых наблюдается наибольшее содержание микромицета -65 и 95% соответственно. Получены новые данные о том, что применение природных минералов поддерживает жизнеспособность T. viride в течение трех месяцев на верховом торфе. Для дальнейших исследований перспективны три из исследованных минералов, ряд эффективности которых с Триходермином следующий: диатомит > цеолит > сапропель.
Ключевые слова: Триходермин, биофунгицид, природные минералы, диатомит, глауконит, сапропель, цеолит, хранение.
DEVELOPMENT OF STORAGE METHOD OF TRICHODERMIN BIOPREPARATION
N.I. Kirillova, Ph.D. E.A. Prishchepenko, Dr.Sci. I.A. Degtyareva, T.V. Koshpaeva, Ph.D. V.L. Novichkov
Tatar Scientific-Research Institute of Agrochemistry and Soil Science, e-mail: nadyakirillova13@gmail.com
The study is aimed at developing a new storage method for the biofungicide Trichodermin based on Trichoderma viride, manufactured at the Rosselkhozcenter branch in the Republic of Tatarstan. The drug is intended for seed treatment of a wide range of crops and soil application. The prolonging effect of natural minerals (diatomite, glauconite, zeolite) and sapropel has been studied. As a substrate, high-moor peat was used, manufactured at JSC «Paranginskoe peat enterprise» of the Republic of Mari El. The presence of T. viride in peat was determined on days 21, 42, 63, and 84. The obtained data on the content of T. viride indicate its goodpreserva-tion on a peat substrate, which indicates a rapid adaptation of the micromycete and good survival. On day 84, in the variant with glauconite, a minimal effect on the growth of T. viride was noted (25%). The amount of T. viride in the variant with the addition of sapropel is 45%. The maximum prolonging effect on the growth of T. viride is exerted by zeolite and diatomite, when they are introduced, the highest content of micromycete is observed - 65 and 95%, respectively. New evidence has been obtained that the use of natural minerals contributes to the maintenance of the viability of T. viride for three months on high-moor peat. Three of the studied minerals are promising for further research, the row of effectiveness of which on T. viride is as follows: diatomite > zeolite > sapropel.
Keywords: Trichodermin, biofungicide, natural minerals, diatomite, glauconite, sapropel, zeolite, storage.
В последнее время возрастает внимание к мик- гицидных и почвоудобрительных препаратов. ромицетам рода Trichoderma для создания биофун- Trichoderma играет важную роль в повышении
плодородия почв. Она служит антагонистом по отношению ряда патогенных грибов родов Fusarium, Phytophthora, Alternaría, Phythium, Botrytis, Phoma [1], подавляя их развитие [2, 3].
Среди многочисленных представителей рода Trichoderma следует выделить вид T. viride, особенностью которого является сохранение жизнеспособности только при доступе воздуха и наличии подходящего субстрата. В работе В.В. Котлярова с соавторами [4] отмечено, что этот микромицет активно размножается на питательном субстрате, представленном целлюлозосодержащими остатками, выделяя фермент целлюлазу, разлагающую высокомолекулярные полисахариды. Конидиеносцы гриба септированные, разветвленные, образуют концентрические кольца и обычно находятся на боковых ветвях. T. viride формирует споры [4, 5].
Развитие Trichoderma зависит от внешних условий среды. Влажность и температура - одни из основных факторов, влияющих на прорастание спор и развитие мицелия гриба. При уменьшении уровня влажности снижается скорость роста спор, а при 20% влажности рост спор гриба невозможен [6]. Температурный фон активности микромицетов, в том числе и Trichoderma колеблется в пределах от +6 до +30°С [7]. Другим важным фактором, определяющим нормальный рост Trichoderma и ее биосинтетические возможности, является активная реакция среды. В зависимости от вида, максимальный рост грибов наблюдается при pH в пределах от 3,5 до 5,5. Изменение pH среды влияет на накопление конечных продуктов обмена веществ [8, 9]. Грибы рода Trichoderma - аэробы, поэтому для них особенно важен режим аэрации [10]. Эти свойства ограничивают широкое внедрение Триходермина в сельскохозяйственное производство, так как при упаковывании в герметичную тару мицелий T. viride быстро погибает.
Состав субстрата влияет на рост, развитие и синтез различных метаболитов Trichoderma [11-14]. Торф, применяемый для приготовления торфопоч-венных грунтов - ценный органический субстрат. Он обладает уникальными природными свойствами и представляет интерес как сырье для получения органических и органоминеральных удобрений, биостимуляторов и ростовых веществ, микробиологических препаратов, тепличных рассадных субстратов для сельскохозяйственных предприятий [15, 16]. По сравнению с минеральными субстратами торф оказывает стимулирующее действие, обладает высокой поглотительной способностью, накапливает питательные микроэлементы и легко отдает их по мере необходимости [12, 16].
В Российской Федерации широко представлены биофунгициды на основе разных видов Trichoderma: Трихоцин, СП (ООО Управляющая компания «АБТ-групп»), штамм T. harzianum; Три-
ходерма Вериде 471, СП (ООО «Ваше хозяйство»), штамм T. veride; Трихоплант, СК (ООО «НПО Био-техсоюз»), штамм 471 T. Longibrachiatum и др. [17].
В целом срок годности биопрепаратов составляет от месяца до полугода в зависимости от формы выпуска. Препараты на основе разных видов Trichoderma активны в течение трех месяцев при хранении в темном прохладном месте. При хранении биопрепаратов в закрытой таре доступ кислорода ограничен. Это отражается на объемах производства и сроках реализации продукции [18].
В филиале ФГБУ «Россельхозцентр» по Республике Татарстан (РТ) произведен препарат Трихо-дермин на основе T. viride, предназначенный для обработки семян широкого спектра сельскохозяйственных культур и внесения в почву. Его действие основано на биологической защите семян, проростков и растений против корневых заболеваний за счет продуцирования антибиотиков - глиотоксина и виридина в конидиальной стадии развития гриба.
Для увеличения срока активности T. viride в составе препарата Триходермин необходим подбор не только субстрата, но и доступных природных добавок, которые станут источником поддержания жизнеспособности T. viride и позволят увеличить срок хранения готового препарата.
Цель исследования - разработка нового метода сохранности жизнеспособности препарата Трихо-дермин при добавлении к нему природных добавок, таких как диатомит, глауконит, цеолит, сапропель.
Методика. Объекты исследований: препарат Триходермин на основе микроскопического гриба T. viride; верховой торф ОАО «Параньгинское тор-фопредприятие» Республика Марий Эл (табл. 1); природные минералы - диатомит Инзенского месторождения Ульяновской области Российской Федерации, глауконит Сюндюковского месторождения РТ, сапропель месторождения Озеро Белое РТ, цеолит Татарско-Шатрашанского месторождения РТ [19, 20].
Верховой торф залегает слоями в верхней толще торфяных залежей, содержит в своем составе не менее 70% остатков олиготрофных сфагновых мхов и не более 10% древесных остатков (без учета гумуса). Торф относится к нормальнозольным (8% золы по сухой массе). Зольность обусловлена содержанием солей и минералов (таблица).
Эксперимент проводили по схеме: 1 - контроль; 2 - Триходермин; 3 - Триходермин + диатомит; 4 -Триходермин + глауконит; 5 - Триходермин + сапропель; 6 - Триходермин + цеолит.
Природные минералы добавляли в стерильный торф в соотношении 1:10. Доза внесения жидкого препарата Триходермин в стерильный торф - 1 см3.
Культивирование проводили в контейнерах объемом 500 см3 при температуре 22°С. Отбор проб осуществляли на 21, 42, 63 и 84 сутки хранения.
Агрохимическая характеристика торфа
Параметр Значение
Вид торфа Комплексный верховой
Зольность До 8%
Кислотность (рЫ) 5,5-6,0
Массовая доля влаги не более 60%
Посев проб торфа проводили на модифицированную агаризованную среду следующего состава (г/л): вода водопроводная - 1 л; горох - 60; меласса - 9; глицерин - 8; КН2РО4 - 0,5; MgSO4 - 0,2; (NH4)2SO4 - 1; агар бактериологический - 20.
В динамике определяли численность [21] и жизнеспособность T. viride [22].
Результаты исследований. Для практического применения препарата Триходермин необходимо изучение его совместимости с природными минералами. На рисунке 1 представлен рост T. viride на
агаризованной питательной среде спустя 21 сутки хранения.
Спустя три недели хранения T. viride сохраняет жизнеспособность и активность. При изучении комочков торфа соответствующего варианта выявлено интенсивное их обрастание триходермой во всех опытных вариантах. Установлено, что все исследуемые природные минералы не ингибируют рост T. viride.
На рисунке 2 представлен рост T. viride на ага-ризованной питательной среде спустя 42 суток хранения.
На 42 сутки рост T. viride менее интенсивный в вариантах с добавлением диатомита и глауконита, что свидетельствует о пролонгирующем эффекте данных природных минералов. При добавлении сапропеля и диатомита в этот период наблюдается такой же интенсивный рост, как и в контрольном образце без добавления минералов.
Рис. 1. Рост Т. viride на 21 сут: а — контроль; б — Триходермин; в — Триходермин + диатомит; г — Триходермин + глауконит; д — Триходермин + сапропель; е — Триходермин + цеолит
Рис. 2. Рост Т. viride на 42 сут: см. рис. 1.
Рис. 3. Рост Т. viride на 63 сут: см. рис. 1.
Рис. 4. Рост Т. viride на 84 сутки: см. рис. 1.
120
□ Триходермин
100
о; х
н
пз I-
и пз
р
Ю
о
чо
оч
80
60
40
20
21 сут 42 сут 63 сут 84 сут
Рис. 5. Содержание Т. гтйе в динамике
Ш Триходермин + диатомит
□ Триходермин + глауконит
□ Триходермин + сапропель
Н Триходермин + цеолит
0
На рисунке 3 представлен рост T. viride на ага-ризованной питательной среде на 63 сутки хранения. Спустя 2 месяца T. viride также сохраняет свою жизнеспособность, однако рост менее интенсивный во всех вариантах. Следует отметить заметный рост в контроле и с добавлением сапропеля. Напротив, экстенсивный рост T. viride наблюдается при добавлении глауконита. Результаты сохранности T. viride спустя 84 суток представлены на рисунке 4, где у препарата Триходермин без добавления природных минералов выявлен такой же интенсивный рост T. viride, как и вначале. Среди исследуемых минералов наилучший рост наблюдается при добавлении диатомита. При хранении T. viride с добавлением остальных природных минералов ее рост не столь наглядно выражен. Так, при использовании в качестве добавок сапропеля и цеолита отмечено снижение зон обрастания комочков торфа по сравнению с первым отбором (21 сутки). Только в варианте 4 (Триходермин + глауконит) на 84 сутки рост T. viride не выявлен.
Данные о содержании T. viride в динамике (рис. 5) свидетельствуют о хорошей сохранности биопрепарата на торфяном субстрате. Известно, что представители рода Trichoderma способны расти в широком диапазоне рН-фактора - от 2,0-6,0 [7]. Поэтому кислотность верховного торфа служит благоприятным фактором для жизнедеятельности гриба T. viride. Высокое содержание T. viride (80100%) отмечено во всех вариантах на 21 сутки хранения, что свидетельствует о быстрой адаптации T. viride и хорошей приживаемости в торфяном субстрате. Глауконит не оказывает стимулирующего действия на рост T. viride. Так, спустя три месяца хранения отмечено наименьшее (25%) содержание микромицета, что в 3,2 раза ниже по сравнению с первым отбором.
Динамика присутствия T. viride в варианте с внесением сапропеля несколько иная. Количество микромицета снижается меньше по сравнению с таковым при добавлении глауконита. Во время последнего отбора количество T. viride в варианте с сапропелем составляет 45%.
Среди исследованных природных минералов наибольшее пролонгирующее действие на рост T. viride оказывают цеолит и диатомит, при внесении которых наблюдается максимальное содержание микромицета на 84 сутки соответственно 65 и 95%. Именно в варианте Триходермин + диатомит на 84 сутки содержание T. viride выше по сравнению с внесением только Триходермина.
Таким образом, применение природных минералов способствует поддержанию жизнеспособности Т. гтйе в течение трех месяцев на верховом торфе. Исследованные минералы (ряд эффективности которых на Т. гтйе следующий: диатомит > цеолит > сапропель) восполняют минеральный состав торфа и повышают его ценность. Однако, учитывая отличие состава торфа от почвы, нужно применять препарат Триходермин с добавлением исследованных минералов в полевых экспериментах.
В современном аграрном производстве, ориентированном на получение биологически чистой продукции растениеводства, применение биопрепаратов является динамично развивающимся направлением. Сохранение коллекционных микроорганизмов без утрат их свойств и снижения численности представляет большую важность не только для научно-исследовательских работ в микробиологии, микологии, но и сельского хозяйства в целом.
Работа выполнена в рамках Государственного задания №FMEG-2021-0003, регистрационный номер 121021600147-1.
Литература
1. Штерншис М.В., Джалилов Ф.С.-У., Андреева И.В., Томилова О.Г. Биологическая защита растений: под ред. М.В. Штерншис. - М.: КолосС, 2004. - 264 с.
2. Потехина Р.М. Морфологические изменения полевых изолятов рода Trichoderma после применения гербицидов // Ученые записки казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана, 2021, Т. 246, № 2. - С. 166-171.
3. Mohsenzadeh F., Shahrokhi F. Biological removing of cadmium from contaminated media by fungal biomass of Trichoderma species // Journal of Environmental Health Science and Engineering, 2014, № 12. - Р. 102.
4. Котляров В.В., Сединина Н.В., Донченко Д.Ю., Котляров Д.В. Влияние давления при опрыскивании растений микробиологическими препаратами на сохранение жизнеспособности микроорганизмов и их численность // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета, 2016, № 115. - С. 1219-1232.
5. Rahnama K. Mass production of Trichoderma spp and application // International Research Journal of Applied and Basic Sciences, 2012, Vol. 3(2). - Р. 292-298.
6. Садыкова В.С., Кураков А.В., Лихачев А.Н., Якушев А.В. Видовой состав и распространение грибов рода Trichoderma в наземных экосистемах бассейна реки Енисей // Микология и фитопатология, 2013, Т. 47, № 6. - С. 390396.
7. Алимова Ф.К. Trichoderma/Hypocrea (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales): таксономия и распространение: учебник. - Казань: Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина, 2007. - 264 с.
8. Danielson R.M. Non nutritional factors affecting the growth of Trichoderma in culture // Soil biology and biochemistry, 1973, Vol. 5(5). - Р. 495-504.
9. Nieto-Jacobo M.F., Steyaert J.M., Salazar-Badillo F.B., Nguyen D.V., Rostas M., Braithwaite M., de Souza J.T., Jimenez-Bremont J.F., Ohkura M., Stewart A., Mendoza-Mendoza A. Environmental growth conditions of Trichoderma spp. affects indole acetic acid derivatives, volatile organic compounds, and plant growth promotion // Frontiers in plant science, 2017, Vol. 8. - P. 102-125.
10. Singh A. Optimal Physical Parameters for Growth of Trichoderma Species at Varying pH, Temperature and Agitation // Virology and mycology, 2014, Vol. 3. - Р. 127-134.
11. Ломако Е.И., Дегтярева И.А., Зарипова С.К. Изменение микробиологических свойств выщелоченного чернозема при внесении биогумуса // Агрохимический вестник, 2003, № 4. - С. 29-30.
12. Гревцев Н.В., Семин А.Н., Гревцева И.Н. Занимательно о торфе. - М. : Фонд «Кадровый резерв», 2020. - 192 с.
13. Прохоров И.С., Завалин А.А., Семенцов А.Ю. Биокомпосты «ПИКСА» - продукт биотехнологической переработки торфа / Материалы Международной научно-практической конференции «Торф в решении проблем энергетики, сельского хозяйства и экологии». - Минск, 2006. - С. 103-105.
14. Прохоров И.С., Карев С.Ю., Типцов А.А. Эколого-экономическое обоснование мелиорации торфяно-болотных комплексов и технологии их рационального использования / Под общей редакцией Ю.А. Мажайского. -Рязань: ФГБОУ ВПО РГАТУ, 2012. - 302 с.
15. Селиванов В.Г., Пискунов О.Д., Юдина С.Н., Усманов Р.Р. Опыт возделывания овощных культур и грибов в фермерской блочной теплице. - М. : ФГБНУ «Росинформагротех», 2011. - 44 с.
16. Дегтярева И.А., Газизов Р.Р., Давлетшина А.Я., Мотина Т.Ю. Изучение состава микробного сообщества гуми-новых препаратов, полученных из низинного торфа // Агрохимический вестник, 2016, № 1. - С. 27-34.
17. Минаева О.М., Акимова Е.Е., Зюбанова Т.И., Терещенко Н.Н. Биопрепараты для защиты растений: оценка качества и эффективности: учеб. пособие. - Томск: Издательский Дом Томского государственного университета, 2018.
- 130 с.
18. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории российской федерации. Часть I. Пестициды: издание официальное. - М.: Министерство сельского хозяйства, 2020. - 799 с.
19. Нанотехнологии в сельском хозяйстве: научное обоснование получения и технологии использования наност-руктурных и нанокомпозитных материалов: под общ. ред. А.Х. Яппарова. - Казань: Центр инновационных технологий, 2013. - 252 с.
20. Ежкова А.М., Сафиуллина Г.Я., Ежков Д.В., Валеулов К.Г. Наноструктурные агроминералы для улучшения физико-химических и микробиологических показателей мяса // Вестник Казанского технологического университета, 2017, Т. 20, № 18. - С. 138-141.
21. Методы почвенной микробиологии и биохимии: под ред. Д.Г. Звягинцева. - М.: МГУ, 1991. - 304 с.
22. Зенова Г.М., Степанов А.Л., Лихачева А.А., Манучарова Н.А. Практикум по биологии почв: учебное пособие.
- М. : Изд-во МГУ, 2002. - 120 с.
