CC BY
51
УДК 616.1-089-053.2
п.В. попрядухин13, г.и. попов2, и.п. добровольная1-3, в.е. юдин13, в.н. вавилов2, г.ю. юкина2, е.м. Иванькова13
Институт высокомолекулярных соединений РАн, 199004, г. Санкт-Петербург, в.о., Большой пр., д. 31 2Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. и.П. Павлова, 197022, г. Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, д. 6-8
3Санкт-Петербургский политехнический университет Петра великого, 195251, г. Санкт-Петербург, ул. Политехническая, д. 29
Разработка матрицы для создания тканеинженерного сосудистого имплантата на основе нановолокон из алифатического сополиамида для детской сосудистой хирургии
Попрядухин Павел Васильевич — кандидат технических наук, старший научный сотрудник, e-mail: [email protected]
С целью создания тканеинженерного сосудистого имплантата для детской сосудистой хирургии получена матрица из нановолокон методом электроформования на основе алифатического сополиамида. Показано, что разработанный материал обладает высокими механическими свойствами (прочность 7.5 MPa, удлинение 299%). Барьерные свойства матрицы достаточны для имплантации ее в сосудистое русло. Доказана биологическая безопасность и биосовместимость матрицы в опытах с мезенхимными стволовыми клетками. Проведена серия хронических экспериментов по имплантации разработанной матрицы в брюшную аорту крыс сроком до 14 месяцев. Получены удовлетворительные показатели проходимости матриц (71%). По данным гистологического исследования, с течением времени происходит интеграция матрицы в сосудистое русло с формированием неоинтимы, без признаков воспаления и миоинтимальной гиперплазии в зоне анастомозов.
Ключевые слова: тканевая инженерия, матрица, нановолокна, алифатический сополиамид.
P.V. POPRYADUKHIN13, G.I. POPOV2, I.P. DOBROVOLSKAYA13, V.E. YUDIN13, V.N. VAVILOV2, G.Yu. YUKINA2, E.M. IVANKOVA13
Institute of Macromolecular Compounds of the Russian Academy оf Science, 31 Bolshoy driveway, Saint Petersburg, Russian Federation, 199004
2Pavlov First Saint Petersburg State Medical University, 6-8 Lev Tolstoy Str., Saint Petersburg, Russian Federation, 197022
3Saint Petersburg Polytechnic University of Peter the Great, 29 Politekhnicheskaya Str., Saint Petersburg, Russian Federation, 195251
Elaboration of matrix for tissue-engineering vascular implant based on aliphatic co-polyamide nano-fibers for children's vascular surgery
Popryadukhin P.V. — Cand. Engineering Sc., Senior Researcher, e-mail: [email protected]
In order to create a tissue-engineering vascular implant for pediatric vascular surgery, a matrix of nanofibres was obtained by electroforming using an aliphatic copolyamide. It was shown to have high mechanical properties (strength 7.5 MPa, elongation at break 299%). Its barrier properties were sufficient for implantation into vessels. Biological safety and biocompatibility of the matrix were proved in experiments with mesenchymal stem cells. Chronic experiments in vivo up to 14 months were carried
out on rats' abdominal aortae. The patency of the grafts was satisfactory (71%). According to histological examination, graft integration occurs with the formation of neointima, without signs of inflammation and myointimal hyperplasia in the anastomosis zone.
Key words: tissue engineering, matrix, nanofibers, aliphatic copolyamide.
Болезни сердечно-сосудистой системы занимают первое место в структуре смертности в большинстве стран мира. Число реконструктивных операций, в течение которых необходимо замещать или шунтировать пораженные сосуды, увеличивается [1]. В педиатрической практике есть специфические особенности проведения хирургических вмешательств на сосудах, связанные в первую очередь с небольшим размерами детского организма и продолжающимся ростом ребенка в послеоперационном периоде. В связи с этим существует острая потребность в реконструкции кровеносных сосудов малого диаметра, а также разработка сосудистых импланта-тов способных увеличиваться в размерах синхронно с ростом организма ребенка, чтобы избежать сложных повторных операций по замене ранее имплантированного протеза на новый, большего диаметра.
В настоящее время в клинике широко используют аутологичные артерии и вены или синтетические протезы. Но, ни те, ни другие не удовлетворяют в полной мере требованиям современной сердечнососудистой хирургии, особенно в случае реконструкции сосуда диаметром менее 5 мм. Аутовена до сегодняшнего дня остается основным материалом в реконструктивной ангиохирургии, однако она имеет целый ряд известных недостатков: уровень проходимости венозных шунтов колеблется от 70 до 90% [2, 3], у 30% больных не находят пригодной для пластики аутовены [4]. Количество «венозного аутоматериала» ограничено, особенно в случае множественного шунтирования или повторных операций. Кроме того, венозные трансплантаты могут подвергаться аневризматической дегенерации, атеросклерозу и тромбозу [5, 6]. Использование синтетических сосудистых протезов сопровождается рядом проблем и осложнений. В первую очередь это ранний тромбоз, вследствие отсутствия эндо-телиальной выстилки, часто наблюдается быстро развивающийся стеноз зон анастомозов, существует также опасность возникновения инфекционных осложнений [7]. Кроме того, синтетические протезы не пригодны для эффективной реконструкции артерий малого диаметра (например, коронарных артерий, артерий голени) из-за низких показателей проходимости в послеоперационном периоде [8, 9].
Решением этих актуальных проблем может стать создание тканеинженерного сосудистого импланта-та (ТИСИ), т.е. искусственного сосуда, полученного методами тканевой инженерии на основе полимерной матрицы. Вновь созданная «артерия» должна отвечать следующим характеристикам: биосовместимость, биостабильность, герметичность и тром-борезистентность. Также ТИСИ должен быть достаточно прочным и эластичным, чтобы выдерживать перепады кровяного давления и проводить пульсовую волну [10]. Стенка матрицы, входящей в состав ТИСИ, должна иметь пористую структуру с высокой удельной поверхностью, которая способствует адгезии и пролиферации на ней клеток, транспорту питательных веществ и газов. Успешное функционирование ТИСИ в течение длительного времени в организме реципиента, во многом обуславливает-
ся отсутствием иммунной реакции на имплантат и возможностью образования на полимерной матрице тканей, идентичных тканям реципиента, в том числе и слоя эндотелия, обеспечивающего высокую тромборезистентность.
Цель работы — разработка матрицы для создания ТИСИ малого диаметра на основе нановолокон из алифатического сополиамида (СПА), исследование ее биосовместимости, механических и барьерных свойств, а также проведение длительных хронических опытов in vivo.
Материал и методы
Получение матрицы из нановолокон СПА
Объектами исследования являлись трубчатые и пленочные пористые матрицы на основе нановолокон из алифатического сополиамида, сополимера е-капролактама и гексаметилендиаминадипината, Mw=30 кДа, производства ООО «Анид» (Россия). Нановолокна получали методом электроформования из растворов СПА в спиртоводной смеси с соотношением этанол/вода 80/20 об.% на лабораторной установке Nanon-01A (Япония) [11]. Раствор СПА концентрацией 18 мас. % с помощью инжекторного насоса подавали через электрод-фильеру в электрическое поле с напряженностью Е=1.5х104 - 4.0х105 В/м при расстоянии между электродами 0.15 м, осаждение волокон происходило на плоском или цилиндрическом электродах. Скорость вращения цилиндрических электродов диаметром 1.0 мм варьировали от 600 до 3000 об/мин. Толщина стенки трубчатых матриц, полученных при скорости вращения электрода 600 об/мин, составляла 200 и 270 мкм, при скорости вращения 3000 об/мин составляла 210, 230, 270 и 400 мкм.
Оценка биосовместимости и безопасности полученной матрицы
Для цитологических исследований материалов на основе нановолокон были использованы культуры мезенхимных стволовых клеток жировой ткани крысы (ASCs). Белая жировая ткань, полученная методом липэктомии, была подвергнута гомогенизации, ферментативной обработке 0.2% раствором коллагеназы (Sigma, США) и центрифугированию. Выделенные клетки культивировали в питательной среде MEM Alpha Modification (Gibco, США) с добавлением 15% фетальной сыворотки телят (Gibco, США) и антибиотиков: 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США). Культивирование стволовых клеток производилось в CO2-инкубаторе в атмосфере с влажностью 70%, содержанием CO2 5% и Т=37°С. Для оценки степени адгезии клеток, использовали платы с квадратными лунками (Nunc, США), в которые помещали исследуемый материал.
Исследование механических свойств матрицы
Механические характеристики пленочных образцов определяли на универсальной установке для механических испытаний Instron 5943 (Великобритания) в режиме одноосного растяжения (скорость растяжения 40 мм/мин). На образцах в виде
полос шириной 2 мм, толщиной 210 мкм, длиной рабочей части 25 мм определяли модуль упругости, прочность на растяжение, деформацию до разрыва. Испытания проводились как на сухих образцах (выдержанных в течение суток в эксикаторе при относительной влажности 66%), так и на образцах, предварительно выдержанных в физиологическом растворе в течение 60 мин.
Изучение барьерных свойств матрицы
Барьерные свойства матриц на основе СПА исследовали на лабораторной установке ИВС РАН. Физиологический раствор, окрашенный перманганатом калия, подавался в трубчатый образец с внутренним диаметром 1 мм с проградиентным увеличением скорости V=0.06-0.30 м/с. Величину критической скорости прохождения жидкости через трубку оценивали по появлению на ее наружной поверхности окрашенной жидкости. Гидродинамическое давление рассчитывали по формуле: P=pV2/2, где р=1 г/см3 — плотность жидкости, V — скорость движения жидкости через трубку.
Исследование микроструктуры матрицы из СПА
Исследование микроструктуры образцов проводили с помощью метода сканирующей электронной микроскопии; использовали микроскоп Supra-55 VP фирмы Carl Zeiss (Германия). Перед измерением на поверхность образцов напыляли слой платины.
Техника имплантации матрицы в позицию брюшной аорты крысы
Самцы крыс весом 300-350 гр одной генетической линии были прооперированы под общей анестезией (растворы Zoletil 100 — 0.1 мл и Rometarum 20 мг/ мл — 0.0125 мл) на 0.1 кг массы животного, интра-перитонеально. Животным выполняли Y-образную лапаротомию, мобилизацию инфаренального отдела аорты с перевязкой поясничных артерий. После иссечения инфаренального отдела аорты его протезировали матрицей из СПА с внутренним диаметром 1.0 мм, длиной 8 мм. Время ишемии задних конечностей составляло в среднем 50 минут. Во всех опытах после включения кровотока не было
значимого кровотечения сквозь стенку или по линии анастомозов. Проходимость матриц оценивали классической методикой [12] сразу после вшивания протеза и через 30 минут. Животных содержали в виварии в отдельных клетках при свободном доступе к пище и воде. В послеоперационном периоде проводилось наблюдение за цветом и температурой кожных покровов задних конечностей животных, их двигательной активностью. Прооперировано 21 животное, сроки наблюдения составляли 3, 7, 14 суток, 1, 3, 6, 14 месяцев.
При выполнении экспериментальных исследований руководствовались требованиями приказов №1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., №267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», принципами Европейской конвенции (г. Страсбург, 1986 г.) и Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном обращении с животными (1996 г.).
Гистологическое исследование
Для гистологического исследования матрицу и прилегающую к ней часть нативного сосуда фиксировали в 10% нейтральном формалине на фосфатном буфере (рН 7,4) в течение суток, затем обезвоживали, для заливки материала в парафиновые блоки использовали гистологическую методику с изопропиловым спиртом и петролейным эфиром. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (Bio-Optica, Италия). Для визуализации соединительной ткани использовали метод Маллори (Bio-Optica, Италия). Микроскопический анализ проводили на световом микроскопе Leica DM750 (Германия) при окуляре 10х, объективе 4, 10, 40, 100х. Фотосъемку выполняли с помощью фотокамеры ICC 50 (Leica, Германия).
Результаты и обсуждение
Полученные методом электроформования трубчатые матрицы из нановолокон сПа имели гладкую ровную внутреннюю поверхностью (рис. 1, 2).
Таблица.
Механические характеристики пленочных образцов на основе нановолокон из СПА
Среда Толщина, мкм Прочность, МПА Модуль, МПа Удлинение, %
Воздух 210 6,18 63,9 133,5
Физ. р-р 210 7,48 15,1 299,1
Рисунок 1.
Матрицы на основе нановолокон из СПА, полученные методом электроформования (а); электронная микрофотография внутренней поверхности матрицы (б)
Рисунок 2.
Микрофотографии торцов матриц на основе нановолокон из СПА, скорость вращения приемного электрода ш = 600 (а, б) и 3000 об/мин (в, г)
Рисунок 3.
Зависимости критических величин скорости (а) и гидродинамического давления (б) от толщины стенок матриц из СПА, полученных со скоростью вращения приемного электрода 3000 об/ мин (кривая 1) и 600 об/мин (кривая 2)
Электронно-микроскопические исследования показали, что стенка матрицы состоит из нановолокон диаметром 500-800 нм, между волокнами существуют поры с размером 2-10 мкм.
Из анализа микрофотографий торцов матриц следует, что ориентация нановолокон зависит от скорости вращения приемного электрода. При скорости вращения ш=600 об/мин нановолок-на располагаются преимущественно параллельно оси трубки (рис. 2а, б). Повышение скорости до ш=3000 об/мин приводит к преимущественно
перпендикулярному расположению нановолокон (рис. 2в, г).
На пленочных образцах из СПА были изучены механические характеристики. В таблице приведены значения модуля упругости, прочности на растяжение, деформации до разрыва образцов, испытанных в воздушно-сухом и влажном состоянии.
Таким образом, после выдерживания образца в физиологическом растворе существенно увеличивается эластика — растет удлинение до разрыва, уменьшается модуль упругости, при этом наблюда-
Рисунок 4.
Адгезия и пролиферация стволовых клеток на пленочных материалах на основе нановолокон из СПА (а), поверхность пленки через 7 суток культивирования (б)
Рисунок 5.
Результаты гистологического исследования области анастомоза матрицы из СПА и брюшной аорты крысы через 30 суток. Окраска гаматоксилином и эозином, (а) — увеличение объектива 10, (б) — увеличение объектива 40
ется небольшое увеличение прочности. Известно, что естественные кровеносные сосуды человека выдерживают давление до 3000 мм Hg, (400 КПа) [l3, 14]. Таким образом, материалы на основе нановолокон из СПА, прочность которых около 7 МПа, способны выдерживать существенно большие нагрузки, как в сухом, так и во влажном состояниях. Это позволяет предположить, что в условиях гидродинамических нагрузок, которые создаются кровотоком, трубчатые матрицы не будут деформироваться и разрушаться.
На трубчатых образцах проведены исследования барьерных свойств матрицы, определены величины давления, при которых наблюдалось протекание модельной жидкости через стенку матриц, полученных при скорости вращения приемного электрода ш=600 и 3000 об/мин. Как показало исследование величина давления, при котором начинается просачивание жидкости через стенку матрицы, зависит от ее структуры и толщины (рис. 3). Матрицы, в которых нановолокна расположены перпендикулярно оси матрицы (ш=з000 об/мин.), способны выдерживать более высокие скорости прохождения жидкости и соответственно давления,
чем образцы с продольным расположением волокон (ш=600 об/мин.). Величины критической скорости прохождения жидкости через матрицу и гидродинамического давления, которое создает поток, зависит от толщины стенок нелинейно. При толщине стенки более 270 мкм в образце, где волокна расположены преимущественно параллельно оси трубки (ш=600 об/мин.), наблюдается снижение критического давления пропускания. Это связано с образованием макропор и как результат повышением дефектности материала. Можно предположить, что увеличение толщины материала, который осаждается на приемном электроде, приводит к экранированию, изменению характеристик электрического поля, это в свою очередь способствует образованию пор и других дефектов структуры.
Таким образом, матрицы с толщиной стенки 270 мкм и перпендикулярным расположением нановолокон (Ш=3000 об/мин.) способны выдерживать давление до Р=35 Па. Следует отметить, что это минимальное значение, т.к. испытания на проницаемость проводились с использование водного раствора перманганата калия, при прохождении крови внутри сосуда в первые минуты после импланта-
1ЕД
Рисунок 6.
Состояние матрицы на основе СПА через 6 месяцев имплантации (поперечный срез); Окраска гаматоксилином и эозином, (а) — увеличение объектива 10, (б) — увеличение объектива 40
Рисунок 7.
Матрица на основе СПА через 14 месяцев имплантации (продольный срез); Окраска гаматоксилином и эозином, (а) — увеличение объектива 10, (б) — увеличение объектива 40
ции форменные элементы крови и белки заполняют пространство пор, образуя фибриновые сгустки, которые существенно понижают проницаемость стенок сосудов.
Исследование адгезии и пролиферации стволовых клеток, полученных из жировой ткани крысы, позволило оценить совместимость материалов на основе нановолокон из СПА с клеточными культурами (рис. 4). Мезенхимные стволовые клетки активно пролиферировали на полученных матрицах, имели типичную морфологию и размеры, что свидетельствует об оптимальных условиях адгезии. Псевдоподии клеток плотно контактируют с на-новолокнами, основное тело клеток располагается преимущественно в межволоконных порах, что способствует обменным процессам, протекающим между внешней средой и поверхностью клеток.
Полученные трубчатые матрицы диаметром 1 мм и толщиной стенок 270 мкн (ш=3000 об/мин) были имплантированы в брюшную аорту крысы с использованием техники микрохирургии.
Гистологические исследования показали, что на 3 сутки на внутренней поверхности матрицы образуется слой фибриновых волокон, признаки вос-
палительной реакции отсутствуют. Через 30 суток формируется эндотелиальная выстилка, субэндо-телиальный слой, зоны анастомозов без признаков гиперплазии интимы и иммунного ответа (рис. 5). После снятия швов с зоны анастомозов, анастомозы полностью состоятельны. В дальнейшем происходит умеренное увеличение толщины субэндотели-ального слоя, разрастание соединительной ткани на наружной поверхности матриц. Гистологическая оценка матриц через 6 и 14 месяцев пребывания в сосудистой позиции также показала наличие эн-дотелиальной выстилки, субэндотелиального слоя без признаков гиперплазии интимы, признаков стенозирования и дилатации также не выявлено. Зоны анастомозов без признаков мионинтимальной гиперплазии (рис. 6, 7). На внешней поверхности определяются равномерные слои соединительной ткани с врастанием вглубь стенки матрицы. Суммарная проходимость матриц составила 71% (15/21).
Выводы
Полученная трубчатая полимерная матрица из нановолокон СПА с внутренним диаметром 1 мм и толщиной стенки 270 мкм, соответствует крите-
риям разработки ТИСТ. В опытах с мезенхимными стволовыми клетками in vitro и в хронических экспериментах на крысах in vivo, доказана ее биосовместимость и безопасность. Механические свойства полимерного материала и барьерные свойства матрицы достаточны для имплантации ее в сосудистое русло. Высокая пористость и большая удельная поверхность матрицы, обусловленные ее наноструктурой, способствовали формированию тканей, идентичных нативным. Наличие эндотелиально-го слоя на внутренней поверхности матрицы обеспечило удовлетворительные для протезов малого диаметра показатели проходимости 71% (15/21). Следовательно, разработанная матрица пригодна по своим механическим и биологическим свойствам для дальнейшего применения в составе тканеинже-нерного сосудистого имплантата при реконструкции сосудов малого диаметра в детской сосудистой хирургии.
Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (проект №14-33-00003).
ЛИТЕРАТУРА
1. World health statistics 2016: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. — Geneva: WHO Press, 2016. — P. 64
2. Kim F.Y., Marhefka G., Ruggiero N.J., Adams S. et al. Saphenous vein graft disease: review of pathophysiology, prevention and treatment // Cardiol. Rev. — 2013. — Vol. 21, №2. — P. 101-119.
3. Yazdani S.K., Otsuka F., Nakano M., et al. Pathology of Saphenous Vein Grafts // Interv. Cardiol. Clin. — 2013. — Vol. 2, №2. — P. 241249.
4. Harskamp R.E., Lopes R.D., Baisden C.E., et al. Saphenous vein graft failure after coronary artery bypass surgery: pathophysiology, management, and future directions // Ann. Surg. — 2013. — Vol. 257, №5. — P. 824-833.
5. Athanasiou T., Saso S., Rao C., et al. Radial artery versus saphenous vein conduits for coronary artery bypass surgery: forty years of competition — which conduit offers better patency? A systematic review and meta-analysis. Review Article // Eur. J. оf Cardio-Thoracic Surg. — 2011. — Vol. 40, №1. — P. 208-220.
6. Покровский А.В. Клиническая ангиология в двух томах. — М.: Медицина, 2004. — Т. 1. — С. 337-338.
7. Kannan R.Y., Salacinski H.J., Butler P.E., et al. Current status of prosthetic bypass grafts: a review // J. Biomed. Mater. Res. B Appl. Biomater. — 2005. — Vol. 74, №1. — P. 570-581.
8. Leon L., Greisler H.P. Vascular grafts, Expert Rev // Cardiovasc. Ther. — 2003. — Vol. 1, №4. — P. 581-594.
9. Seifu D.G., Purnama A., Mequanint K., Mantovani D. Small-diameter vascular tissue engineering // Nat. Rev. Cardiol. — 2013. — Vol. 10, №7. — P. 410-421.
10. Thomas A.C., Campbell G.R., Campbell J.H. Advances in vascular tissue engineering // Cardiovascular Pathology. — 2003. — №12. — P. 271-276.
11. Dobrovolskaya I.P., Popryadukhin P.V., Yudin V.E., Ivan'kova E.M. et al. Structure and properties of porous films based on aliphatic copolyamide developed for cellular technologies // J. Mater. Sci. — Mater. Med. — 2015. — Vol. 26, №1. — P. 5381-5391.
12. Acland R.D. Signs of patency in small vessel anastomosis // Surgery. — 1972. — Vol. 72, №5. — P. 744-748.
13. Lamm P., Juchem G., Milz S., et al. Autologous endothelialized vein allograft: a solution in the search for small-caliber grafts in coronary artery bypass graft operations // Circulation. — 2001. — Vol. 104, №1. — P. 108-114.
14. Konig G., McAllister T.N., Dusserre N., Garrido S.A. et al. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery // Biomaterials. — 2009. — №30. — P. 1542-1550.
новое в медицине. интересные факты
грудное вскармливание уменьшает риск внезапной детской смерти
Ученые из Медицинской школы Университета вирджинии проанализировали данные 8 международных исследований, в которых изучались 2259 случаев синдрома внезапной детской смерти (СвДС). в контрольную группу вошли в общей сложности 6894 ребенка.исследователи выяснили: грудное вскармливание в течение минимум 2 месяцев снижало риск СвДС вдвое. Чем дольше детей кормили грудью, тем ниже оказывался риск. Ученые подчеркивают, что вероятность СвДС уменьшалась не только при кормлении ребенка исключительно грудным молоком, но и при смешанном вскармливании. Специалисты настоятельно рекомендуют женщинам кормить детей грудью. Как известно, грудное вскармливание полезно не только для ребенка, но и для кормящей матери. К примеру, исследование с участием более 4700 кореянок показало, что кормление грудью защищает матерей от метаболического синдрома - комплекса нарушений, повышающих риск сердечного приступа, инсульта и диабета.
Источник: Meddaily.ru
