CC BY
56
оценка биосовместимости БИОДЕГРАДИРУЕМОГО
сосудистого графта малого диаметра из полигидроксибутирата/валерата и поликапролактона: морфологическое исследование
Л.В. Антонова 1, Р.А. Мухамадияров 1, А.В. Миронов 2, А.Ю. Бураго 1, Е.А. Великанова 1, О.Д. Сидорова 3, Ю.А. Кудрявцева 1, ОЛ. Барбараш 1, Л.С. Барбараш 1
1 Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний, Кемерово, Россия.
2 Кемеровский кардиологический диспансер, Кемерово, Россия
3 Кемеровская Государственная медицинская академия, Кемерово, Россия
A morphological investigation of the polyhydroxybutyrate/valerate and polycaprolactone biodegradable small-diameter vascular graft biocompatibility
L.V. Antonova 1, R.A. Mukhamadiyarov1, A.V. Mironov2, A.Yu. Burago 1, EA. Velikanova 1, O.D. Sidorova 3, YuA. Kudryavtseva 1, O.L. Barbarash 1, L.S. Barbarash 1
1 Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russia
2 Kemerovo Cardiology Dispensary, Kemerovo, Russia
3 Kemerovo State Medical Academy, Kemerovo, Russia
Изучена интеграция с клетками и тканями организма био-деградируемых сосудистых графтов, изготовленных методом электроспиннинга из полигидроксибутирата/валерата и по-ликапролактона . Графты были имплантированы в брюшную часть аорты крыс линии Wistar на 12 мес . В течение всего срока имплантации графты оставались проходимы . При гистологическом исследовании 25% эксплантированных графтов не имели проблемных зон, в 25% графтов выявлена фиброзно-тромбоцитарная выстилка в зонах анастомозов, в 41,7% — незначительная гиперплазия соединительной ткани в просвете, в 8,3% — частичная воспалительная инфильтрация стенки При дополнительном морфологическом исследовании графтов по оригинальной методике авторов выявлено, что деградация полимера сопровождалась замещением стенки графтов клетками разных типов (макрофагами, фибробластоподобными, эпителиоидными и гигантскими многоядерными клетками) с формированием собственного внеклеточного матрикса на месте полимерного каркаса Таким образом, долгосрочная проходимость и результаты комплексного морфологического исследования подтвердили пригодность созданной трубчатой полимерной конструкции из полигидроксибутирата/валерата и поликапролактона выступать в качестве основы для создания различных вариантов гибридных сосудистых графтов малого диаметра
Ключевые слова: биосовместимые биодеградируемые полимеры, сосудистый имплант малого диаметра, морфологическое исследование
We studied the integration of polyhydroxybutyrate/ valerate (PHBV)/polycaprolactone (PCL) biodegradable electrospun vascular grafts with organism cells and tissues . Grafts were implanted into abdominal aorta of Wistar rats for twelve months . All the grafts were patent during the whole period of implantation . Twelve months postimplantation, 25% of the grafts were intact, and 25% of the grafts had parietal thrombus only at anasthomotic sites and thrombusfree surface at all other sites . Regarding other grafts, we revealed minor connective tissue hyperplasia in 41. 7% of the grafts, and an inflammatory infiltrate in the part of the arterial wall in 8 . 3% of the grafts . Using original technique of the morphological investigation, we found that polymer degradation was accompanied by the replacement of the graft wall by various cells (macrophages, fibroblast-like cells, epithelioid cells, and multinucleated giant cells) with the formation of extracellular matrix instead of the polymer scaffold Therefore, long-term patency and the results of the morphological study confirmed the possibility to use PHBV/PCL tubular polymer construct in the creation of small-diameter vascular grafts
Keywords: biocompatible biodegradable polymers, small-diameter vascular graft, morphological studies
Введение
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в реконструктивной хирургии, по-прежнему остается актуальным поиск новых высоко функциональных материалов, пригодных для конструирования систем, способных воспроизвести биологические функции живого организма . На сегодняшний день одной из нерешенных проблем, в том числе в кардиохирургии, является отсутствие протезов для замещения артерий малого диаметра [1]. Возможный путь решения данной проблемы — создание сосуда непосредственно в организме на основе биодеградируемого сосудистого графта, обладающего высокой биосовместимостью, гемосовместимостью и атромбогенностью [2]. Особым преимуществом матриксов на основе биосовместимых биодеградируемых полимеров является способность к пролонгированной резорбции
e-mail: antonova . la@mail . ru
с возможностью замещения матрикса собственными клетками и тканями организма [3].
Метод электроспиннинга — универсальный метод для изготовления нано- и микромасштабных волокон, которые обладают большим потенциалом для имитации микроархитектоники природного внеклеточного матрикса (ВКМ). К достоинствам метода электроспиннинга относятся относительная простота технологического процесса и эффективный контроль над его ключевыми параметрами [4, 5]. Матриксы, сформированные методом электроспиннига, обладают высокой пористостью и удовлетворительными характеристиками прочности [6, 7]. Поэтому метод электроспиннинга является наиболее популярным при создании высокопористых биорезорбируемых конструкций, в том числе при разработке сосудистых имплантатов малого диаметра [8].
Среди биодеградируемых полимеров в сосудистой тканевой инженерии используют полигликолевую и полимолочную кислоты, поликапролактон, полигли-церолсебакат и полигидроксиалканоаты (РНА) . Одно из первых исследований долгосрочной проходимости биодеградируемых трубчатых матриксов датируется 1999 г . , когда группой ученых была предложена конструкция скаффолда из сополимера полигликолевой кислоты и полигидроксиалканоатов [9]. Смешанная популяция аутогенных клеток (эндотелиальных, глад-комышечных и фибробластоподобных), полученная из сонных артерий овцы, культивировалась на матрик-сах, после чего полученные тканеинженерные трубчатые конструкции были имплантированы в брюшную часть аорты ягнят на 5 мес . За это время все графты оставались проходимы и не формировали аневризм Гистологический анализ подтвердил наличие эластических волокон в средней оболочке и эндотелиальных клеток — во внутренней . Во время имплантации механические свойства трубчатых матриксов изменились и стали схожи с показателями нативных сосудов
Использование поликапролактона в качестве основы для создания сосудистых графтов было изучено в различных форматах: как самостоятельной структуры [10—12], в виде многослойного покрытия (полигликолевая кислота-поликапролактон-поли-гликоевая кислота) [13], в форме нанесенного методом электроспиннинга покрытия на каркас из по-лиглицеролсебаката [14] и в качестве сополимера с L-лактидом [15]. Продемонстрировано, что графты из поликапролактона, изготовленные методом электроспиннинга и имплантированные в брюшную часть аорты крыс на 6 мес . , имели хорошую проходимость, структурную целостность, быструю эндотелизацию, формирование внеклеточного матрикса и деградацию волокон полимера [10, 16]. Отечественные ученые в экспериментах на лабораторных животных также подтвердили, что сосудистые графты, основой которых являются биодеградируемые полимеры (поликапролактон), выдерживают долгосрочную нагрузку, сохраняют проходимость, подвергаются не-оваскуляризации и заселению клетками [17].
Разработка и имплантация тканеинженерных сосудистых графтов предусматривает не только контроль долгосрочной проходимости, но и морфологический контроль интеграции живых тканей с полимерным материалом Сосудистый имплантат имеет определенную длину, и в каждом его участке можно наблюдать различную гистологическую картину . Для адекватной морфологической оценки сосудистого кондуита необходимо решить следующие задачи: во-первых, изучить процессы ремоделирования протеза «послойно» на всем протяжении, во-вторых, исследовать реакцию окружающих тканей на полимерный графт и структурную перестройку со стороны просвета графта . Следует отметить, что морфологический анализ необходим, как на светооптическом уровне, так и с использованием электронной микроскопии Традиционные методы морфологического анализа требуют приготовления отдельных срезов для световой и электронной микроскопии Оригинальная методика, разработанная в НИИ КПССЗ [18], позволяет выполнять оба метода исследования на одном и том же образце по всей его площади
Цель работы: с помощью морфологических методов оценить возможность формирования ткани de novo на месте биодеградируемого сосудистого
графта, изготовленного из полигидроксибутирата/ валерата (ПГБВ) и поликапролактона (ПКЛ) методом электроспиннинга и имплантированного в сосудистое русло крысы .
Материал и методы
Изготовление полимерных сосудистых
графтов
Трубчатые матриксы диаметром 2 мм на основе ПГБВ (Sigma-Aldrich, США) и ПКЛ с молекулярной массой 80 000 кДа (Sigma-Aldrich, США) изготовлены методом электроспиннинга на аппарате NANON (MECC, Япония) в следующем режиме: напряжение — 20 kV, скорость подачи — 0,3 мл/ч, игла — 22 G, диаметр намоточного коллектора — 2 мм, расстояние от иглы до намоточного коллектора — 150 мм .
Оценка физико-механических свойств сосудистых графтов
Физико-механические испытания сосудистых графтов на основе ПГБВ/ПКЛ (n = 10) осуществляли в условиях продольного растяжения однотипно приготовленных образцов на универсальной испытательной машине (Zwick/roell, Германия). Учитывали показатели прочности и упруго-деформативных свойств материала Прочность оценивали по максимальному напряжению при растяжении, упруго-де-формативные свойства — по относительному удлинению при растяжении, скорректированному с учетом характера разрушения образцов, и модулю Юнга, характеризующему способность материала сопротивляться растяжению при упругой деформации В качестве контроля использовали образцы натив-ных вен человека (V . Saphena), применяемых для аорто-коронарного шунтирования (АКШ) Все пациенты перед операцией АКШ подписывали развернутое информированное согласие
Сканирующая электронная микроскопия полимерных сосудистых графтов
До имплантации структура внутренней поверхности и стенки полимерных сосудистых графтов была изучена методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) в условиях высокого вакуума на микроскопе Hitachi S 3400 N (Япония) с формированием на поверхности образцов золото-палладиевого токопроводящего покрытия методом вакуумного напыления (установка Quorum Technologies SC 7640, Великобритания) в течение 240 с . Расчетная толщина покрытия 300—320 ангстрем . Измерения толщины стенок графтов и диаметра волокон выполняли с помощью программы SEM Manager из базовой комплектации микроскопа
Имплантация сосудистых графтов в брюшную часть аорты крыс
Эксперименты по имплантации проводили на 6-мес . крысах-самцах линии Wistar массой 300— 350 г . Все манипуляции с животными проводили с учетом требований гуманного обращения с экспериментальными животными согласно приказу № 742 13 . 11. 84 «Об утверждении правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» . Сосудистые графты на основе ПГБВ/ПКЛ диаметром 2 мм и длиной 10 мм были имплантиро-
ваны по методике «конец в конец» в брюшную часть аорты 12 крысам после предварительной наркотизации 3% изофлураном (Baxter, США). Во время операции все животные получали ингаляционный наркоз 1,5% изофлурана . Для наблюдения за проходимостью графтов каждые 3 мес . проводили ультразвуковое исследование (УЗИ) с использованием портативной переносной системы цветной доппле-рографии премиум-класса М7 (Mindray, Китай). Выведение животных из эксперимента осуществляли через 12 мес
Гистологическое исследование
Через 12 мес . после имплантации сосудистые графты на основе ПГБВ/ПКЛ эксплантировали, фиксировали в 10% забуференном формалине, делили на 2 равные части (по 5 мм), одну из которых направляли на стандартный гистологический анализ, а вторую подвергали пробоподготовке, описанной в пункте «Дополнительное морфологическое исследование с использованием оригинальной методики» .
Образцы для рутинного гистологического анализа заключали в парафин, получали по 6 серийных срезов, которые окрашивали гематоксилином-эозином и пикрофуксином по Ван Гизону . Срезы просматривали на световом микроскопе AXiO imager A1 (Carl Zeiss, Германия) по всей поверхности среза графта (до 30 полей зрения в зависимости от увеличения) при увеличениях объектива х5, х10, х20, х40 .
Дополнительное морфологическое исследование с использованием оригинальной методики
Метод основан на заключении гистологического образца в эпоксидные смолы, получении шлифов, окрашивании красителями для световой и электронной микроскопии и проведении анализа на одном и том же образце без предварительного приготовления срезов [18]. Данная методика позволяет выполнять гистологическое исследование на образце сложного состава с элементами различной твердости При резке парафиновых блоков мягкие волокнистые остатки графта затрудняют получение качественных срезов При заливке образцов в значительно более плотную, чем парафин, эпоксидную смолу, клетки разных типов и волокнистые части графта при шлифовке-полировке сохраняют свою локализацию, что позволяет изучать тонкую структуру материала Помимо этого при подготовке эксплантированных графтов к стандартному гистологическому анализу в процессе проводки происходит частичное растворение полимерного материала, что ухудшает не только условия резки и окраски образца, но и меняет локализацию в нем клеток разных типов
В наших экспериментах 1/2 эксплантированных ПГБВ/ПКЛ-графтов длиной 5 мм фиксировали в 10% забуференном формалине, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и абсолютном ацетоне, пропитывали смесью ацетон-смола, затем — заливочной смолой Эпон (Sigma-Aldrich, США) под вакуумом в системе вакуумной импрегнации CitoVac (Struers, Дания) в течение 36 ч . , далее переносили в свежую порцию смолы и полимеризо-вали в специальных контейнерах
Полученные блоки шлифовали до необходимой глубины и полировали поверхность с использованием
шлифовально-полировального станка TegraPol-11 (Struers, Дания) . Шлифовку осуществляли, используя диски MD Rondo (Struers, Дания) с разным размером абразивных зерен в следующем порядке: 1200, 1000 и 800 grit . Для полировки последовательно использовали диски, покрытые сукном с различной упругостью, в комбинации с суспензиями, содержащими монокристаллические алмазы (DP-Spray M, Struers, Дания) в следующей последовательности: MD Mol с 9 мкм алмазной суспензией, MD Pan с 6 мкм алмазной суспензией, MD Dur с 3 мкм алмазной суспензией, MD Nup без алмазной суспензии. Время полировки на каждом диске — 20 мин Далее образцы шлифовали и окрашивали гистологическими красителями — метиленовым синим и основным фуксином. На полированную поверхность вначале наносили несколько капель 0,5% раствора метиленового синего (Sigma-Aldrich, США), приготовленного на 1% растворе тетраборнокис-лого натрия (Sigma-Aldrich, США), и после промывки докрашивали 1% водным раствором основного фуксина (Sigma-Aldrich, США) . По аналогии с окрашиванием полутонких срезов ядра клеток приобретали синий цвет, коллаген — ярко-розовый, эластин — красно-фиолетовый . Полученные препараты изучали в световом микроскопе Axio imager A. 1 (Carl Zeiss, Германия) . При необходимости дальнейшего изучения более глубоких слоев материала образцы вновь шлифовали и повторяли процедуры полировки и окрашивания
Для визуализации морфологической картины образца методом сканирующей электронной микроскопии использовали режим работы микроскопа в обратно-рассеянных электронах, которые обладают значительно большей энергией по сравнению с вторичными электронами, следовательно, несут информацию не о поверхности образца, а об его слоях, находящихся на глубине 0,1—1 мкм . Выход обратно-рассеянных электронов тем выше, чем больше атомный номер элементов, поэтому на получаемом изображении участок, состоящий из тяжелых элементов, выглядит ярче (композиционный контраст) В наших экспериментах для повышения композиционного контраста образцы контрастировали красителями, используемыми при трансмиссионной электронной микроскопии биологического материала . Так как эти красители связываются с белками, нуклеиновыми кислотами и другими биологическими молекулами, в режиме регистрации обратно-рассеянных электронов выявляется субклеточная структура образца Для двойного контрастирования материала последовательно использовали 2% водный раствор уранилацетата (Electron Microscopy Science, США) и 1% цитрата свинца (Electron Microscopy Science, США) На каждом образце процедуру шлифовки-полировки и окраски выполняли 6-кратно и проводили морфологическое исследование по всей поверхности образца
Результаты
Морфология полимерных графтов
до имплантации
При изучении структуры внутренней поверхности ПГБВ/ПКЛ-графтов с помощью СЭМ выявлено, что толщина стенки графтов составила, в среднем, 190,0 (150,4; 240,2) мкм (рис . 1 А), а их внутренняя поверхность была представлена хаотично
расположенными нитями толщиной 1,80—3,97 мкм и наличием пор между нитями размером 21,3— 40,0 мкм (рис . 1 Б).
Результаты физико-механических испытаний показали, что у изготовленных ПГБВ/ПКЛ-графтов относительное удлинение в 5,9 раза превышало таковое у V. saphena, (р<0,05) (табл . ) . Прочность опытных и контрольных образцов была сопоставима . Однако жесткость полимерных трубчатых матриксов оказалась выше: модуль Юнга в 20,4 раза превысил данный показатель V . saphena, (р<0,001).
Наблюдение за проходимостью графтов с помощью УЗИ с функцией допплера выявило, что в течение 12 мес . имплантации все графты были проходимы (рис . 2), что также подтверждено результатами последующей аутопсии . При выводе животных из эксперимента аневризмообразования в стенках трубчатых каркасов, стенозов и видимых дефектов не выявлено
Результаты гистологического исследования
После 12 мес . имплантации внутренняя поверхность 25% эксплантированных графтов (n = 3) была без признаков воспаления и тромбообразования (рис . 3А). У 25% графтов (n = 3) в зонах анастомозов выявлено образование тонкой пристеночной фиброзно-тромбоцитарной выстилки, образующейся в процессе естественной организации анастомоза (рис . 3Б) . Таким образом, в 50% случаев (n = 6)
мы наблюдали удовлетворительную гистологическую картину, при этом у половины данных графтов обнаружен монослой эндотелиальных клеток на внутренней поверхности (рис. 3 Е). Среди остальных имплантированных графтов в 41,7% (n = 5) отмечена незначительная гиперплазия соединительной ткани в просвете (рис 3 В), у 8,3% графтов (n = 1) — частичная воспалительная инфильтрация стенки (рис 3 Г)
Тем не менее, на фоне выявленных проблем отмечено, что созданные сосудистые графты на основе ПГБВ/ПКЛ прекрасно поддерживают миграцию, пролиферацию и жизнеспособность клеток, что и является основой воссоздания на месте временного каркаса ткани de novo Спустя 12 мес имплантации при проведении СЭМ выявлено наличие большого количества фибробластоподобных клеток, которые заполнили всю толщу стенки графтов (рис . 3 Ж), располагаясь хаотично, что отличает расположение клеток в стенке графта от такового в стенке аорты крысы (рис 3 Д, Е) Высокопористая структура стенок графтов и открытые (не запаянные) поры позволили клеткам мигрировать в средние слои стенок и образовывать там собственный внеклеточный матрикс, контактирующий с материалом графта . Архитектоника внутренней поверхности полимерных графтов, имитирующая структуру внеклеточного ма-трикса, способствовала эндотелизации внутренней поверхности 25% графтов (рис 3 З)
S3400 10.OkVxl 50
Рис. 1.
ПГБВ/ПКЛ-графты,
изготовленные
методом
электроспиннинга:
А — структура
поперечного среза
стенки графта;
Б — внутренняя
поверхность.
Сканирующая
электронная
микроскопия.
Ув.: А х250; Б х1000
Таблица. Механические свойства полимерных трубчатых матриксов на основе ПГБВ^ЗД и нативных вен
Объект Прочность, MPa Относительное удлинение, % модуль Юнга, мРа
ГрафтПГБВ/ПКЛ, n = 10 7,05 (5,58-8,02) 431,33 (397,30-574,55)* 28,0 (22,0-32,9)**
V. Saphena, n = 10 10,09 (8,05-12,13) 73,1 (62,8-81,8) 1,37 (0,89-1,75)
* — различия статистически значимы при сравнении с V . Saphena при р<0,05; ** различия статистически значимы при сравнении с V . Saphena при р<0,001.
Рис. 2.
Сосуды крысы: А — интактная аорта крысы;
Б — сосудистый графт, через 12 мес. после имплантации. УЗИ-допплерография
S3400 10.0kVx270 BSECOMP ........200um I S3400 15.0kVx170 BSECOMP ........ 300um
Рис. 3. Аорта крысы и сосудистые графты из ПГБВ/ПКЛ через 12 мес. после имплантации:
А — полностью проходимый графт; Б — пристеночный тромб в зоне анастомоза; В — гиперплазия соединительной
ткани в просвете графта; Г — воспалительная инфильтрация части стенки графта; Д, Е — интактная аорта крысы;
Ж — сосудистый графт; З — монослой эндотелиальных клеток на внутренней поверхности графта.
А—Д — световая микроскопия; Е—З — сканирующая электронная микроскопия.
Окр.: А, Г, Д — гематоксилин, эозин; Б, В, Е — по Ван Гизону; Ув.: А х50; Б, В х100; Г, Д х200
Результаты
морфологического исследования
по оригинальной методике
Исследование шлифов сосудистых графтов по оригинальной методике значимо дополнило морфологическую картину, полученную при гистологическом анализе. Толщина стенки эксплантирован-ных графтов составила, в среднем, 221,0 (215,5; 242,7) мкм . Графты были окружены наружной капсулой из соединительной ткани . В структуре графтов выявлены клетки разных типов, глубже просматривалась внутренняя соединительнотканная капсула, к которой примыкал пристеночный рекана-лизированный тромб, просвет графтов был сохранен (рис . 4 А, Б). Наружная капсула состояла из компактно и упорядоченно расположенных пучков волокон и фибробластоподобных клеток .
Слой соединительной ткани, прилегавший непосредственно к графту, включал преимущественно фиброциты . По периферии графты сопровождали мелкие сосуды, схожие по строению и локализации с vasa vasorum (рис . 4 В, Г).
На внешней границе графтов располагался слой гигантских многоядерных клеток (рис . 4 Д, Е) . На образцах, подготовленных для светооптической микроскопии, цитоплазма этих клеток была окрашена в светло-синий цвет, а ядра — в интенсивно синий. Однако на препаратах для электронной микроскопии последние были менее контрастны Многоядерные клетки либо плотно контактировали между собой, либо между ними находились клетки меньшего размера
Глубже слоя многоядерных клеток располагался плотный слой фуксинофильного материала — внеклеточного матрикса, образованного мигрировавшими в толщу стенки графтов клетками, и окружающего остатки полимерных нитей, которые выглядели как неокрашенные округлые участки
Толща стенки графтов была пронизана волокнистыми тяжами и инфильтрирована клетками нескольких типов (рис . 4 Ж, З). По морфологическим характеристикам их можно отнести к фибробласто-подобным клеткам разной степени зрелости, макрофагам, эпителиоидным и плазматическим клеткам . Встречались клетки с вакуолизированной «пенистой» цитоплазмой .
Рис. 4. Сосудистый графт: А, Б — общая структура графта; В, Г — vasa vasorum на границе графта (1) и соединительнотканная капсула (2); Д, Е — волокнистая соединительная ткань (2), гигантские многоядерные клетки (2), гранулярный материал (3), фуксинофильный материал (4). А, В, Д, Ж, З — световая микроскопия; Б, Г, Е — сканирующая электронная микроскопия шлифов образцов, заключенных в эпоксидную смолу. Окр.: А, В, Д, Ж, З - по Ван Гизону. Ув.: А, Ж х10; В, Д, З х200
Обсуждение
Использование биосовместимых и биодегради-руемых полимеров в качестве основы для создания сосудистого протеза малого диаметра на сегодняшний день является наиболее перспективным [8]. Однако у каждого из полимеров есть свои достоинства и недостатки . Комбинация полимеров способна нивелировать недостатки каждого отдельно взятого полимера, тем самым меняя свойства конечного изделия и сроки его резорбции. Известно, что ПГБВ относится к группе природных полимеров — полиги-дроксиалканоатов, синтезируемых микроорганизмами, основной компонент продуктов биодеградации которых — мономер р-гидроксимасляной кислоты — естественный компонент обмена веществ, в норме присутствующий в крови и тканях организма, что и обуславливает высокую биосовместимость данного полимера [19]. В наших экспериментах введение ПГБВ в раствор поликапролактона способствовало значительному повышению биосовместимости создаваемых конструкций [20].
Спустя 12 мес . после имплантации ПГБВ/ПКЛ-графтов в брюшную часть аорты крыс было отмечено наличие большого количества фибробласто-подобных клеток, которые заполнили толщу стенок
графтов Благодаря высокопористой структуре стенок графтов и наличию открытых (не запаянных) пор, клетки смогли мигрировать в средние слои стенок графтов и синтезировать там собственный ВКМ . Доказанная нами ранее высокая биосовместимость композиции ПГБВ/ПКЛ [20] способствовала поддержанию жизнеспособности клеток на протяжении всего срока имплантации
Внутренняя поверхность трубчатых полимерных каркасов, использованных в данных экспериментах, не подвергалась никаким видам модификации для привлечения эндотелиальных клеток Однако эндоте-лизация произошла у 25% графтов . Это доказывает, что архитектоника внутренней поверхности графтов на основе ПГБВ/ПКЛ имитирует структуру ВКМ и пригодна для формирования эндотелиального монослоя Чтобы достигнуть 100% эндотелизации графтов, последующие эксперименты будут направлены на модификацию его внутренней поверхности биологически активными молекулами, способствующими привлечению из кровотока прогениторных эндотелиальных клеток с целью формирования в короткие сроки полноценного эндотелиального монослоя
В ходе биорезорбции трубчатых каркасов было обнаружено их постепенное замещение собственными
клетками организма, что свидетельствует не только о высокой биосовместимости полимеров, на основе которых изготовлены графты, но и о пригодности данных матриксов выступать в качестве полноценной основы для любого вида тканеинженерных конструкций
Предлагаемая оригинальная методика дополнительного морфологического исследования графтов позволила выявить сопряженные процессы ремоде-лирования сосудистого протеза: деградацию полимера и прорастание графта грануляционной тканью, богатой клетками гистиогенного и гематогенного происхождения . Биодеградация полимерных графтов в организме осуществляется макрофагами, поэтому в стенке ПГБВ/ПКЛ-графтов появлялись «пенистые» клетки, цитоплазма которых нагружена продуктами деградации Присутствие в инфильтрате разного типа клеток макрофагальной популяции (макрофагов, эпителиоидных и гигантских многоядерных клеток), обладающих различной фагоцитарной и цитокинпро-дуцирующей активностью, в конечном итоге обеспечивает сбалансированность протекающих процессов. Инфильтрирующие толщу имплантов фибробласты продуцировали межклеточное вещество, создавая естественный внеклеточный матрикс на месте полимерного каркаса . Присутствие клеток фибробластиче-ского дифферона различной степени зрелости свидетельствовало об их активной пролиферации
Заключение
Созданный на основе ПГБВ/ПКЛ трубчатый матрикс обладал высокой пористостью, что обеспе-
чило его более высокую растяжимость по сравнению с венами человека Каркас на основе ПГБВ/ ПКЛ, выполненный методом электроспиннинга, может выступать в качестве самостоятельной тка-неинженерной конструкции без дополнительного усовершенствования размера пор и диаметра нитей, так как в полной мере способствует миграции клеток в толщу стенки и поддерживает жизнеспособность клеток и их пролиферацию Долгосрочная проходимость графтов и результаты гистологического анализа подтвердили пригодность созданной трубчатой полимерной конструкции выступить в качестве основы для создания различных вариантов гибридных сосудистых графтов малого диаметра Использование оригинальной методики морфологического исследования, разработанной сотрудниками НИИ КПССЗ (параллельная визуализация строения образцов, заключенных в смолу, методами оптической и электронной микроскопии без предварительной подготовки срезов) привело к более точной оценке структуры полимерных графтов на основе ПГБВ/ПКЛ и степени их интеграции с окружающими клетками и тканями организма
Благодарности
Исследование выполнено за счет средств гранта Российского научного фонда (проект № 14-25-00050) в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний».
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бокерия Л .А ., Беришвили И . И ., Солнышков Л . Э . и др . Повторные операции у больных ишемической болезнью сердца — современное состояние проблемы . Бюллетень НЦССХ им . Бакулева РАМН 2009; 10 (3): 5-27 .
2 . Catto V ., Fare S . , Freddi G . et al . Vascular tissue engineering: recent advances in small diameter blood vessel regeneration . iSRN Vasc. Med . 2014; Article ID 923030: 1-27 .
3 . Patel H ., Bonde M . , Srinivasan G . Biodegradable Polymer Scaffold for Tissue Engineering . Trends Biomater . Artif . Organs 2011; 25(1): 20-9 .
4 . Lyons J . L ., Li C ., Ko F . Melt-electrospinning part I: processing parameters and geometric properties . Polymer 2004; 45(22): 7597-603 .
5 . Rosic R ., Pelipenko J ., Kocbek P . et al . The role of rheology of polymer solutions in predicting nanofiber formation by electrospinning . Eurор . Polymer J . 2012; 48(8): 1374-84.
6 . Agarwal S . , Wendorff J . H . , Greiner A . Use of electrospinning technique for biomedical applications . Polym . 2008; (49): 5603-21
7 . Neto W .A . R ., Pereira I . H . L ., Ayres E . et al . Influence of the microstructure and mechanical strength of nanofibers of biodegradable polymers with hydroxyapatite in stem cells growth . Electrospinning, characterization and cell viability . Polymer Degradation and Stability 2012; 97(10): 2037-51.
8 . Hasan A . , Memic A ., Annabi N . et al . Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts . Acta Biomater . 2014; (10): 11-25 .
9 . Shum-Tim D ., Stock U ., Hrkach J . Tissue engineering of autologous aorta using a new biodegradable polymer . Ann . Thor . Surg . 1999; 68(6): 2298-305
10 . de Valence S ., Tille J . , Mugnai D . Long termperformance of polycaprolactone vascular grafts in a rat abdominal aorta replacementmodel . Biomaterials 2012; 33(1): 38-47 .
11. de Valence S ., Title J . C ., Giliberto J . P . Advantages of bilayered vascular grafts for surgical applicability and tissue regeneration . Acta Biomaterilia 2012; 8(11): 3914-20 .
12 . Kuwabara F ., Narita Y . , Yamawaki-Ogata A . Long-term results of tissue-engineered small-caliber vascular grafts in a rat carotid arterial replacementmodel . J . Artif . Org . 2012; 15(4): 399-405 .
13 . Iwasaki K ., Kojima K ., Kodama S . Bioengineered three-layered robust and elastic artery using hemodynamicallyequivalent pulsatile bioreactor . Circulation 2008; 118(14 Suppl): S52-7 .
14 . Wu W ., Allen R . A ., Wang Y . Fast-degrading elastomer enables rapid remodeling of a cell-free synthetic graft into a neoartery . Nat . Med . 2012; 18(7): 1148-53 .
15 . Roh J . D ., Nelson G . N ., Brennan M . P . Small-diameter biodegradable scaffolds for functional vascular tissue engineering in the mouse model . Biomaterials 2008; 29(10): 1454-63 .
16 . Pektok E ., Nottelet B ., Tille J . Degradation and healing characteristics of small-diameter poly(s-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation . Circulation 2008; 118(24): 2563-70 .
17 . Попова И . В ., Степанова А . О . , Плотникова Т .А . и соавт. Изучение проходимости сосудистого протеза, изготовленного методом электроспиннинга . Ангиология и сердечно-сосудистая хирургия 2015; 21(2): 136-41.
18 . Мухамадияров Р .А ., Севостьянова В . В . , Головкин А. С . и др . Способ изготовления образцов биологических тканей в комплексе с имплантированными элементами для исследования световой микроскопией . Патент РФ 2564895 . 10 . 10 . 2015 .
19 . Шишацкая Е . И . Клеточные матриксы из резорбируемых полигидроксиалканоатов Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007; II(2): 68-72 .
20 . Антонова Л . В . , Бураго А . В ., Матвеева В . Г . и др . Особенности биорезорбции клеточных и бесклеточных пленочных матриксов из полиоксиалканоатов и поликапролактона в условиях хронического долгосрочного эксперимента Фундаментальные исследования 2013; 7(1): 14-23 .
Поступила: 26.05.2015
