CC BY
56
© Н.Е. Афанасьев, 2007
УДК 616.72-002.77:579.252.55.001.2
РАЗРАБОТКА МАГНОИММУНОСОРБЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ
Н.Е. Афанасьев
Ставропольская государственная медицинская академия
Ведущая роль в патогенезе ревматоидного артрита (РА) принадлежит иммунокомплексному поражению с выраженными гуморальными и клеточными реакциями организма. Взаимодействие ревматоидного фактора с иммуноглобулинами приводит к образованию иммунных комплексов, патогенетическое значение которых настолько существенно, что РА часто называют болезнью иммунных комплексов. Считается, что именно циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) вызывают ряд цепных реакций, индуцирующих и поддерживающих воспаление, определяющих прогрессирующее течение ревматоидного артрита [14, 12].
В последние годы медицина обогатилась новыми методами исследований, в которых используются новейшие достижения биотехнологии, одним из которых является разработка и внедрение твердофазных носителей, в том числе различных сорбентов. Приобретение последними биоспецифических качеств достигается путем иммобилизации на поверхности или в структуре матрицы различных лигандов белковой природы. Новый этап усовершенствования матриц связан с включением в них магнитного материала [4,
15, 7, 13, 5].
Цель данных исследований - конструирование магнитоуправляемой твердофазной иммунохимичес-кой тест-системы для определения циркулирующих иммунных комплексов в иммуноферментном анализе при ревматоидном артрите.
Материал и методы. Магноиммуносорбенты (МИС) получали согласно разработкам [1], корректируя и оптимизируя параметры синтеза.
В качестве сорбционного материала использовали алюмосиликат (ТУ 38-10267-84), который представляет собой тонкодисперсный продукт, содержащий в своем составе двуокись кремния алюминия (насыпная плотность - 320 кг/м3; влажность при температуре 110о С (массовая доля) - 3,5 %; содержание SiO2 (массовая доля) - 85-89 %).
Биологическим сырьем служили ЦИК, выделен-
ные из крови больных РА в фазе обострения, процедура изолирования которых заключалась в осаждении ПЭГ-6000 по методике А.Ро^оп, G.M Potgieter, J.E.Largier [18] в нашей модификации, а также ги-периммунные сыворотки, полученные при иммунизации кроликов выделенными циркулирующими ИК по схеме, разработанной нами, с использованием иммунокорректора тимогена [2].
Активность ЦИК, иммунных сывороток, иммуноглобулинов определяли методом радиальной иммунодиффузии (РИД) по О.ОисЫейопу [17]. Ко-ньюгацию иммуноглобулинов, фракционированных из сывороток каприловой кислотой по G.Steibuch, R.Andran [19], с ферментом-пероксидазой хрена проводили по методу R.K.Nakane, A.Kawaoi [16], очистку коньюгата от несвязавшегося фермента осуществляли гель - фильтрацией с использованием сефадекса G -100 на хроматографической установке «МшсоШ1аЬ» (ЬКВ, Швеция).
Количественное определение белка проводили по методу О^агЬш£, W.Christian [20] сравнением поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46.
Результаты и обсуждение. В современной биотехнологии широко используются различные материалы, область применения которых определяется их свойствами по отношению к клеткам и биомолекулам с определенной структурой. Среди пористых матриц особое место принадлежит высокодисперсным кремнеземам, которые представляют собой обработанную специальным образом двуокись кремния - SiO2.
Кремнеземам присущ целый комплекс свойств, которые позволяют широко использовать их в биотехнологии, медицине, фармации, сельском хозяйстве, а также в лабораторной практике: они имеют низкую токсичность, практически не содержат примесей, обладают большой удельной поверхностью, имеющей гидроксильный покров и способной к замещению гидроксильных групп функционально активными, малые размеры частиц, высокие сорбционные свойства, устойчивость к воздействию температуры (выдержи-
Таблица
Структурные характеристики МС в зависимости от количества Fe2O3 и времени гелеобразования
Массовое соотношение компонентов синтеза Время гелеобразования, ч Удельная поверхность, м2/г Объем пор, см3/г Радиус пор, нм
А1 - SiO2 декстран ^203
2,5 2,5 0,5 2 26 1,24 95,4
8 28 1,24 93,2
2,5 2,5 1,0 2 25 1,23 98,0
8 29 1,23 95,7
2,5 2,5 1,5 2 24 1,22 101,6
8 32 1,22 99,7
2,5 2,5 2,0 2 23 1,21 105,2
8 32,5 1,21 99,8
2,5 2,5 2,5 2 19 1,20 126,3
8 33,7 1,20 101,6
2,5 2,5 5,0 2 18 1,19 132,2
вают нагрев до 200-300о С) и ультрафиолетовых лучей [6, 8, 11].
Используя известные принципы получения композиционных органокремнеземных сорбентов, нами впервые разработана тест-система магноиммуносор-бентная для определения ЦИК при ревматоидном артрите.
Химическое модифицирование поверхности сорбента осуществляли в присутствии полимера декстра-на (полиглюкина) и поверхностно-активного вещества (ПАВ)- вторичного алкилсульфата натрия.
Механизм образования пористого кремнийорга-нического магносорбента в присутствии полиглюки-на сопровождался формированием корпускулярной структуры кремнеземного скелета из непористых частиц кремнезема и включением в данный остов полимера (декстрана) за счет многоточечной адсорбции на катионообменных центрах поверности кремнеземного носителя.
Для активирования твердофазного носителя мы использовали ПАВ - вторичный алкилсульфат натрия, образующий на поверхности частиц матрицы моно-молекулярный адсорбционный слой, препятствующий сближению частиц, их агрегированию и образованию пространственных структур.
Процесс получения магносорбента (МС) осуществляли следующим образом: к 1 г алюмосиликат-ного наполнителя добавляли 40 мл 3 % водного раствора полиглюкина и магнитный порошок ^е203) от 1 до 5 г, перемешивали и проводили гелеобразование при температуре (22±4)° С в течение 2 часов. Значение рН гелеобразования составляло 7,0. Полученный сорбент высушивали при 100-110о С в течение 30 мин, измельчали и методом рассева выделяли фракции с размером частиц 80-120 микрон.
Для оптимизации структурных характеристик МС проведены исследования по варьированию соотношения компонентов синтеза (алюмосиликат, по-лиглюкин, Fe2O3), а также изучено влияние времени гелеобразования и рН среды на величину удельной поверхности сорбентов, объем и размер пор.
Удельную поверхность МС определяли по методу А.А. Клячко-Гурвича [10], а суммарный объем и радиус пор - по методу Н.В. Кельцева [9].
Исследования показали, что увеличение количес-
тва магнитного порошка не приводит к резкому изменению структурных характеристик, удельной поверхности, сорбционному объему пор.
При увеличении продолжительности времени ге-леобразования при синтезе МС происходило увеличение значений удельной поверхности и уменьшение размера пор. Результаты исследований представлены в таблице.
На основе проведенных исследований рекомендованы следующие оптимальные условия получения алюмосиликатных МС: соотношение компонентов синтеза 1:1:2, соответственно алюмосиликат, де-кстран, Fe2O3; время гелеобразования 2 часа, значение рН гелеобразования - 7,0.
Алюмосиликатные магноиммуносорбенты представляют собой высокодисперсные микрогранулы неправильной формы с выраженными магнитными свойствами, обладающие хорошей смачиваемостью и эффективным оседанием в растворе, отсутствием склонности к конгломерации.
Для химического активирования МС использован вторичный алкилсульфат натрия. Оно заключалось в следующем: к 1 г МС приливали 7,5 мл дистиллированной воды, содержащей 0,25 мл ПАВ. Смесь инкубировали 1-2 часа при температуре (37±1^ С, затем сорбент отмывали 100 мл 0,9 % раствора хлорида натрия и 100 мл дистиллированной воды.
Далее проводили иммобилизацию МС специфическими лигандами, которыми служили иммуноглобулины из гипериммунных полигрупповых сывороток, преципитированные ПЭГ. Иммобилизацию лиганда проводили следующим образом: к 0,4 мл 10 % взвеси МС приливали 1 мл лиганда, варьируя количеством белка от 0,5 до 10 мг/мл, временем инкубации от 1 до 24 час и температурой - (4±1)о С, (22±1)о С, (37±1)о С.
Исследования показали, что концентрация белка лигандов 2,5-3 мг/мл является оптимальной для полного насыщения сорбента в объеме 0,4 мл 10 % взвеси МС. При использовании белка с концентрацией больше 2,5 мг/мл адсорбционная емкость МИС снижалась. При изучении кинетики процесса иммобилизации и оценке связывания белковых лигандов с сорбентом установлено, что для полного насыщения МС белком достаточно 2 часов при значении рН раствора белка
6-7 и температуре от 22 до 37о С.
Одним из факторов повышения чувствительности и специфичности иммуноферментного анализа (ИФА) является твердая фаза, а именно пористые носители. Не менее важный фактор - качество иммунофермен-тного коньюгата. Изготовленные нами иммунофер-ментные пероксидазные коньюгаты имели рабочую активность 1:800 - 1:1000.
Нами апробирован неконкурентный метод ИФА-«сэндвич»-вариант [3] с использованием магноимму-носорбентов для обнаружения ЦИК в сыворотках крови больных РА, определены оптимальные параметры постановки ИФА, чувствительность и специфичность метода, проведено сравнение модифицированного метода МИС+ИФА с методом постановки реакции в по-листироловых микроплатах. Время постановки ИФА с применением МИС составило 50-60 мин, а традиционным методом, учитывая 18 часовую сенсибилизацию микропланшетов - 20-21 час. При этом показания оптической плотности (ОП) сывороток крови у обследованных больных РА в активной фазе превышали величину ОП отрицательного контроля (сыворотки крови здоровых лиц) в 2-2,2 раза, что свидетельствовало о повышении содержания в крови ЦИК. Кроме того, при использовании МИС в ИФА для проведения реакции не требовались полистироловые планшеты, сокращалось время сенсибилизации твердой фазы в 15 раз, значительно увеличивался срок хранения сенсибилизированной твердой фазы от 20 дней до 1 года (срок наблюдения); время проведения собственно анализа сокращалось в 1,5 раза, с одновременным повышением чувствительности метода.
Выводы
1. Сконструированная магноиммуносорбентная тест-система позволяет повысить специфичность и чувствительность ИФА при выявлении ЦИК.
2. Определение циркулирующих иммунных комплексов сочетанным методом МИС+ИФА свидетельствует о возможности его использования в качестве дополнительного информативного теста оценки степени активности иммуновоспалительного процесса, а также для осуществления контроля эффективности проводимой терапии у больных РА.
Литература
1. Афанасьев, Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций (чума, бруцеллез, сибирская язва): Автореф. дис. ... /Е.Н. Афанасьев. - Ростов-на-Дону, 2000. - 45 с.
2. Афанасьев, Н.Е. Опыт получения гипериммунных сы-воро ток против иммунных комплексов, циркулирующих при ревматоидном артрите / Н.Е. Афанасьев, И.С. Тюменце ва // Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайная ситуация между народного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского Саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств» - Оболенск, 2006. - С. 177-178.
3. Дзантиев, Б.Б. Современное состояние и перспективы развития иммуноферментного анализа / Б.Б. Дзантиев, А.М. Егоров // Журн. Всесоюз. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева. - 1982. - Т. 27, № 4. - С. 82-89.
4. Ефременко, В.И. Магносорбенты в микробиологических
исследованиях / В.И. Ефременко. - Ставрополь: «Ставрополье», 1996. - 131 с.
5. Жарникова, И.В. Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей- Автореф. дис. ... / И.В. Жарникова. - Ставрополь, 2004. - 39 с.
6. Заугольников, С.Д. Экспрессные методы определения токсичности и опасности химических веществ / С.Д. Заугольников, М.Н. Коганов, О.А. Лойт, И.И. Ставчанс-кий. - М.: Медицина, 1978. - 184 с.
7. Зборовский, А.Б. Перспективы применения магнитосор-бентов в иммунодиагностике и лечении системной красной волчанки и ревматоидного артрита /А.Б. Зборовский, И.П. Готарь // Журн. «Клиническая медицина». - Том 79, №2. - 2002. - С. 42-45.
8. Картель, Н.Т. Новые критерии оценки свойств сорбентов медицинского назначения / Н.Т. Картель, Е.Д. Молюк, М.Е. Шор-Чудновский // IV Республ. конф. «Сорбенты медназначения ...». - Донецк, 1988. - С. 14-15.
9. Кельцев, Н.В. Основы адсорбционной техники / Н.В. Кельцев. - М: Химия,1984. - С. 280.
10. Клячко-Гурвич, А.А. Методы определения удельной поверхности / А.А. Клячко-Гурвич. - Из-во АН СССР.
- 1964. - № 10. - С. 1885.
11. Луцюк, Н.Б. Медико-биологические свойства полисорбов / Н.Б. Луцюк, А.А. Чуйко, В.И. Богомаз и др. //Кремнеземы в медицине и биологии. Сборник науч. трудов под ред. академика А.Н.Украины А.А.Чуйко. - Киев - Ставрополь, 1993. - С. 89-97.
12. Насонов, Е.Л. Почему необходима ранняя диагностика и лечение ревматоидного артрита? / Е.Л.Насонов // РМЖ.
- 2002. - Т. 10. - С. 1009-1012.
13. Покровский, В.И. Магнитоуправляемые сорбенты в клинике и диагностике инфекционных и ревматических заболеваний / В.И. Покровский, В.В. Малеев, В.И. Еф-ременко, А.Б. Зборовский, И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев, И.П. Гонтарь // Объединенный медицинский журнал. -2002. - №2 (3). - С. 51-53.
14. Салихов, И.Г Показатели гуморального и клеточного иммунитета у больных реавматоидным артритом / И.Г. Салихов, Н.А. Мифтахов, М.М. Мангушева // Казанский мед. журнал. - 1987. - Т. 68, №1. - С. 9-14.
15. Тюменцева, И.С. Научно-методические основы конструирования и усовершенствования производства диагностических тест-систем для выявления возбудителей особо опасных и других инфекций: Автореф. дис. ... / И.С. Тюменцева. - Саратов, 1996. - 57 с.
16. Nakane, P.K. Peroxidase-labelled antibody-a new method of conjugation /P.R. Nakane, A. Kawaoi // J. Histochem. Cyto-chem. -1974.- Vol. 22, N 4. - P. 506-508; 1084-1091.
17. Ouchterlony, O. Antigen-antibody reactions in gel / О. Ouchterlony // Arkiv for Kemi. Mineral. O Ged. - 1949.
- Vol. 26. - P. 507-515.
18. Polson, A. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of higth molecular weigh /A. Polson, G.M. Potgieter, J.E. Largier // Biochem. Biophis. Acta. - 1964. - Vol. 82. - P. 463-475.
19. Steibuch, G. The isolation of IgG from imanalion serra with the acid of caprilic / G. Steibuch, R. Andran // Arch. Of Bio chem. Stray and Biophys. - 1969. - Vol. 139. - P. 279-284.
20. Warburg, O. Isolierung und Kristallisati - on des Garugs ter-ments Enolas / О. Warburg, W. Christian // Biochenm. Z.
- 1941. - Vol. 310. - P. 384-421.
РАЗРАБОТКА МАГНОИММУНОСОРБЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ИММУННЫХ КОМПЛЕКСОВ У БОЛЬНЫХ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ
Н.Е. АФАНАСЬЕВ
В задачу настоящего исследования входило конструирование магноиммуносорбентной тест-системы для определения циркулирующих иммунных комплексов у ревматоидных больных в ИФА. Используя известные принципы получения композиционных органокремнеземных сорбентов, разработана тест-система, позволяющая определять ЦИК в ИФА с предварительным концентрированием их на магноиммуносорбенте, что позволяет использовать новый иммунологический тест в качестве дополнительного для оценки степени активности иммунологического процесса, а также для осуществления контроля эффективности проводимой терапии у больных РА.
Ключевые слова: ревматоидный артрит, циркулирующие иммунные комплексы, магноиммуносорбент, иммуно-ферментный анализ
DEVELOPMENT
OF MAGNETOIMMUNOSORBENT
TEST-SYSTEM FOR CIRCULATING IMMUNE
COMPLEXES DETECTION IN PATIENTS
WITH RHEUMATOID ARTHRITIS
AFANASYEV N. E.
The aim of the present research was designing of magnetoimmunosorbent test-system for detection of circulating immune complexes (CIC) within immune-enzyme assay in rheumatoid arthritis (RA) patients. Using well-known principles of compositional organosiliceous sorbents preparation, authors developed the test-system allowing to determine CIC by prior concentration on magnetoimmunosorbent in ELISA. Besides, new immunologic test can be used for estimation of the immune process activity and RA treatment efficiency.
Key words: rheumatoid arthritis, circulating immune complexes, magnetoimmunosorbent, immune-enzyme assay
