Научная статья на тему 'Аффинные сорбенты для экспресс-диагностики заболеваний'

Аффинные сорбенты для экспресс-диагностики заболеваний Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
446
98
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
АНТИГЕН / АНТИТЕЛО / АФФИННЫЙ СОРБЕНТ / ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА / ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ / СПЕЦИФИЧНОСТЬ / ANTIGEN / ANTIBODY / AFFINE SORBENT / EXPRESS DIAGNOSING / SENSITIVITY / SPECIFICITY

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Алиева Е. В., Тюменцева И. С., Афанасьев Е. Н., Афанасьев Н. Е., Лаврешин М. П.

На основе кремнезёма-алюмосиликата, модифицированного полиглюкином и вторичным алкилсульфатом натрия, получены аффинные композиционные микрогранулированные сорбенты с магнитными свойствами, которые имеют высокую адсорбционную активность за счёт развитой поверхности и привитого специфического лиганда, характеризуются стандартностью структурных характеристик, обладают механической прочностью, химической и микробиологической устойчивостью, присутствие магнитного материала обеспечивает упрощение и удобства манипуляций с сорбентами при проведении анализов. Применение МИС позволяет на этапе подготовки пробы путём многократных промываний сорбента с фиксированным на нём инфекционным агентом освобождаться от всевозможных примесей, тем самым исключая их отрицательное влияние на реакцию, максимально концентрируя искомый патоген, что повышает специфичность и чувствительность методов экспресс-анализа, при этом значительно сокращается время проведения анализов в 1,5-2 раза (до 1-3 часов).

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Алиева Е. В., Тюменцева И. С., Афанасьев Е. Н., Афанасьев Н. Е., Лаврешин М. П.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Affine sorbents for express diagnosing diseases

Affine composite microgranular sorbents with magnetic properties, which were obtained on the basis of aluminosilicate and modified with polyglucinum and secondary sodium alkylsulphate, show high adsorption activity owing to the advanced surface and the presence of specific ligands; they are characterized by standard structural characteristics, and show mechanical strength, as well as chemical and microbiological stability; the presence of magnetic material provides simplification and convenience of manipulations with sorbents while carrying out analyses. The application of MIS allows getting rid of every possible impurity at the stage of preparation of samples by the repeated washings of the sorbent with an infectious agent fixed on its surface, thus excluding their negative influence on the test, concentrating the sought-for pathogen to the limit, that increases the specificity and sensitivity of the express methods, and the time necessary for performing the test becomes considerably (1.5 times) shorter (less to 1-3 hours).

Текст научной работы на тему «Аффинные сорбенты для экспресс-диагностики заболеваний»

УДК 577.344.107:616-078

АФФИННЫЕ СОРБЕНТЫ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ

© Алиева Е.В., Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Афанасьев Н.Е., Лаврешин М.П., Афанасьева Е.Е., Орлова Т.Н., Миронов А.Ю.

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора,

Ставрополь;

НИЦ Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова, Москва

На основе кремнезёма-алюмосиликата, модифицированного полиглюкином и вторичным алкилсульфа-том натрия, получены аффинные композиционные микрогранулированные сорбенты с магнитными свойствами, которые имеют высокую адсорбционную активность за счёт развитой поверхности и привитого специфического лиганда, характеризуются стандартностью структурных характеристик, обладают механической прочностью, химической и микробиологической устойчивостью, присутствие магнитного материала обеспечивает упрощение и удобства манипуляций с сорбентами при проведении анализов.

Применение МИС позволяет на этапе подготовки пробы путём многократных промываний сорбента с фиксированным на нём инфекционным агентом освобождаться от всевозможных примесей, тем самым исключая их отрицательное влияние на реакцию, максимально концентрируя искомый патоген, что повышает специфичность и чувствительность методов экспресс-анализа, при этом значительно сокращается время проведения анализов в 1,5-2 раза (до 1-3 часов).

Ключевые слова: антиген, антитело, аффинный сорбент, экспресс-диагностика, чувствительность, специфичность.

AFFINE SORBENTS FOR EXPRESS DIAGNOSING DISEASES Alieva E.V., Tyumentseva I.S., Afanasiev E.N., Afanasiev N.E., Lavreshin N.P., Afanasieva E.E., Orlova T.N.,

Mironov A. Yu.

Stavropol Scientific-Research Anti-Plague Institute of Rospotrebnadzor, Stavropol;

Scientific-Research Center of the I.M. Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow

Affine composite microgranular sorbents with magnetic properties, which were obtained on the basis of alumi-nosilicate and modified with polyglucinum and secondary sodium alkylsulphate, show high adsorption activity owing to the advanced surface and the presence of specific ligands; they are characterized by standard structural characteristics, and show mechanical strength, as well as chemical and microbiological stability; the presence of magnetic material provides simplification and convenience of manipulations with sorbents while carrying out analyses.

The application of MIS allows getting rid of every possible impurity at the stage of preparation of samples by the repeated washings of the sorbent with an infectious agent fixed on its surface, thus excluding their negative influence on the test, concentrating the sought-for pathogen to the limit, that increases the specificity and sensitivity of the express methods, and the time necessary for performing the test becomes considerably (1.5 times) shorter (less to 1-3 hours).

Key words: antigen, antibody, affine sorbent, express diagnosing, sensitivity, specificity.

Развитие в течение последних десятилетий химии, биохимии, биотехнологии привело к разработке принципиально новых материалов - сорбентов для разделения и очистки биополимеров, матриц для их иммобилизации и т.п. Внедрение таких материалов в практику лабораторной диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний привело к значительному повышению качества лабораторного анализа, выражающегося как в увеличении чувствительности и специфичности методов, так и достоверности ре-

зультатов (положительных и отрицательных). В качестве сорбционного материала использовали различные вещества неорганической и органической природы: активированный

уголь, целлюлозу, полистерол, агарозные и полиакриламидные гели, хитин [4, 18, 19]. Особую нишу среди материалов, используемых для получения сорбентов, занимают кремнезёмы (пористые стекла, силикагель, силохромы, аэросил и т. п.) в силу того, что они имеют ряд преимуществ: физическую и химическую устойчивость, хорошо развитую

поверхность, на которой может находиться до 5 видов функционально активных групп (гидроксильные, силанольные, силоксановые, геминальные гидроксилы, вицинальные гидроксильные группы. Это позволяет проводить химическую модификацию поверхности

кремнезёма в заданном направлении [1, 2, 8, 9, 13, 15, 16, 17]. Разнообразие реакций химического модифицирования поверхности

кремнезёма и используемые при этом приёмы часто более напоминают химию органическую, чем неорганическую [20].

Введение в элементный состав кремнезёмных сорбентов оксидов металлов (А1, N1, Со, Бе) придает им дополнительные свойства: на сорбирующей поверхности образуются электронно-акцепторные (Льюисовские) и протонодонорные (Бренстедоновские) центры (Танабе), а сами сорбенты приобретают магнитные свойства, что значительно упрощает манипуляции с ними.

Цель исследования - получение аффинных сорбентов с магнитными свойствами на основе прочной, технологичной неорганической матрицы для использования в экспресс-диагностике различных заболеваний инфекционной и неинфекционной природы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследованы пробы из объектов внешней среды: 3982 особи иксодовых клещей, 772 особи орнитофильных комаров, 1920 проб воды, корма, пищевых продуктов, смывов с различных объектов, 931 проба от животных и птиц (домашних и диких), сыворотки крови от 1214 лихорадящих больных, 139 больных ревматоидным артритом и 114 больных спаечной болезнью.

Пробы исследовали в "сэндвич"-варианте иммуноферментного анализа (ИФА), а также полимеразно-цепной реакции (ПЦР) с соответствующими праймерами согласно инструкции по применению тест-систем.

Удельную поверхность МС определяли по методу [7], а суммарный объём и радиус пор

- по методу [6]. Концентрацию аминогрупп органокремнезёмного сорбента определяли по методу [3].

Микроструктуру сорбентов исследовали на сканирующем элетронном устройстве ГМ2-Т3000 по методике [14].

В работе применяли метод фракционирования белков (1^ класса О) с использованием высокомолекулярного нейтрального водорастворимого полимера - полиэтиленгликоля (ПЭГ) - 6000 [21].

Количественное определение белка проводили по методу [22] сравнением поглощения белков при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46. Математическую обработку результатов экспериментов осуществляли на ПЭВМ. Для подтверждения достоверности результатов, полученных при исследовании, применяли статистические методы [10, 11].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Синтез магносорбентов с высокой сорбционной активностью осуществлен методом формирования структуры носителя в присутствии органических полимеров.

В качестве сорбционного материала использовали алюмосиликат (ТУ 38-10276-84), который представляет собой тонкодисперсный продукт, содержащий в своем составе двуокись кремния алюминия.

Химическое модифицирование поверхности сорбента осуществляли в присутствии полимера декстрана (полиглюкина) и поверхностно-активного вещества (ПАВ) - вторичного алкилсульфата натрия.

Механизм образования пористого крем-нийорганического магносорбента в присутствии полиглюкина сопровождался формированием корпускулярной структуры кремнезёмного скелета из непористых частиц кремнезёма и включением в данный остов полимера (декстрана) за счёт многоточечной адсорбции на катионообменных центрах поверхности кремнезёмного носителя.

При активировании твёрдофазного носителя на поверхности его частиц образовывался мономолекулярный адсорбционный слой, препятствующий сближению частиц, их агрегированию и образованию пространственных структур. ПАВ, растворяясь в воде, образуют мицеллы, которые благодаря гидрофобности, связывают мономерные формы поверхностных белков. При этом образуются структуры,

напоминающие пчелиные соты. Они обеспечивают эффективное действие, намного превышающее эффективность исходных белков.

Процесс получения магносорбента (МС) осуществляли следующим образом: к 1 г алюмосиликатного наполнителя добавляли 40 мл 3% водного раствора полиглюкина и магнитный порошок (Бе203) от 1 до 5 г, перемешивали и проводили гелеобразование при температуре 22±4о С в течение 2 часов. рН гелеобразования составляло 7,0. Полученный сорбент высушивали при 100-110оС в течение 30 мин, измельчали и методом рассева выделяли фракции с размером частиц 80-120 мкм.

На стадии гидрогеля протекают конденсационные процессы с участием силановых групп частиц алюмосиликата, происходит перераспределение вещества, частицы укрупняются, контакты срастаются. Синерезис (самопроизвольное уменьшение объёма геля с отделением жидкости) происходит в результате уплотнения пространственной структуры сетки, образованной частицами дисперсной фазы. Структурированная система при синерезисе переходит в термодинамически более устойчивое состояние. При термообработке гидрогель превращается в ксерогель, при этом объём гидрогеля уменьшается более чем в 10 раз, благодаря действию капиллярных сил. Таким образом, ксерогель композиционного магносорбента - это корпускулярная система, состоящая из аморфных частиц кремнезема, покрытых органическим полимером (декстраном), связанных друг с другом в пространственном каркасе. При корпускулярном строении композиционных сорбционных материалов поры представляют собой пустоты между глобулами.

Для оптимизации структурных характеристик МС проведены исследования по варьированию состава компонентов синтеза

(алюмосиликат, полиглюкин, Бе203), а также изучено влияние времени гелеобразования и рН среды на величину удельной поверхности сорбентов, объём и размер пор.

Исследования показали, что увеличение количества магнитного порошка не приводило к резкому изменению структурных характеристик, удельной поверхности, сорбционного объёма пор. При увеличении продолжительности времени гелеобразования при синтезе МС происходило увеличение значений

удельной поверхности и уменьшение размера пор.

На основе проведенных исследований определены следующие оптимальные условия получения алюмосиликатных МС: соотношение компонентов синтеза 1:1:2, соответственно алюмосиликат, декстран, Бе203; время гелеобразования 2 часа, значение рН геле-образования - 7,0.

Исследование удельной поверхности показало, что сорбент, не содержащий в своем составе Бе203 имеет удельную поверхность -58 м2/г, объём пор - 1,70 см3/г, радиус пор -42,5 нм. Введение оксида железа в структуру кремнезёмного сорбента изменяло его структурные характеристики: удельная поверхность имела значение 18 м2/г, объём пор -

о

1,19 см /г, радиус пор - 132,2 нм.

В микроструктуре поверхности алюмоси-ликатного магноиммуносорбента сочетаются обширные участки сплошной непористой массы со структурой губчатого характера. По данным микроскопии, алюмосиликатный сорбент в своей структуре объединяет элементы структуры, характерные для макропористого стекла и гидротермального силохрома С-120. Магнитный порошок, входящий в состав структуры композиционного сорбента, усиливает срастание глобулярных частиц в сплошные непористые участки за счёт участия силанольных групп поверхности - Б1-0Н в дегидратационных процессах.

Для химического активирования МС использован вторичный алкилсульфат натрия. При активировании к 1 г МС приливали 7,5 мл дистиллированной воды, содержащей 0,25 мл ПАВ. Смесь инкубировали 1-2 часа при температуре 37±1оС, затем сорбент отмывали 100 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 100 мл дистиллированной воды.

Для придания магносорбенту биоспеци-фических свойств проводили иммобилизацию специфических белковых лигандов (антител или антигенов) методом ковалентного связывания: к 0,4 мл 10% взвеси МС приливали 1 мл лиганда, варьируя количеством белка от

0,5 до 10 мг/мл, временем инкубации от 1 до 24 час и температурой - 4оС, 22±2оС, 37±1оС.

Исследования показали, что концентрация белка лигандов 2,5-3 мг/мл является оптимальной для полного насыщения сорбента в объёме 0,4 мл 10% взвеси МС. При использо-

вании белка с концентрацией больше 2,5 мг/мл адсорбционная ёмкость МИС снижалась. При изучении кинетики процесса иммобилизации и оценке связывания белковых лигандов с сорбентом установлено, что для полного насыщения МС белком достаточно 2 часов при значении рН раствора белка 6-7 и температуре от 22 до 37оС.

Диагностическую ценность (специфичность и чувствительность) магноиммуносор-бентов (МИС) изучали в ИФА и ПЦР при исследовании биологического материала от людей, животных, проб из объектов внешней среды.

При исследовании объектов внешней среды (вода водоёмов, сточные воды, почва, смывы с рук работников, оборудования и инвентаря птицефабрик и перерабатывающих предприятий, пробы пищевых продуктов -всего 1085 проб сочетанным методом МИС+ИФА, возбудители кампилобактериоза и листериоза выявлены в 35%, что на 9,4% выше, чем в ИФА.

Полевые испытания разработанного сочетанного МИС+ИФА проведены при исследовании 1025 особей иксодовых клещей (90 пулов), являющихся основным резервуаром и переносчиком возбудителя клещевого борре-лиоза. Использование селективного концентрирования на магноиммуносорбенте дало возможность обнаружить возбудителя клещевого боррелиоза в 11 пробах, в то время как в ИФА без применения МИС выявлено 4 антигенсодержащих пробы. Таким образом, применение МИС позволило повысить выяв-ляемость инфекционного агента в среднем в 2,2 раза.

Использование селективного концентрирования на МИС дало возможность обнаружить АГ вируса лихорадки Западного Нила (ЛЗН) в 10 пробах из 83 пулов, составленных из 772 имаго орнитофильных комаров, в то время как в ИФА без применения МИС выявлено 4 положительные пробы, что повысило выявляемость патогена в 2,5 раза.

Методом ОТ-ПЦР подтверждено наличие рРНК возбудителя клещевого боррелиоза в 8 пробах суспензий клещей; сочетанным методом МИС+ОТ-ПЦР рРНК выявлена в 15 пробах, что повысило число положительных находок в 1,9 раза.

Применение ЛЗН-сорбента при проведении полимеразной цепной реакции повысило чувствительность ПЦР-анализа и выявляе-мость антигена ЛЗН в 1,8 раза.

Для оценки эффективности проводимой терапии спаечной болезни и ревматоидного артрита проведено комплексное обследование и лечение 114 больных, оперированных по поводу абдоминальной патологии, и 139 больных РА с давностью заболевания от 12 месяцев до 30 лет.

Результаты неконкурентного метода ИФА-"сендвич"-вариант с использованием МИС и конъюгата пероксидазного против глобулинов человека показали, что с увеличением времени, прошедшего с момента начала лечения, титр АТ к спаечному АГ в сыворотке крови уменьшался к 30 суткам и не превышал, как правило, 1:160-1:320. В контрольной группе пациентов (52 человека), которым лечение, направленное на предупреждение образования спаек не проводилось, на 45-90 сутки отмечено нарастание титров АТ к спаечному АГ с 1:80 до 1:3201:640, что свидетельствовало о прогрессивном развитии в брюшной полости спаечного процесса.

У обследованных больных РА в иммуно-ферментном анализе с привлечением имму-носорбционной технологии в активной фазе, по сравнению со здоровыми, выявлено повышение содержания в крови циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). Уровень циркулирующих ИК в конце стационарного лечения больных РА базисными препаратами, НПВП, ГКС или их сочетаниями практически не отличался от такового лечения. Существенное коррегирующее влияние на показатели ЦИК отмечены при включении в общую схему фармакотерапии РА эфферентной терапии в виде плазмафереза: уровень ЦИК в сыворотках крови таких больных после лечения снижался, как минимум, в 2 раза (по показателям оптической плотности).

Таким образом, на основе кремнезёма-алюмосиликата модифицированного по-лиглюкином и вторичным алкилсульфатом натрия, получены аффинные композиционные микрогранулированные сорбенты с магнитными свойствами, которые имеют высокую адсорбционную активность за счёт развитой поверхности и привитого специфиче-

ского лиганда, характеризуются стандартностью структурных характеристик (удельная поверхность, объём и размер пор), обладают механической прочностью, химической и микробиологической устойчивостью. Присутствие магнитного материала обеспечивает упрощение и удобства манипуляций с сорбентами при проведении анализов.

Применение МИС позволяет на этапе подготовки пробы путём многократных промываний сорбента с фиксированным на нём инфекционным агентом освобождаться от всевозможных примесей, тем самым исключая их отрицательное влияние на реакцию, максимально концентрируя искомый патоген, что повышает специфичность и чувствительность методов экспресс-анализа, при этом значительно сокращается время проведения анализов в 1,5-2 раза (до 1-3часов).

ЛИТЕРАТУРА

1. Айлер Р. Химия кремнезема. - М.: Мир, 1982. - 127 с.

2. Богатинский А.В., Давиденко Т.И., Чуен-ко А.В. Иммобилизация протеиназы Е и П на поверхности аминоорганокремнезёма // Украинский биохимический журнал. - 1979. -Т. 51, № 4. - С. 315-318.

3. Ворошилова О.И., Киселев А.В. Синтез и исследование кремнезёмных носителей с поверхностью, модифицированной аминопро-пилтриэтоксисиланом // Коллоидный Журнал. - 1980. - Т. 42, №. 2. - С. 223-229.

4. Закревский В.И. Иммуносорбенты и их применение в иммунологии микроорганизмов // ЖМЭИ. - 1980. - № 4. - С. 9-15.

5. Жакот Р.А., Корсакевич А.С. Иммобилизация ферментов на силикатных носителях // Успехи биологии и химии. - 1977. - Т. 18. -С.140-141

6. Кельцев Н.В. Основы адсорбционной техники.

- М.: Химия, 1984. - 280 с.

7. Клячко-Гурвич А.А. Методы определения удельной поверхности // Изд. АН СССР. -1961. - № 10. - С. 1885.

8. Лисичкин Г.Д. Достижения и перспективы химического модифицирования минеральных веществ // Журнал Всесоюзного химического общества им Д.И. Менделеева - 1989. - Т. 34, № 3 - С. 219-297.

9. Неймарк Н.Е. Синтетические минеральные адсорбенты и носители катализаторов. - Киев: Наукова Думка, 1982. - 210 с.

10. Скуч Д., Уэст Д. Основы аналитической химии. - М.: Мир, 1979. - Т. 1. - С. 71-73.

11. Тамбовцев Е.П., Ахметкалиев С.Г., Пятницкий Н.П. Методы статистической обработки результатов серологических реакций // Журнал микробиологии. - 1969. - № 10. -С. 26-31.

12. Танабэк К. Твёрдые кислоты и основания. -М.: Мир, 1973. - 180 с.

13. Филатова Т.Н., Гамзулина Л.Н., Замятина Т.А. Использование катионообменных сорбентов на основе силикагелей для выделения одного из железозависимых белков менингококков // Журнал микробиологии. - 1995. -№ 6. - С. 19-20.

14. Фрайфельдер Д. Физическая биохимия. - М.: Мир, 1980. - 73 с.

15. Ходж Ф. Органические реакции с использованием реагентов или субстратов, ковалентно закрепленных на функционализированных неорганических носителях // Журнал Всесоюзного Химического общества им. Д.И. Менделеева. - 1989. - Т. 34, № 3. - С. 331-339.

16. Хохлова Т.Д., Гаркавенко Л.Г., Никитин Ю.С. Адсорбция белков и ДНК на дегидроксилиро-ванных и алюминированных силохромах // Прикладная биохимия и микробиология. -М., Наука, 1991. - Т. 27, № 5. - С. 720-724.

17. Чуйко А.А., Горлов Ю.И. Строение поверхности пирогенного кремнезёма, природа его активных центров и механизмы сорбционных процессов // Кремнезёмы в медицине и биологии. Сб. научн. трудов. - Киев - Ставрополь, 1993. - С. 4-41.

18. Шаханина К.Л. Иммуносорбенты и их использование для выделения чистых антител // Биохимия и биофизика микроорганизмов. -1981. - Вып. 9. - С. 15-23.

19. Шаханина К.Л., Клеев Б.В., Федоров Ю.М. Приготовление различных иммуносорбентов и их использование для выделения антигенов и антител // Журнал вопросы медицинской химии. - 1976. - Т. XVII, Вып. 1. -С.127-136.

20. Burvwell R.L. Modified silica gels as adsorbents and catalysis // Chem. Technol. - 1974. -Vol. 15, N 1. - Р. 370-377.

21. Polson A., Potgieter G.M., Largier J.E. et al. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of higth molecular weigh // Biochem. Bio-phis. Acta. - 1964. - Vol. 82. - P. 464-475.

22. Warburg O., Christian W. Isolierung und Kristal-lisation des Garugsterments Enolase // Biochem. Z. - 1941. - Vol. 310. - P. 384-421.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.