РАЗРАБОТКА КОНКУРЕНТНОГО ВАРИАНТА ИФА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГРИППА ПОДТИПА Н5 У РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ПТИЦ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

Литература

1. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина М.: ВНИТИБП, 1998. С. 672-683.

2. Генетическая характеристика полевых изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных в России / Е. В. Овчинникова, Ю. А. Бочков, Г В. Батченко [и др.] // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. Т. 5. Владимир, 2007. С. 303-317.

3. Изучение спектра полевых изолятов вируса инфекционного бронхита кур в России с использованием молекулярно-биологических и серологических методов / А.В. Борисов, Ю.А. Бочков, С.В. Фролов [и др.] // Птицеводство - мировой и отечественный опыт: матер. конф. М., 2002. С. 23-24.

4. Условия получения трахеальной органной культуры куриных эмбрионов для выделения и ти-пирования вируса инфекционного бронхита кур / О. А. Чупина, С. В. Фролов, В. И. Диев [и др.] // Сибирская язва и др. опасные инфекц. болезни жив-х: матер. по теме работы круглого стола, приуроченного к 80-летию академика РАСХН Бакулова И. А. Покров, 2005. С. 225-227.

5. Филогенетический анализ изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных в России / Ю.А. Бочков, А.В. Борисов, Л.О. Щербакова [и

др.] // Аграрная Россия. 2002. №2. С. 11-16.

6. Coronaviruses from pheasants (Phasianus colchi-cus) are genetically closely related to coronaviruses of domestic fowl (infectious bronchitis virus) and turkeys / Cavanagh D., Mawditt K., Welchman D. de V[et al.] // Avian Pathol. 2002. Vol. 31, № 1. Р. 81-95.

7. Differentiation of avian infectious bronchitis virus field isolates in Russia using molecular-biological and serological methods / Y. Botchkov, A. Borisov, V Irza [et al.] // 11th European Poultry Conference: Bremen, Germany. 6-10 Sept. Bremen, Germany, 2002. P. 176.

8. Lee, C.W Typing of field isolates of infectious bronchitis virus based on the sequence of the hypervariable region in the S1 gene / C.W Lee, D.A. Hilt, M.W Jackwood // J. Vet. Diagn. Invest. 2003. Vol.15, N 4. P.344-348.

9. Liu, S. New genotype of nephropathogenic infectious bronchitis virus circulating in vaccinated and non-vaccinated flocks in China / S. Liu, X. Kong // Avian Pathol. 2004. Vol.33, N 3. P. 321-327.

10. Mondal, S.P. Isolation and characterization of a novel antigenic subtype of infectious bronchitis virus serotype DE 072 / S.I? Mondal, B. Lucio-Martinez, S.A. Nagi // Avian Dis. 2001. Vol. 45, N 4. P. 1054-1059.

УДК 619:616.98:587.832.1:598.2:573.6.086.83:57.083.3

М.А. Циванюк, Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгни, Е.В. Белик

РАЗРАБОТКА КОНКУРЕНТНОГО ВАРИАНТА ИФА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГРИППА ПОДТИПА Н5 У РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ПТИЦ

Введение

Грипп птиц (ГП) - острая контагиозная вирусная инфекция домашних и диких птиц, характеризующаяся общим угнетением, отеками, множественными кровоизлияниями и поражениями внутренних органов, мозга и кожи. Вирусы гриппа имеют сегментированную одиночную отрицательно закрученную цепочку РНК и относятся к семейству ОтЬкошухоутйае. Вирусы гриппа типа А разделены на подтипы, основанные на антигенном родстве поверхностных гликопротеинов, гемагглютини-на (НА) и нейраминидазы (НА). В настоящее время существует 16 НА подтипов (Н1-Н16) и девять подтипов №А (№-N9). До настоящего времени только вирусы подтипов Н5 и Н7 вызывали высокопатогенный грипп птиц (ВПГП) у восприимчивых видов [6].

За последние 10 лет не только увели-

чилось количество вспышек ВПГП, но и число вовлеченных птиц, а также материальные затраты на борьбу с заболеванием. Кроме того, беспрецедентное появление и распространение высокопатогенного вируса ГП Н5№1 в России и за ее пределами выдвинуло ГП на первое место среди опасных болезней животных [6].

Существует несколько методов для выявления подтипоспецифических антител к вирусу ГП. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) является «золотым стандартом» при диагностике гриппа, но при исследовании сывороток крови уток и некоторых других видов птиц антитела могут не выявляться из-за действия неспецифических ингибиторов, для устранения которых сыворотки необходимо подвергать обработке, снижающей уровень специфических антител [1]. Наиболее достоверные результаты по титро-

ванию антител дает реакция нейтрализации. К тому же она позволяет обнаруживать вируснейтрализующие антитела, которые непосредственно создают в организме защиту против вирусов [3]. Данный метод требует для постановки значительного времени и специализированного оснащения лаборатории при работе с высокопатогенным вирусом ГП подтипа H5N1. Всех этих недостатков лишен конкурентный вариант ИФА.

Зарубежная фирма «Anigen» (Корея) выпускает коммерческие иммунофермент-ные наборы для выявления антител к вирусу ГП подтипа Н5, но их массовое применение ограничено высокой стоимостью [2, 4].

Поэтому, в связи с ситуацией по гриппу, сложившейся в Российской Федерации в 2005-2006 г.г., и проводившимися мероприятиями по ограниченной вакцинации домашней птицы в зонах повышенного риска, актуальным является разработка высокочувствительной и специфичной отечественной тест-системы для выявления антител к вирусу ГП подтипа Н5 при проведении мониторинговых исследований и оценке уровня поствакцинального иммунитета у привитой птицы [5].

Таким образом, целью нашей работы была разработка отечественной тест-системы на основе конкурентного варианта ИФА для выявления антител к вирусу ГП подтипа Н5 при исследовании проб в одном разведении и сравнение полученной тест-системы с РТГА.

Материалы и методы

Антиген вируса гриппа птиц подтипа Н5И1. Очистку и концентрирование антигена вируса гриппа птиц подтипа H5N1, полученного в перевиваемой культуре клеток MDCK, проводили согласно ранее описанной методике [4].

Контрольные пробы. В качестве положительного контроля использовали сыворотку крови кур против вируса ГП (ФГУ «ВНИИЗЖ»); в качестве отрицательного - сыворотку крови птиц, не содержащую антител к вирусу ГП (ФГУ «ВНИИЗЖ»).

Конъюгат антивидовых антител. Использовали коммерческий препарат антивидового иммунопероксидазного конъ-югата против IgG мышей (ГУНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи, Москва).

Моноклональные антитела (МАт) к гемагглютинину Н5. Использовали МАт к гемагглютинину Н5, полученные из Института экспериментальной медицины (Москва).

Постановка конкурентного вариан-

та ИФА для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5. Во все лунки планшета, содержащие сенсибилизированный антиген вируса ГП подтипа Н5, вносили буфер ТБС (трис-HCl буферный раствор, содержащий 0,1% твина-20) в объёме 0,025 см3. В лунки А1-В1 вносили буфер ТБС (контроль моноклональных антител) в объёме 0,025 см3, в лунки C1-D1 (контроль конъюгата) - в объёме 0,075 см3. После этого наносили разведенные 1:2 в рабочем буфере ТБС контрольные и испытуемые пробы сывороток. Далее во все используемые лунки микропланшета вносили по 0,05 см3 рабочего разведения МАт (кроме контроля конъюгата). После 30 минутной инкубации при 37° С и трехкратной промывки раствором ТБС в каждую лунку заливали раствор антивидового перокси-дазного коньюгата, взятого в рабочем разведении. Планшеты инкубировали 30 минут при 37° С, трижды промывали ТБС и вносили для окрашивания субстрат АБТС (40 мМ 2,2-азино-ди(3-этил) бензтиазолин-сульфоновая кислота с 4 мМ Н2О2 в 100 мМ цитратном буфере) на 10-15 минут. Реакцию останавливали добавлением 1%-ного ДСН (додецил сульфат натрия), после чего измеряли оптическую плотность содержимого каждой лунки на спектрофотометре «SLT» (Австрия) при длине волны 405 нм. Значения ОП контрольных и исследуемых проб переводили в значение процента ин-гибиции (ПИ) по формуле:

_______ОП иссл.пробыс МАт ОП контроля конъюгата

ПИ=01]-^--О|| -(1 - )Х100'

контроля МАт контроля конъюгата

где: ОПиссллробЬ1 с мат - среднее значение оптической плотности смеси исследуемой пробы с моноклональными антителами к гемагглютинину Н5;

ОПконтроля МАт - среднее значение оптической плотности контроля моноклональных антител к гемагглютинину Н5;

ОПконтроля конъюгата - среднее значение оптической плотности контроля конъюгата.

Коммерческие наборы:

- Набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц в блокирующем варианте ИФА «AIV Ab ELISA», «Anigen» (Корея);

- «Набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации» (ФГУ «ВНИ-ИЗЖ»);

- референтные антигены и сыворотки к 15 ГА подтипам вируса ГП «Институт зоо-профилактики» (Италия);

- референтный антиген вируса ГП подтипа H5N9 «NVSL» (США).

Таблица 1

Комплексное исследование моноклональных антител к гемагглютинину Н5 вируса гриппа птиц

МАт Концентрация белка Вестерн-блоттинг РТГА Н-ИФА ВНИИЗЖ К-Н5-ИФА «Anigen» (Корея)

АГ Н5№ (ВНИИЗЖ) АГ raN9 (США)

8Д2 2 мг/мл + 1:512 >1:4096 1:12800* 91%**

11А9 2,8 мг/мл + 1:128 1:2048 1:6400 86%

15А6 2,4 мг\мл + 1:256 >1:4096 1:6400 90%

19С11 1,6 мг/мл + 1:64 1:1024 1:3200 51%

7Е6 н/и + >1:4096 н/и 1:25600 59%

17Н5 н/и + 1:1024 н/и 1:25600 82%

11В4 н/и + 1:128 н/и 1:6400 87%

* - проба считается положительной, если титр антител >1:1280;

** - проба считается положительной, если % блокирования составляет >75

1 2

Рис. 1. Иммуноблоттинг Аг Н5, х50 с МАт к ГА Н5 вируса ГП 19С11 (дорожка 1) и сывороткой против ГП подтипа Н5№ (дорожка 2)

Все наборы использовали согласно наставлениям по применению.

Компьютерный учет результатов. Учет результатов конкурентного варианта ИФА, обработку, хранение и анализ полученных данных проводили с использованием компьютерной программы «СИНКО-ИФА» (ФГУ «ВНИИЗЖ»).

Результаты и обсуждение

Разработка тест-системы включала в себя подбор моноклональных антител к Н5, определение рабочего разведения сывороток, МАт и конъюгата, а также установление позитивно-негативного порога.

Определение рабочих разведений МАт и антивидового конъюгата. Оптимальную концентрацию МАт и антивидового конъюгата определяли путём постановки

непрямого варианта ИФА методом двукратных последовательных разведений препаратов по блок-схеме («шахматный» порядок постановки). За рабочее разведение каждого из компонентов принимали последнее разведение каждого, обеспечивающее ОП=1,0 ед.

Подбор моноклональных антител к гемагглютинину Н5 вируса ГП. Из Института экспериментальной медицины (Москва) получили 7 образцов моноклональных антител к гемагглютинину Н5 вируса гриппа: 19С11, 15А6, 11А9, 8Д2, 6С8, 17Н5, 11В4. МАт исследовали в РТГА с применением коммерческого «Набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в реакции торможения гемагглютинации» (ФГУ «ВНИИЗЖ») и референтного антигена («NVSL», США) - в непрямом варианте ИФА с использованием АГ Н5 (ФГУ «ВНИИЗЖ») и конкурентном варианте ИФА с использованием коммерческого набора фирмы H5 Ab AIV «Anigen» (Корея), а также при проведении электрофореза и иммуноблоттинга. Результаты исследования в ИФА и РТГА с АГ H5N1 представлены в табл. 1.

Все образцы МАт получены к ГА Н5, что подтверждали проведением имму-ноблоттинга с АГ Н5.

Для разработки тест-системы на основе К-Н5-ИФА мы исследовали различные МАт с референтными сыворотками к 15 ГА подтипам производства «Института зоопрофилактики» (Италия). В табл. 2 представлены ПИ тестируемых референтных сывороток при исследовании с различными МАт.

Для разработки конкурентного варианта ИФА (К-Н5-ИФА) выбрали препарат 19С11, так как при его использовании все сыворотки Н5 ГА подтипа имели максимальные значения ПИ, а сыворотки остальных 14 ГА подтипов вируса ГП - минимальные.

Таблица 2

Исследование референтных сывороток к 15 гемагглютинирующим подтипам вируса гриппа птиц с использованием различных МАт

^^^^^МАт Сыворотаи^^^^ 19С11 8Д2 15А6 11А9 7Е6 17Н5 11В4

НШ1 19 8.7 17.8 15.6 -31.8 24.2 -7.9

Н2Ш 0.08 22.8 20.5 26.2 27.2 28.5 -11.1

Н3Ш 12 19.2 16.4 -1.7 8.6 16.4 -16.8

Н4Ш 8 17.7 11.5 18.4 -31 14.2 -3.9

Н5№ 94 68.6 69.5 75.8 50.4 77.2 46.9

Н5Ш 74 47.1 36.6 51.2 53.6 86.5 0.90

Н5Ш 84 51.5 54.3 90.4 36.9 99.9 82.4

Н5№ 87.5 84.2 81 61.5 79.3 86.6 11.5

Н6Ш 21 19 25.3 22.2 -47.7 28.5 -27.6

Н7№ 16.7 23.5 1.2 7 1.2 12.7 14.6

Н7Ш 17 18.2 8.4 22.2 1.1 19.3 28.4

Н7Ш 12 10.3 2.8 11.1 н/и н/и н/и

Н8Ж 8 29.2 21.1 27.4 -13.5 -9.9 -14.7

Н9Ш 10 5.6 20.9 13.8 6.1 7.5 7.2

Н10№ 6 13.7 19.4 95.5 6.8 25.5 31.3

Н1Ш9 18 4.7 6.8 5.6 -31.6 24.2 27.9

Ш2ГО 33 17.7 0.3 7.1 23.8 40.6 42.5

Н13№ 18 17.5 10.3 18.9 -45.1 30.2 3.4

Н14К5 23 17.1 22.5 35.2 -41.6 22.9 -0.3

Н15К9 27.8 17.4 7.9 7 31.2 20 -12.5

Таблица 3

Определение рабочего разведения сывороток для постановки в К-Н5-ИФА

№ Титр в РТ-ГА, 1о^2 Разведение

Цельное 1:2 1:4 1:8 1:16

1 < 1 2 8,61* 4,80 1,81 9,42 21,47

2 < 1 2 14,58 8,70 2,26 3,44 11,50

3 < 1 2 7,34 1,36 1,09 5,62 6,70

4 < 1 2 1,54 2,72 0,63 3,53 11,50

5 < 1 2 12,23 7,52 0,27 4,17 8,70

6 < 1 2 2,45 1,90 2,54 3,44 6,79

7 < 1 2 3,62 3,99 2,08 1,36 7,25

8 < 1 2 7,97 3,62 4,44 2,46 2,26

9 < 1 2 20,62 2,85 4,04 3,52 0,33

10 < 1 2 11,29 10,48 7,00 8,70 5,00

11 < 1 2 27,43 12,70 9,14 4,92 1,89

12 < 1 2 15,96 14,11 9,14 8,03 3,30

13 < 1 2 26,18 19,44 9,81 8,26 2,92

14 < 1 2 13,74 11,14 9,66 5,66 0,70

15 < 1 2 9,29 7,66 6,85 5,89 1,44

16 < 1 2 2,18 0,04 2,92 2,33 6,85

Среднее значение отрицательного контроля < 1:2 10,49 7,06 4,61 5,05 6,16

17 7 95,83 91,67 77,45 69,02 53,89

18 3 86,14 88,41 63,59 52,63 32,07

19 5 95,11 93,75 82,79 74,82 58,06

20 4 90,94 85,24 65,85 59,06 47,64

21 7 74,82 68,39 51,18 42,39 39,58

22 5 57,35 58,61 35,88 29,29 23,95

23 4 82,82 78,90 45,72 34,62 27,58

24 7 96,96 96,15 83,04 76,38 72,23

25 6 87,86 87,49 60,46 46,98 38,32

26 5 88,52 89,41 64,98 51,20 42,54

Среднее значение положительного контроля 5,3 85,64 83,80 63,09 53,64 43,59

* - ПИ

Рис. 2 Зависимость разницы средних значении ПИ положительного и отрицательного контролен от разведения сывороток

Определение рабочего разведения сывороток. Для определения оптимального разведения сывороток исследовали слабоположительные сыворотки крови кур, полученные на 13 сутки после иммунизации «Инактивированной эмульгированной вакцины против вируса гриппа птиц подтипа Н5» производства ОАО «Покровского завода биопрепаратов» и отрицательные сыворотки в разведениях 1:2, 1:4, 1:8 и 1:16. Эти же сыворотки исследовали в РТГА. Оптимальное рабочее разведение сывороток определяли по наибольшей разнице процента ингибиции между средним значением отрицательного контроля и средним значением положительного контроля (табл. 3).

Как показано в табл. 3 и на рис. 2 наибольшую разницу процентов ингибиции между средним значением отрицательного контроля и средним значением положительного контроля наблюдали в разведении 1:2. Данное разведение было выбрано рабочим.

Позитивно-негативный порог. Для проведения качественного анализа устанавливали позитивно-негативный порог (ПНП), для чего 678 проб сывороток кро-

ви от невакцинированных домашних кур, уток, гусей, индеек, диких перелетных птиц (уток, тетеревов, глухарей, вальдшнепов), предварительно тестированных в РТГА на наличие антител к вирусу ГП подтипа H5N1, исследовали в К-Н5-ИФА. Вычисляли процент ингибиции для каждой пробы, находили среднее значение ПИ и стандартное отклонение. Сумма ПИсред. и двух стандартных отклонений определяла верхнюю границу отрицательных значений ПИ, сумма ПИсред. и трех стандартных отклонений - нижнюю границу положительных значений, промежуточные значения считали сомнительными, то есть требующими подтверждения.

- отрицательные значения ПИ: менее 40%;

- сомнительные значения ПИ: 41-50%;

- положительные значения ПИ: 51% и выше.

Определение чувствительности и специфичности. Специфичность разработанной тест-системы на основе К-Н5-ИФА определяли с использованием панели, состоящей из референтных гомологичных сывороток к Н5 ГА подтипу, и гетерологичных сывороток к 14 ГА подтипам производства «Института зоопрофилактики» (Италия), а также сывороток к вирусам болезни Ньюкасла (НБ), синдрома снижения яй-ценоскости-76 (ССЯ-76), инфекционной бурсальной болезни (ИББ), пневмовиру-су птиц (ПВП) и Mycoplasma gallisepticum (МГ) производства ФГУ «ВНИИЗЖ».

Как видно из табл. 4, неспецифическая реакция со всеми гетерологичными сыворотками отсутствовала, так как их ПИ не превышал фоновый уровень (реакция с неиммунной сывороткой).

При проведении серомониторинга в К-Н5-ИФА и РТГА параллельно исследовали 244 сыворотки крови, принадлежащих 29

Специфичность тест-системы на основе К-Н5-ИФА

Таблица 4

№ Сыворотка против ПИ № Сыворотка против ПИ

1 вируса ГП подтипа Н5№(ВНИИЗЖ) 98 14 вируса ГП подтипа Н9К2 (Италия) 4

2 вируса ГП подтипа ШШ(Италия) 38 15 вируса ГП подтипа Н10Ш (Италия) 1

3 вируса ГП подтипа Н2Ш (Италия) 13 16 вируса ГП подтипа Н1Ш9 (Италия) 1

4 вируса ГП подтипа Н3К8 (Италия) 4 17 вируса ГП подтипа Н12К5 (Италия) 1

5 вируса ГП подтипа Н4К8 (Италия) -6 18 вируса ГП подтипа Н13№ (Италия) 6

6 вируса ГП подтипа Н5К2 (Италия) 76 19 вируса ГП подтипа Н14 N5 (Италия) -2

7 вируса ГП подтипа Н5Ш (Италия) 95 20 вируса ГП подтипа Н15№ (Италия) -4

8 вируса ГП подтипа Н5№ (Италия) 85 21 вируса НБ (ВНИИЗЖ) 8

9 вируса ГП подтипа Н6К2 (Италия) 37 22 вируса ССЯ-76 (ВНИИЗЖ) 3

10 вируса ГП подтипа Н7№ (Италия) 24 23 вируса ИББ (ВНИИЗЖ) 9

11 вируса ГП подтипа Н7Ш (Италия) 5 24 ПВП (ВНИИЗЖ) 11

12 вируса ГП подтипа Н7Ш (Италия) -4 25 МГ (ВНИИЗЖ) 18

13 вируса ГП подтипа Н8К4 (Италия) 2 26 нормальная сыворотка крови кур 13

* - число положительных к общему количеству исследуемых сывороток

Таблица 5

Сравнение результатов, полученных при исследовании сывороток крови дикой птицы с использованием РТГА и К-Н5-ИФА

№ Вид птицы К-Н5-ИФА РТГА № Вид птицы К-Н5-ИФА РТГА

1 Черноголовый хохотун 0/1* 0/1 16 Вальдшнеп 0/7 0/7

2 Шилохвость 0/14 1/14 17 Тетерев 0/16 0/16

3 Чирок-свистунок 1/15 1/15 18 Глухарь 0/3 0/3

4 Огарь 0/1 0/1 19 Рябчик 0/1 0/1

5 Широконоска 0/11 0/11 20 Гусь-белолоб 0/3 0/3

6 Чайка сизая 0/30 0/30 21 Лебедь 3/5 3/5

7 Грач 0/2 0/2 22 Голубь 0/30 0/30

8 Чирок-трескунок 1/9 1/9 23 Павлин 0/4 0/4

9 Кряква 1/29 0/29 24 Дрозд-рябинник 0/1 0/1

10 Лысуха 0/23 0/23 25 Голубь вяхирь 0/2 0/2

11 Красноголовый нырок 0/4 0/4 26 Голубь клинтух 0/1 0/1

12 Утка-свиязь 0/2 0/2 27 Фазан 0/2 0/2

13 Чибис 0/2 0/2 28 Ворона серая 1/10 1/10

14 Красноголовая чернеть 1/4 1/4 29 Чайка морская 1/5 1/5

15 Утка дикая 2/7 2/7 Всего: 11 / 244 11 / 244

Таблица 6

Сравнение результатов, полученных при исследовании сывороток крови домашней птицы с использованием РТГА и Н5-К-ИФА

Вид птиц К-Н5-ИФА РТГА

Куры 64/108* 76/108

Утки 41/212 31/212

Гуси 218/392 188/392

Индоутки 18/51 17/51

Всего 335/763 308/763

* - число положительных к общему количеству исследуемых сывороток

* - число положительных к общему количеству исследуемых сывороток

Таблица 7

Определение чувствительности и специфичности К-Н5-ИФА относительно РТГА

Вид птиц Относительная чувствительность, % Относительная специфичность, % Точность, %

Куры 84 100 89

Утки 100 94,5 95

Гуси 100 85 92

Индоутки 100 97 98

видам птиц (табл. 5).

Как представлено в табл. 5, общее количество положительных проб было одинаковым при использовании К-Н5-ИФА и РТГА.

Для подсчета относительной чувствительности и специфичности в К-Н5-ИФА и РТГА исследовали 763 сыворотки, принадлежащие индоуткам, уткам, гусям и курам с известным иммунным статусом. Результаты тестирования представлены в табл. 6.

Как показано в табл. 6 количество положительных проб, выявленных с использованием РТГА и Н5-К-ИФА, варьирует в зависимости от вида птиц.

Относительную чувствительность, спе-

цифичность и точность реакции определяли отдельно для каждого вида птиц. Результаты исследований представлены в табл. 7.

К-Н5-ИФА был более чувствителен по сравнению с РТГА при исследовании сывороток гусей, уток и индоуток, и менее чувствителен при исследовании сывороток крови кур.

Выводы

Тест-система на основе К-Н5-ИФА с использованием культурального антигена вируса ГП подтипа Н5№1 обладает высокой чувствительностью и специфичностью и может найти широкое применение в ветеринарной практике для серологической диагностики вируса ГП подтипа Н5.

РЕЗЮМЕ

Разработана иммуноферментная тест-система для количественного определения антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 при тестировании проб в одном разведении. Титр антител определяли по проценту ингибиции, измеренному в рабочем разведении исследуемых проб. Определили позитивно-негативный порог для более объективной оценки иммунного ответа. Специфичность и чувствительность метода сравнивали с реакцией торможения гемагглютинации. Разработанную тест-систему применяли при проведении мониторинговых исследований для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 у диких птиц и изучении поствакцинального иммунитета у домашних птиц. SUMMARY

An ELISA test-system was developed to quantify antibodies to avian influenza virus subtype H5 in samples tested in a single dilution. The antibody titre was determined according to the inhibition rate measured in a working dilution of tested samples. A positive-negative threshold for a more objective evaluation of the immune response was established. The specificity and sensitivity of the given method were compared with those of the hemagglutination inhibition test. The developed test-system was used for monitoring antibodies to avian influenza virus subtype H5 in wild birds and for studying the post-vaccination immunity in poultry.

Литература

1. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц / М.А. Циванюк, Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак [и / под ред. Б.У Келнека. М.: АКВАРИУМ БУК-, др.] // Тр. Федерального центра охраны здоровья 2003. 1232 с. животных Владимир, 2007. С. 144-155.

2. Международная агропромышленная выставка 5. Чвала И.А. Разработка диагностического набора «АГРОРУСЬ 2005». Круглый стол «Актуальные для определения уровня антител к вирусу гриппа проблемы промышленного птицеводства - грип- птиц в РТГА/ И.А.Чвала, М.А.Циванюк, Н.Н. Лупа птиц» / ЛЕНЭКСПО Вып 1. СПб, 2005, 14 с. говская [и др.] //3-й Международный ветеринар-

3. Троценко Н.И. Практикум по ветеринарной ви- ный конгресс по птицеводству. М.: 2007. С. 73-78. русологии / Троценко Н.И., Белоусова РВ., Пре- 6. Ямникова С.С. Стратегия и тактика борьбы с ображенская Э.А. // 2-е изд., перераб. и доп. М.: гриппом на различных этапах эпидемиологи-Колос, 1999. ческого процесса /С.С. Ямникова, О.Н. Виткова,

4. Циванюк М.А. Получение культурального вируса М.В Калмыков [и др.] //Ветеринарная медицина гриппа птиц подтипа H5N1 и его использование 87: мiжвiдомчий тематичн. наук. збiрник. Харыв,

в качестве антигена для серологических реакций 2006. С. 307-312.

УДК 619:616.98:587.832.1:598.2:573.6.086.83:57.083.3

М.А. Циванюк, Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, Е.В. Белик

НЕПРЯМОЙ ВАРИАНТ ИФА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГРИППА ПТИЦ ПРИ ТЕСТИРОВАНИИ ПРОБ В ОДНОМ РАЗВЕДЕНИИ

Введение

Грипп птиц (ГП) - инфекционная болезнь домашних, синантропных и диких птиц, которая проявляется в виде эпизоо-тий и может протекать как в тяжелой форме, так и бессимптомно. Возбудителем заболевания является РНК-содержащий вирус с сегментированным геномом семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus, типа А [5, 7, 11].

В настоящее время практически все страны столкнулись с проблемой распространения гриппа птиц, обусловливающей не только экономические потери, связанные с гибелью птицы, вынужденным убоем, затратами на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий, но и угрозу возникновения пандемии, которая может характеризоваться высокой смертностью,

социальными проблемами и громадным экономическим ущербом [2, 8, 12, 13].

Ретроспективная диагностика является основополагающим фактором для своевременной защиты поголовья от инфекционных заболеваний. Важную роль играют серологические методы, такие, как реакция диффузионной преципитации (РДП), реакция торможения гемагглютинации (РТГА), реакция нейтрализации (РН) и им-муноферментный анализ (ИФА), позволяющие не только обнаружить специфические антитела на ранних стадиях болезни, но и оценить иммунитет, полученный в результате вакцинации [10].

Непрямой вариант ИФА - высокочувствительный и специфичный метод, удобен для анализа больших количеств образцов малого объема в лабораториях с самым