CC BY-ND
16
64
апрель №4 (325)
© Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Курчева С.А., Жарникова И.В., Жданова Е.В., Семирчева А.А., Кошкидько А.Г., 2020
УДК 579.61:616-078
Разработка иммунодиагностических препаратов для детекции возбудителя чумы (капсульной и бескапсульной форм)
И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев, С.А. Курчева, И.В. Жарникова, Е.В. Жданова, А.А. Семирчева, А.Г. Кошкидько
ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, ул. Советская, 13—15, г. Ставрополь, 355035, Российская Федерация
Резюме: Актуальность. Чума эндемична на территории целого ряда государств во всем мире. Несмотря на меры общественного здравоохранения, направленные на искоренение чумы, заболевание сохраняется в некоторых странах и даже возрождается. На современном этапе для оперативного мониторинга окружающей среды на наличие Yersinia (Y.) pestis широко используют традиционные серологические методы, направленные на поиск капсульного антигена чумного микроба. Но для возбудителя чумы не исключена возможность элиминации плазмид и сохранения атипичными штаммами способности вызывать инфекционный процесс, что снижает диагностическую ценность препаратов, основанных на детекции видоспецифических антигенов чумного микроба. Цель. Разработка биотехнологии производства иммунодиагностических препаратов для детекции возбудителя чумы (капсульной и бескапсульной форм). Материалы и методы. При выполнении работы использованы 27 штаммов микроорганизмов I-IV групп па-тогенности разных родов и видов. Результаты. Описана разработка иммунодиагностических препаратов для детекции Y. рestis (капсульной и бескапсульной форм). Представленные экспериментальные препараты позволяют обнаруживать типичные и измененные в антигенном отношении штаммы чумного микроба с положительным и/или отрицательным выражением «фракции 1». Для оценки эффективности сконструированных диагностикумов проведена апробация в лабораторных и полевых условиях, которая дала положительные результаты в исследовании как искусственно, так и естественно контаминирован-ных проб. Также подтверждена возможность использования чумного иммуномагнитного сорбента, обеспечивающего избирательное концентрирование материала с низким содержанием патогена и очистку проб от возможной контаминации посторонней микрофлорой, при осуществлении эпизоотологического обследования. Заключение. Сконструированные диагностические препараты позволяют выявлять в исследуемых объектах штаммы возбудителя чумы (Y. pestis) независимо от температуры культивирования и плазмидного профиля, что свидетельствует о перспективности их использования.
Ключевые слова: чума, диагностические препараты, реакция иммунофлуоресценции, реакция непрямой гемагглютинации, иммуномагнитные сорбенты, иммуноферментный анализ.
Для цитирования: Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Курчева С.А., Жарникова И.В., Жданова Е.В., Семирчева А.А., Кошкидько А.Г. Разработка иммунодиагностических препаратов для детекции возбудителя чумы (капсульной и бескапсульной форм) // Здоровье населения и среда обитания. 2020. № 4 (325). С. 64-68. DOI: https://doi.org/10.35627/2219-5238/2020-325-4-64-68
Development of Immunodiagnostic Preparations for Detection of the Plague Pathogen
(Capsular and Capsule-Free Forms)
I.S. Tyumentseva, E.N. Afanasiev, S.A. Kurcheva, I.V. Zharnikova, E.V. Zhdanova, A.A. Semircheva, A.G. Koshkidko Stavropol Plague Control Research Institute, 13-15 Sovetskaya Street, Stavropol, 355035, Russian Federation Abstract. Introduction: Plague is endemic in a number of states around the world. Despite all public health measures taken to eradicate plague, the disease persists and even reappears in some countries. Today, traditional sero-logical methods searching for the capsular antigen of the plague microbe are widely used to monitor the presence of Y. pestis in the environment. Yet, for the causative agent of the plague, the possibility of eliminating plasmids and maintaining of the ability to cause an infectious process by atypical strains is not excluded, which reduces the diagnostic value of preparations based on the detection of species-specific antigens of the plague microbe. Our objective was to develop biotechnology for the production of immunodiagnostic drugs for detection of the plague bacteria (capsular and capsule-free forms). Materials and methods: When performing the work, 27 strains of microorganisms of pathogenicity groups I-IV of different genera and species were used. Results: The development of immunodiagnostic preparations for the detection of Y. pestis in environmental samples is described. The presented experimental preparations allow detection of typical and antigenically modified plague microbe strains with a positive and/or negative expression of fraction 1. To evaluate the effectiveness of the designed diagnosticums, both laboratory and field testing was performed demonstrating positive results in the study of both artificially and naturally contaminated samples. The possibility of using the plague immunomagnetic sorbent providing selective concentration of material with a low pathogen content and purification of samples from possible contamination with extraneous microflora during epizootological examination was also confirmed. Conclusions: We constructed promising diagnostic preparations that help identify Y. pestis strains in the studied objects regardless of the cultivation temperature and plasmid profile.
Key words: plague, diagnostic drugs, immunofluorescence reaction, indirect hemagglutination reaction, immunomagnetic sorbents, enzyme immunoassay.
For citation: Tyumentseva IS, Afanasiev EN, Kurcheva SA, Zharnikova IV, Zhdanova EV, Semircheva AA, Koshkidko AG. Development of Immunodiagnostic Preparations for Detection of the Plague Pathogen (Capsular and Capsule-Free Forms). Zdorov'e Naseleniya i Sreda Obitaniya. 2020; (4(325)):64-68. (In Russian) DOI: https://doi. org/10.35627/2219-5238/2020-325-4-64-68
Information about the authors: Tyumentseva I.S., https://orcid.org/0000-0002-4391-2195; Afanasiev E.N., https:// orcid.org/0000-0002-4642-842X; Kurcheva S.A., https://orcid.org/0000-0002-3564-0791; Zharnikova I.V., https:// orcid.org/0000-0002-8443-4089; Zhdanova E.V., https://orcid.org/0000-0001-5360-3786; Semircheva A.A., https:// orcid.org/0000-0003-3660-2073; Koshkidko A.G., https://orcid.org/0000-0002-6617-9504.
апрель №4 (325)
ЗНСО
СЕ
Введение. Чума эндемична на территории ■—■ целого ряда государств во всем мире, ее распространенность совпадает с географической распространенностью грызунов, которые инфицированы чумой и обитают на всех континентах, кроме Австралии и Антарктиды, и образует широкий пояс в климате тропиков, субтропиков и в теплом климате [1].
Появление резистентных к лекарственным средствам штаммов и потенциальное использование У. рвзИз в качестве биологического оружия указывают на то, что усилия по разработке эффективных препаратов для быстрого обнаружения возбудителя чумы весьма перспективны [2—4]. Несмотря на меры общественного здравоохранения, направленные на искоренение чумы, заболевание сохраняется в некоторых странах и даже возрождается [5, 6].
Всемирная организация здравоохранения уделяет большое внимание качеству медицинских иммунобиологических препаратов, направленных на выявление возбудителя чумы. В частности, на II Международной конференции по биологической безопасности подчеркнута необходимость снижения рисков от природно-очаговых инфекций (чума). Для оперативного мониторинга окружающей среды на наличие У. в полевых условиях необходимо использование экспресс-тестов. Наилучший способ подтверждения диагноза чумы в лабораторном тестировании — выявление У. рвзИз в жидкости из бубона, в крови или в мокроте12 [7].
При изучении природных очагов чумы на современном этапе широко используют традиционные серологические методы, направленные на поиск «фракции I» чумного микроба, поэтому существующие коммерческие диагностические препараты сконструированы на основе антител к капсульному антигену У. рвзИз [5]. У возбудителя чумы нельзя исключать возможности элиминации плазмид и, соответственно, изменения антигенного состава, а также сохранения атипичными штаммами способности вызывать инфекционный процесс, что снижает диагностическую ценность имеющихся препаратов, основанных на детекции видо-специфических, детерминируемых плазмидами антигенов чумного микроба. Многолетняя практика исследований возбудителя показала существование в объектах окружающей среды и у больных людей вариантов чумного микроба, лишенных «фракции I». Кроме того, выращенные при 28 °С клетки типичных штаммов чумного микроба не выявляются с помощью иммуноглобулиновых препаратов, полученных к капсульному антигену «фракции I», поэтому требуется дополнительное время для культивирования подозрительных на чуму колоний при 37 °С. Вследствие чего разработка новых высокоспецифичных диагностических препаратов и эффективных методических подходов для выявления капсульных и бескапсульных
форм чумного микроба и антител к ним остается актуальной научно-практической задачей [8-10].
Материалы и методы. При выполнении работы использованы 27 штаммов микроорганизмов I-IV групп патогенности разных родов и видов из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора.
Поставленная задача реализована, в первую очередь, разработкой биотехнологии получения высокоспецифичной поливалентной гипериммунной сыворотки против Y. pestis (капсульной и бескапсульной форм). Иммунизацию кроликов проводили по отработанной схеме при сочетании антигенного комплекса («фракция I», водно-солевой экстракт и белки, солюбизи-рованные карбамидом, из афракционного штамма Y. pestis EV 5) и иммуномодуляторов (тималин и циклофосфан). Для повышения специфичности полученной иммунной сыворотки проводили сорбцию алюмосиликатным магнитным иммуносорбентом с иммобилизованным на его поверхности антигенным водно-солевым экстрактом, выделенным из бактериальных клеток штамма Y. pseudotuberculesis III серовара, с которым нередко выявляются неспецифические реакции в непрямой реакции иммунофлуоресценции.
На основе сыворотки был сконструирован ряд диагностических препаратов для детекции Y. pestis (капсульной и бескапсульной форм).
Конъюгацию иммуноглобулинов G (IgG) с флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) проводили по методу H. Storz, варьируя концентрацию ингредиентов, а также другие параметры процесса.
Иммунопероксидазные чумные конъюгаты получали по методу Nakane P.K., Kawaoi A. с использованием пероксидазы хрена (тип VI-А, activity-1000 units/mg (Sigma). Рабочий титр разработанных нами иммунопероксидазных чумных конъюгатов всех изготовленных серий составил 1 : 400-1 : 800. Специфическая активность конъюгатов составила 1 х 106 микробных клеток в 1 мл (м.к./мл). Полученные конъюгаты при постановке иммуноферментного анализа (ИФА) показали отрицательные результаты с контрольной панелью штаммов гетерологичных микроорганизмов, что может свидетельствовать об их специфичности.
Для конструирования магноиммуносорбента (МИС) использовали стандартный образец магносорбента (СО 007-9388-2015) [11].
Математическую и статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel 2010 [12]. Для оценки специфической активности и специфичности разработанных диагностикумов было изготовлено по пять экспериментальных серий каждого препарата.
Результаты исследования. В результате экспериментальных исследований оптимизированы
1 Чума. [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/plague (дата обращения 24.06.2019).
2 II Международная конференция по биологической безопасности завершила свою работу: [Электронный ресурс]. Режим доступа: https://rospotrebnadzor.ru/about/info/news/news_details.php?ELEMENT_ID=12157 (дата обращения: 24.06.2019).
66
АПРЕЛЬ №4 (325)
условия изготовления эритроцитарного иммуно-глобулинового диагностикума чумного: конъю-гирующим агентом был определен вторичный алкилсульфат натрия в концентрации 2 %; сенсибилизацию иммуноглобулинов с эритроцитами проводили при температуре 45 °С, при рН 5,0.
Для оценки эффективности сконструированного диагностикума эритроцитарного чумного были проведены межлабораторные испытания экспериментальных серий; при анализе результатов реакции непрямой гемагглю-тинации (РНГА) определена чувствительность диагностикума, которая составила для всех исследованных штаммов Y. pestis (капсульной и бескапсульной форм) 2,5 х 106 м.к./мл; также была отмечена высокая специфичность диагностикума, а именно отсутствие реакции со штаммами гетерологичных микроорганизмов.
Следующим этапом стала разработка диагностикума, предназначенного для выявления капсульных и бескапсульных штаммов Y. pestis в реакции иммунофлуоресценции (РИФ). Из полученной ранее высокоспецифичной поливалентной гипериммунной сыворотки против Y. pestis (капсульной и бескапсульной форм) фракционировали иммуноглобулины класса G каприловым методом. При использовании этого метода в преципитате обнаруживается до 70 % IgG, с незначительным содержанием балластных белков. Были установлены оптимальные параметры конъюгации иммуноглобулинов с ФИТЦ: значение рН — 9,5, количество ФИТЦ — 0,02 г на 1 г иммуноглобулинов, инкубация в течение 4 ч при 20 °С. Оценку специфичности и специфической активности флуоресцирующих чумных антител определяли на мазках, приготовленных из контрольных штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов.
Активность (красящий титр) приготовленных меченных чумных иммуноглобулинов флуоресцирующих всех экспериментальных серий равна разведению не менее 1 : 16. Рабочее разведение исследуемых серий позволило выявить капсульную и бескапсульную формы Y. pestis в мазках с концентрацией микробных клеток 5 х 105 в 1 мл и более. Для некоторых штаммов оказалось характерным обнаружение единичных бактерий в мазках, приготовленных из взвесей, содержащих 2,5 х 105 м.к. в 1 мл. Диагностическую ценность флуоресцирующих антител определяли в пробах объектов окружающей среды (смывы с предметов обихода, пробы почвы, гнезда грызунов), искусственно контаминированных возбудителем чумы. При экспериментальном исследовании имитированных проб, содержащих в 1 мл 5 х 105 м.к., выявлены единичные клетки с интенсивным специфическим свечением. При определении специфичности показано отсутствие иммунофлуоресценции в мазках со штаммами гетерологичных микроорганизмов. Таким образом, сконструированные экспериментальные серии при проведении испытаний показали возможность выявлять штаммы возбудителя чумы независимо от формы (капсульной или
бескапсульной) в методе прямой иммунофлу-оресценции. 1—■
Перспективным способом пробоподготовки исследуемого материала из объектов окружающей среды стало применение иммуномагнитной сепарации. К настоящему времени в ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора разработан стандартный образец магносорбента, на его основе был сконструирован чумной магноиммуносорбент.
При проведении предварительной пробоподготовки на МИС в иммуноферментном анализе удалось обнаружить штаммы чумного микроба в концентрации 1,0 х 102 — 1,0 х 103 м.к./мл (капсульной и бескапсульной форм). Все экспериментальные серии МИС не выявляли в ИФА гетерологичных штаммов в концентрации 1,0 х 105 м.к./мл и выше. Образовавшийся комплекс «антиген-антитело» выявляли in vitro с помощью изготовленного конъюгата пероксидазы хрена с иммуноглобулинами чумными. Для удобства использования была сконструирована экспериментальная тест-система иммуноферментная магноиммуносор-бентная для выявления Y. pestis (капсульных и бескапсульных форм). Возможность детекции чумного микроба и его антигенов в объектах окружающей среды с помощью разработанной тест-системы (путем предварительного избирательного концентрирования на МИС) подтверждена при изучении имитированных проб в рамках межлабораторных испытаний, а также при проведении исследований в полевых условиях.
Результаты проведенных межлабораторных испытаний по изучению эффективности разработанных препаратов представлены в таблице.
Заключение
Вспышки заболеваемости чумой считают проблемой прошлого, однако ежегодно в мире регистрируются случаи заболевания чумой и опасность появления эпидемий чумы сохраняется из-за существования практически на всех континентах обширных природных очагов этой инфекции, где постоянно циркулирует возбудитель.
Для обеспечения эффективного мониторинга за возбудителем чумы в природных очагах необходимо применение надежных методов лабораторной диагностики, обладающих достаточной чувствительностью и специфичностью.
Приведенные в работе данные позволяют сделать заключение, что конструирование диагностических препаратов, ориентированных на выявление капсульных и бескапсульных штаммов возбудителя чумы, является перспективным исследованием, так как у этих препаратов есть дополнительное преимущество — быстро и легко обнаруживать Y. pestis в образцах окружающей среды и эктопаразитах. Это имеет большое значение при эпизоотологическом обследовании территории природных очагов чумы и позволяет реализовать возможность обнаружения естественных или генетически модифицированных штаммов Y. pestis с отрицательным и/или положительным выражением «фракции I».
апрель №4 (325)
ЗНСО
а
Таблица. Результаты испытаний экспериментальных серий чумных диагностикумов (выборочно) Table. Test results of some experimental plague diagnosticum series
№ п/п Наименование штамма (наличие «фракции 1») / The name of the strain (presence of «fraction 1») Применение / Application
Производственные штаммы / Production strains
1. Y. pestis EV линии НИИЭГ (вакцинный) (F+) / Y pestis EV strain, Research Institute of Epidemiology and Hygiene line (vaccine) (F+) выделение «фракции 1» / the allocation of the «fraction 1»
2. Y. pestis EV 5 (F-) выделение водно-солевого экстракта и белков, солюбизированных карбамидом / Isolation of a water-salt extract and urea solubilized proteins
Контрольные штаммы / Control strains
контроль специфической активности / specific activity control1
в РНГА / in RGA в РИФ / in RIF в ИФА с МИС / in ELISA with MIS
Серия 1 / Series 1 Серия 2 / Series 2 Серия 1 / Series 1 Серия 4/ Series 4 Серия 2 / Series 2 Серия 5 / Series 5
3. Y. pestis Yava (F-) 2,5x106 6,25x105 5,0x105 5,0x105 1,0x103 1,0x102
4. Y. pestis 796 (F-) 2,5x106 6,25x105 2,5x105 2,5x105 1,0x103 1,0x103
5. Y. pestis Harbin (F-) 2,5x106 6,25x105 5,0x105 5,0x105 1,0x103 1,0x103
6. Y. pestis 461 (F+) 2,5x106 6,25x105 5,0x105 5,0x105 1,0x102 1,0x102
7. Y. pestis С-726 (F+) 2,5x106 6,25x105 5,0x105 5,0x105 1,0x102 1,0x102
8. Y. pestis С-563 (F+) 2,5x106 6,25x105 5,0x105 5,0x105 1,0x102 1,0x102
9. Y. pestis 798 (F+) 2,5x106 6,25x105 2,5x105 2,5x105 1,0x103 1,0x103
10. Y. pestis А-1024 (F+) 2,5x106 6,25x105 5,0x105 5,0x105 1,0x103 1,0x102
11. Y. pestis C-553 (F+) 2,5x106 1,25x106 5,0x105 5,0x105 1,0x102 1,0x102
12. Y. pestis С-529 (F+) 2,5x106 1,25x106 2,5x105 2,5x105 1,0x103 1,0x102
контроль специфичности/ specificity control
13. Y. enterocolitica 383 - - - - - -
14. Y. enterocolitica 178 - - - - - -
15. Y. enterocolitica 134 - - - - - -
16. Y. enterocolitica 64 - - - - - -
17. E. coli 113-3 - - - - - -
18. E. coli Мк4 - - - - - -
19. E. coli Тк7 - - - - - -
20. S. typhimurium 9640 - - - - - -
21. S. typhimurium 7407 - - - - - -
2227. Y. pseudotuberculesis I-VI серовары / Y. pseudotuberculesis I-VI serovars - - - - - -
1 Мутность микробной взвеси определяют в сравнении со стандартным образцом мутности (ОСО 42-28-85П), который откалиброван по международному стандартному образцу. 1 The turbidity of the microbial suspension is determined in comparison with the standard turbidity sample (OCO 42-28-85P), which is calibrated according to the international standard sample
Примечание: «-» - отрицательный результат.
Note: — negative results.
Список литературы (пп. 1—4, 6 см. References)
5. Тюменцева И.С., Курчева С.А., Афанасьев Е.Н.,
и др. Особенности пробоподготовки с использованием иммуномагнитного сорбента при исследовании полевого материала на наличие возбудителя чумы // Военно-медицинский журнал. 2018. № 5. С. 42—46.
7. Тилегул К.А., Алимбекова А., Землянухина Л.С. и др. Динамика заболеваемости чумой в мире // Вестник КГМА им. И.К. Ахунбаева. 2015. № 1. С. 121-125.
8. Божко Н.В., Лебедева С.А., Бичуль О.К. и др. Первичная характеристика свойств и диагностической ценности антигенного комплекса "Фракция V" чумного микроба // Клиническая лабораторная диагностика. 2005. № 6. С. 35.
9. Волох О.А., Кузнецова Е.М., Щербаков А.А. Оценка возможности использования экспериментальных иммунодиагностических препаратов в лабораторной диагностике чумы и туляремии // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. 2014. Т. 14 (2). С. 78-82.
10. Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Курчева С.А. и др. Разработка диагностических препаратов для детекции Yersinia pestis (капсульной и бескапсульной форм) // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных». 24-25 апреля 2019 г., Ставрополь. С. 289-290.
11. Тюменцева И.С., Афанасьев Е.Н., Старцева О.Л. и др. Разработка стандартных условий биотехнологии производства иммуномагнитного сорбента для экспресс-диагностики опасных инфекционных
68
апрель №4 (325)
заболеваний // Технологии живых систем. 2017. Т. 14 (2). С. 52-58.
12. Урбах В.Ю. Биометрические методы. М.: Наука, 1964. 410 с.
References
1. Zavialov AV, Berglund J, Pudney AF, et al. Structure and biogenesis of the capsular F1 antigen from Yersinia pestis: preserved folding energy drives fiber formation. Cell. 2003; 113(5):587-596. DOI: https://doi.org/10.1016/ s0092-8674(03)00351-9
2. Keeling MJ, Gilligan CA. Metapopulation dynamics of bubonic plague. Nature. 2000; 407:903-906. DOI: https://doi.org/10.1038/35038073
3. Cabanel N, Bouchier C, Rajerison M, et al. Plasmid-mediated doxycycline resistance in a Yersinia pestis strain isolated from a rat. Int J Antimicrob Agents. 2018; 51(2):249-254. DOI: https://doi.org/10.1016/j. ijantimicag.2017.09.015
4. Yang R. Plague: recognition, treatment, and prevention. J Clin Microbiol. 2017; 56(1):e01519-17. DOI: https:// doi.org/10.1128/JCM.01519-17
5. Tyumentseva IS, Kurcheva SA, Afanasev EN, et al. Features of sample preparation with the use of immunomagnetic sorbent when studying field material for plague agent. Voenno-Meditsinskii Zhurnal. 2018; 339(5):42-46. (In Russian).
6. Simon S, Demeure C, Lamourette P, et al. Fast and simple detection of Yersinia pestis applicable to field investigation of plague foci. PLoS One. 2013; 8(1):e54947. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0054947
7. Tilegul A, Alimbekova A, Zemlyanukhina LS, et al. Morbidity of plague dynamics in the world. Vestnik KGMA im. I.E.. Akhunbaeva. 2015; 1(1):121-125. (In Russian).
8. Bozhko HV, Lebedeva SA, Bichul OK, et al. Primary characteristics of the properties and diagnostic value of the plague microbe antigenic complex "Fraction V".
Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. 2005; (6):35. (In Russian).
9. Voloh OA, Kuznetsova EM, Shcherbakov AA. Assessment P of possibility of use of the experimental immunodiagnostic ,—i preparations in laboratory diagnostics of plague and tulyaremiya. Izvestiya Saratovskogo universiteta. Novaya j^p
seriya. Seriya: Khimiya. Biologiya. Ekologiya. 2014; v_f
14(2):78-82. (In Russian). =
10. Tyumentseva IS, Afanasiev EN, Kurcheva SA, et al. Development of diagnostic preparations for the detection of Yersinia pestis (capsule and capsule-free forms): Proceedings of the III All-Russian Scientific and Practical Conference with International Participation "Urgent Problems of Zoonotic Infectious Diseases", Stavropol, 24-25 April 2019. pp. 289-290. (In Russian).
11. Tyumentseva IS, Afanasiev EN, Startseva OL, et al. Development of standard conditions for the biotechnology of production of immunomagnetic sorbent for express-diagnostics of dangerous infectious diseases. Tekhnologii Zhivykh Sistem. 2017; 14(2):52-58. (In Russian).
12. Urbach VYu. Biometric methods. Moscow: Nauka Publ. 1964. 410 p. (In Russian).
Контактная информация:
Курчева Светлана Александровна, заведующая научно-производственной лабораторией препаратов для диагностики особо опасных и других инфекций ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора e-mail: stavnipchi@mail.ru Corresponding author:
Svetlana A. Kurcheva, Head of the Scientific and Production Laboratory of Drugs for Diagnosis of Particularly Dangerous and Other Infections, Stavropol Plague Control Research Institute of the Federal Service for Surveillance in the Sphere of Consumers Rights Protection and Human Welfare e-mail: stavnipchi@mail.ru
Статья получена: 20.08.2019 Принята в печать: 06.04.2020
öö ö
