CC BY-ND
31
РАЗРАБОТКА И ВНЕДРЕНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГ НОСТИКИ ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО НИЛА МЕТОДОМ ПЦР
Т.Ю. Красовская, И.Н. Шарова, С.А. Щербакова, Ю.И. Яшежин,
Н.В. Хуторецкая, В.Ф. Ларичев, А.М. Бутенко. А.Н. Куличенко
ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, Саратов,
ГУ «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского»
РАМН, Москва
Вирус Западного Нила (ВЗН). относящийся к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus, антигенному комплексу японского энцефалита, является этиологическим агентом лихорадки Западного Нила (ЛЗН). Особую актуальность для здравоохранения эта инфекция приобрела после ряда крупных эпидемических вспышек в конце XX века: в 1996 г. в Румынии, в 1999 г. на юге России и, впервые, в Западном полушарии (США), в 2000 г. в Израиле. Эти вспышки характеризовались высокой долей менингитов и менинго-энцефалитов (более 50%), высокой летальностью (около 10%), при этом заболевания и смертельные исходы регистрировались в основном у пожилых лиц. Вследствие вышеперечисленных событий ЛЗН рассматривается как классический пример возникающего и вновь возвращающегося (emerging-reemerging) инфекционного заболевания [2].
В связи с этим актуальным является совершенствование лабораторной диагностики ЛЗН. Внедрение в практику метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), широко используемого в диагностике вирусных инфекций, будет способствовать быстрой, специфичной и чувствительной детекции возбудителя в биологическом материале и ранней постановке диагноза. В настоящее время рядом авторов разработаны способы обнаружения ВЗН, основанные на методе ОТ-ПЦР [1,3-6], однако сертифицированный диагностический препарат, разрешенный к применению и производству в Российской Федерации, включающий комплекты реагентов для всех этапов ПЦР-анализа, до сих пор отсутствует.
Целью данного исследования являлось конструирование диагностической тест-системы для выявления РНК ВЗН в биологическом материале на основе метода ОТ-ПЦР, разработка нормативной документации на созданную тест-систему.
На начальном этапе исследований для подбора специфичных праймеров мы провели выравнивание секвенированных геномных нуклеотидных последовательностей изолятов ВЗН, относящихся к 1 -4 генетическим вариантам, информация о которых представлена в базе данных GenBank. В процессе анализа был выбран наиболее консервативный участок генома ВЗН, отвечающий за синтез неструктурного белка NS5.
С использованием программ Gene Runner и Blast были подобраны праймеры, комплементарные вышеуказанному участку вирусного генома. Анализ имеющихся в базе данных нуклеотидных последовательностей показал, что при использовании одной пары праймеров детекция всех генетических вариантов ВЗН не представляется возможной. Поэтому в целях повышения чувствительности и специфичности реакции был сконструирован лвухэтапный вариант ПЦР (nested-ПЦР). Учитывая генетическую гетерогенность штаммов ВЗН, для первого этапа ПЦР использовали три праймера: два прямых и один обратный, в результате происходила амплификация фрагментов ДНК различных размеров - от 340 до 440 п.н. - в зависимости от штамма ВЗН. Для в юрою этапа использовали пару праймеров, имеющих комплементарные участки на фрагментах ДНК, полученных после первого этапа, и обеспечивающих образование вторичных фрагментов ДНК размером 106 п.н. для всех штаммов ВЗН.
Учет результатов ПЦР проводили методом горизонтального электрофореза в 2%-м агарозном геле. Наличие полосы на уровне 106 п.н. в треках, соответствующих анализируемым пробам, указывало на присутствие РНК ВЗН в исследуемом материале.
Специфичность подобранных праймеров определяли в экспериментах с образцами кДНК различных штаммов ВЗН (Ast901, Ast986, Нр-94, Azerb.1628, Ig22886, lg2266, Eg 101, Krd-190) и гетерологичных вирусов, принадлежащих к семействам Flaviviridae (8 штаммов), fíunyaviridae (9 штаммов), '/'ogaviridae (2 штамма), Reovirídae (1 штамм) и Orthomyxoviridae (1 штамм), а также геномной ДНК человека. Вирусные штаммы, использованные в работе, были получены из Государственной коллекции вирусов Российской Федерации ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.
Со всеми штаммами ВЗН в ПЦР получен положительный результат. При тестировании кДНК гетерологичных вирусов, так же как и при использовании геномной ДНК человека, образования специфического ПЦР-продукта не наблюдали. Таким образом, была подтверждена специфичность реакции с выбранными праймерами и возможность их применения для конструирования ПЦР-тест-системы.
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием обратной транскриптазы M-MLV («Promega», США) и буферного раствора, содержащего случайные гексануклеотиды. В целях повышения чувствительности тест-системы в реакционную смесь для обратной транскрипции был введен специфичный праймер.
В серии экспериментов с кДНК штаммов ВЗН Ast901 и Ast986 были подобраны оптимальный способ выделения РНК, состав реакционной смеси для ПЦР (концентрация ионов магния, праймеров, фермента), температурные и временные параметры реакции, при которых отсутствовало образование неспецифических продуктов амплификации и наблюдалась наибольшая чувствительность реакции.
ВЗН относится ко II группе патогенности, поэтому использование в качестве положительного контроля РНК или кДНК вируса связано с высокой биологической опасностью. В связи с этим положительный контрольный образец для тест-системы был сконструирован генно-инженерным методом -трансформацией штамма E. coli TCI рекомбинантной плазмидой pWN, полученной путем клонирования в плазмидный вектор pGEM-T фрагмента ДНК, гомологичного нуклеотидной последовательности РНК ВЗН, отвечающей за синтез белка NS5. Сконструированный препарат отвечал требованиям биологической безопасности, был стабилен при хранении, что позволило использовать его при производстве диагностической тест-системы. Штамм-продуцент депонирован в коллекции штаммов ГКПБ «Микроб».
Дальнейшее изучение специфической активности и чувствительности тест-системы провели в рамках модельного эксперимента, который заключался в тестировании с помощью ОТ-ПЦР десятикратных разведений штамма ВЗН Ast 901 (от 10'3 до 10‘13) в различном биологическом материале: сыворотке крови здорового донора, суспензии комаров, суспензии клещей. В качестве контрольной среды для титрования использовался физиологический раствор. Одновременно вирус титровали в культуре клеток Vero Е6 (готовили вышеуказанные разведения вируса на среде Игла и вносили в четырех повторах в лунки 96-луночного планшета с монослоем клеток, наблюдение ЦПД вели в течение 7 суток) и в ИФА-тест-системе для выявления антигена ВЗН (использована тест-система производства ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН).
Инфекционный титр вируса в культуре клеток Vero Е6 составил 8,5 lg ЦПД5о/0,1 мл. С помощью ИФА антиген ВЗН выявлялся до разведения 10'6.
При использовании испытуемой тест-системы РНК вируса детектировали до разведений 10’8-10 10 в зависимости от среды для титрования (в разведении 10 10 при титровании в сыворотке; в разведении 109 при титровании в суспензии клещей и 0,9 % растворе натрия хлорида; в разведении 10' при титровании в суспензии комаров).
Сравнение различных методов детекиии ВЗН показало, что ПЦР-анализ с использованием предложенной нами тест-системы превышает по чувствительности ИФА на 2-4 порядка, не уступает по чувствительности методу выявления вируса в культуре клеток, а по скорости получения конечного результата значительно превосходит его.
При исследовании с помощью сконструированной тест-системы полевого материала (суспензия головного мозга и селезеики птиц, суспензии комаров), собранного на территории Астраханской области, отмечалось совпадение результатов ОТ-ПЦР-анализа и выделения вируса на культуре клеток Vero Е6 в 100 % случаев. Полевой материал и результаты его изучения культуральным методом предоставлены лабораторией экологии вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (заведующий лабораторией академик РАМН Д.К. Львов).
Итогом проведенной работы стало создание диагностическою препарата «Тест-система для выявления РНК вируса Западного Нила методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. ГенНил», состоящего из четырех комплектов реагентов: для выделения РНК, для постановки реакции обратной транскрипции, для постановки ПНР, для электрофоретической детекции продуктов ПЦР. Время проведения анализа составляет 5--6 часов. Тест-система предназначена для выявления РНК ВЗН в сыворотке (плазме) крови, суспензиях клещей, комаров, суспензиях органов животных (мозг, селезенка). Чувствительность тест-системы -- МО3 ГЭ/мл.
Важной характеристикой диагностического препарата является его стабильность. В результате лабораторных испытаний трех серий препарата установлено, что разработанная тест-система сохраняет свою специфическую активность в течение 6 месяцев.
В 2005 г. совместно со специалистами ГИСК им. Л.А. Тарасевича на базе ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН проведены Государственные испытания сконструированной тест-системы. Испытания показали, что чувствительность тест-системы ГенНил составила 1 * 103 ГЭ/мл (соответствует заявленной чувствительности препарата), специфичность -98,3%, воспроизводимость результатов - 100%. Тест-система рекомендована Комитетом МИШ к регистрации в Российской Федерации.
СПИСОК J1ИТЕРАТУРЫ
1. Карань Л.С., Булгакова Т.А., Журавлев В.И. и др. Детекция и гекотипиро-вание вируса лихорадки Западного Нила в полевом и клиническом материале //Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков. Мат. Междун, научно-практ. конф. Алматы, 2006. С. 73-76.
2. Львов Д.К, Значение вновь возвращающихся инфекций в биобезопасности //Вопросы вирусологии. 2002. № 5. С. 4—7.
3. Петров A.A., Меркулова О.В., Кулиш B.C. и др. Разработка ПЦР тест-системы для выявления возбудителя лихорадки Западного Нила //Актуальные проблемы зашиты от возбудителей опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Мат. научной конф,, посвященной 50-летию Вирусологического центра НИИ микробиологии МО РФ. Сергиев Посад, 2004. С. 149-150.
4. Прилипов А.Г., Львов Д.К., Самохвалов К.И. и др, Патент РФ №2199589 Способ обнаружения вируса лихорадки Западного Нила. 2000. 12. 28.
5. Терновой В.А., Щелканов М.Ю., Шестопалов А.М. и др. Выявление вируса Западного Нила у птиц на территории Ьарабинской и Кулундинской низменностей (Западно-Сибирский пролетный путь) в летне-осенний период 2002 г. //Вопросы вирусологии. 2004. № 3. С. 52-56.
6. Lanciotti R.S., Ebei G.D., Deubel V. et al. Complete genome sequences and phylogenetic analysis of West Nile virus strains isolated from the United States, Europe, and the Middle Easte //Virology. 2002. V. 298. N 1. P. 96 105.
