CC BY
38
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ И ТИПИРОВАНИИ ПАТОГЕНОВ
мичных штаммов ВКЭ стала реализация государственной программы по акклиматизации охотничье-промыс-ловых зверей и птиц (Кота1ет et а!., 2010). Эта программа действовала с начала 30-х до начала 90-х гг. прошлого века - фактического распада Советского Союза. В результате более миллиона особей 45 видов млекопитающих и около полумиллиона особей восьми видов птиц было переселено из различных территорий, в том числе и с Дальнего Востока, на Урал и европейскую часть
СССР. Большинство из этих животных являются естественными прокормителями иксодовых клещей и вовлечены в циркуляцию ВКЭ.
Подводя итог, можно с уверенностью утверждать: проблемы смены генотипов не существует, есть проблема понимания причин, по которым штаммы Дв-ВКЭ заносились на неэндемичные территории. В основе этих причин, по нашему мнению, лежит прежде всего антропогенный фактор.
НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСОВ ДЕНГЕ (НУ ТИПОВ) МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ И ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Е.В. Найденова, Ю.И. Яшечкин, С.А. Щербакова
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», г. Саратов
За последнее десятилетие в мире произошло значительное увеличение случаев заболевания лихорадкой Денге и геморрагической лихорадкой Денге во многих эндемичных регионах.
В настоящее время эта инфекционная болезнь приобретает актуальность и для России в связи с тем, что одни из наиболее популярных мест отдыха россиян расположены на территориях, где отмечаются случаи заболевания людей лихорадкой Денге (Таиланд, Карибские острова). Завозные случаи лихорадки Денге зарегистрированы в различных регионах Российской Федерации (В.Ф. Ларичев и др., 2007). На территории России в районе Большого Сочи (Краснодарский край) были обнаружены местные популяции комаров Aedes aegypti (Ю.В. Юничева и др., 2008) - основных переносчиков вирусов Денге.
Одним из методов лабораторной диагностики лихорадки Денге является полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
На сегодняшний день в России отсутствуют зарегистрированные коммерческие препараты для обнаружения и дифференциации вирусов Денге, разработанные на основе амплификационных технологий. Целью нашей работы являлось конструирование набора для выявления РНК вирусов Денге (I-IV типов) методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции.
Материалы и методы. Для подбора праймеров из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.qov/ Genbank /Genbank /overview. html) выбрана 2441 полная нуклеотидная последовательность вирусов Денге, из которых: первого типа - 1151, второго - 650, третьего - 549 и 91 - четвертого типа. При клонировании наработанных фрагментов использовали вектор pTZ57R/T («Fermentas», Литва) с последующей трансформацией штамма Escherichia coli JM109. Плазмидную ДНК выделяли с помощью набора «AxyPrep Plasmid Miniprep Kit» («Axygen», США). Оценку чувствительности и специфичности проводили с 11 препаратами кДНК вирусов, 2 бактериальными штаммами, а также с образцами кро-
ви и сыворотки здоровых доноров, суспензии печени и селезенки мелких млекопитающих. ДНК и РНК получали с использованием наборов «Рибо-сорб» («Интер-лабсервис», Россия). Реакцию обратной транскрипции проводили с набором «REVERTA-L» («Интерлабсер-вис», Россия).
Результаты и обсуждение. Для подбора праймеров выбрали область неструктурных протеинов NS3 и NS5. В связи с высокой вариабельностью вирусных нуклеиновых кислот и для повышения надежности выявления РНК вирусов в ОТ-ПЦР было решено использовать праймеры на два локуса из каждого генома, т. е. всего восемь локусов. Для получения сведений о ком-плементарности выбранных праймеров к NS5 и NS3-сегментам РНК вирусов Денге, а также для выявления участков неспецифического связывания с нуклеотид-ными последовательностями других видов вирусов, бактерий и ДНК человека выбранные праймеры были протестированы с помощью программы для обработки базы данных BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.qov/ BLAST). Анализ полученных результатов показал, что праймеры специфически комплементарны (с рассчитанной степенью гомологии) к нуклеотидной последовательности выбранных фрагментов РНК вирусов Денге. С близкородственными вирусами ком-плементарность отсутствовала.
В результате последующих экспериментов были оптимизированы условия проведения ПЦР с выбранными праймерами.
Для повышения уровня биологической безопасности при работе с диагностическим препаратом нами в качестве положительного контрольного образца (ПКО) предложено использование рекомбинантных молекул, содержащих известную последовательность ДНК, которые безопасны, стабильны при хранении. Клонирование наработанных фрагментов проводили с вектором pTZ57R/T («Fermentas», Литва), полученной ре-комбинантной плазмидой трансформировали штамм E. coli JM109. Рекомбинантные клоны отбирали на
НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК
дифференциальной среде с добавлением ампициллина в концентрации 50 мкг/мл, далее накапливали культуру и выделяли плазмидную ДНК. В результате работы были сконструированы ПКО к каждому локусу, выявляемому в мультиплексной ПЦР с 4 парами праймеров.
При оценке чувствительности и специфичности ПЦР с выбранными праймерами использовали ПКО в концентрациях от 1х 102 до 1х 105 ГЭ/мл и кДНК вирусов Денге (1-ГУ типов) в разведении 10-3, 10-4, 10-5. Исследования показали, что праймеры обеспечивают специфичную амплификацию фрагмента нуклеотид-ной последовательности соответствующего вируса с чувствительностью 1*104 ГЭ/мл, в случае с кДНК вирусов Денге чувствительность составила 10-4. Для проверки специфичности использовали образцы крови и сыворотки здоровых доноров, суспензии печени и селезенки мелких млекопитающих, не содержащие генетиче-
ский материал вирусов Денге, а также два препарата ДНК бактерий (Legionella pneumophila, Yersinia pestis) (в концентрации 1*106 мк/мл) и семь препаратов к ДНК гетерологичных вирусов (Западного Нила, ККГЛ, желтой лихорадки, клещевого энцефалита, Дугбе, Батаи, Чикунгунья) (разведения вирусов - 10-4). Во всех случаях в ПЦР получен отрицательный результат. Данные по специфичности и чувствительности ПЦР с выбранными праймерами свидетельствовали о возможности их использования для разработки ПЦР-тест-системы.
Таким образом, проведенная проверка сконструированной мультиплексной ПЦР-системы показала отсутствие неспецифических реакций с гетерогенными нуклеиновыми кислотами (ДНК бактерий и кДНК вирусов). Чувствительность системы, оцененная по ПКО, составила 1*104 ГЭ/мл.
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА НА ТЕРРИТОРИИ НОВОСИБИРСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА
С.Е. Ткачев, В.Ю. Боргояков, Е.Д. Чикова, В.В. Панов*
Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
*Институт систематики и экологии животных СО РАН
В настоящее время большинство исследователей выделяют три основных генетических типа вируса клещевого энцефалита (ВКЭ): дальневосточный (с прото-типным штаммом Софьин), западноевропейский, или западный (прототипный штамм Найдорф), и сибирский, или урало-сибирский (с прототипными штаммами Васильченко и Заусаев) (Ecker et al., 1999; Hayasaka et al., 1999, 2001; Злобин и др., 2001, 2003; Погодина и др., 2002, 2004). В последние годы были также выявлены и охарактеризованы возможные новые генотипы ВКЭ - генотип, представленный одиночным штаммом 178-79, и генотип, представленный группой штаммов, сходных со штаммом 886-84. Оба этих штамма были изолированы на территории Иркутской области и отвечают критериям выделения в самостоятельные генотипы, установленным на основании степени геномных отличий (Демина и др., 2009а, 2009б; Demina et al., 2010).
Цель работы - исследование генетического разнообразия ВКЭ в образцах индивидуальных иксодовых клещей, собранных на территории лесопарковой зоны Новосибирского научного центра (ННЦ).
Материалы и методы. Сбор образцов. Голодных имаго иксодовых клещей собирали флагированием с растительности в природном очаге лесопарковой зоны Новосибирского научного центра в эпидемиологические сезоны 2007-2010 гг. на участках: 1) ботанический сад, окрестности ННЦ, смешанный березово-осиновый лес; 2) пойма реки Шадрихи, 8 км к юго-востоку от ННЦ, сосновый лес; 3) пост ГАИ, окрестности ННЦ, сосновый лес; 4) смешанный березово-осиновый лес за Инсти-
тутом катализа СО РАН, окрестности ННЦ. Проводили сбор образцов клещей с людей, обращающихся в пункт вакцинопрофилактики ЦКБ СО РАН по поводу укусов как на территории ННЦ, так и его окрестностей, в эпид-сезоны 2009-2010 гг.
Выделение суммарных РНК. Суммарные нуклеиновые кислоты из иксодовых клещей выделяли с использованием наборов «Проба НК» («ДНК-технология», Москва) согласно инструкциям производителя.
Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция. Получение кДНК, соответствующих фрагментам генома ВКЭ, проводили методом обратной транскрипции (ОТ) с применением наборов «РевертаЬ» в соответствии с инструкциями изготовителя («АмплиСенс», ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ). В качестве матрицы использовали образцы суммарных нуклеиновых кислот, выделенных из клещей. Двухраундовую полиме-разную цепную реакцию (ПЦР) проводили с праймерами, соответствующими З'-концу гена Е (позиции 2199-2219 и 2214-2238 н.о.) и 5'-концу гена NS1 (позиции 2402-2424 и 2517-2539 н.о.) ВКЭ.
Определение нуклеотидных последовательностей и молекулярно-генетический анализ. Определение нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР, соответствующих фрагментам генома ВКЭ, проводили с помощью наборов BigDye Terminators Cycle Sequencing Kit v.3.1 (Applied Biosystems, США) с применением автоматического анализатора ДНК модели ABI 310 (Applied Biosystems, США) в Центре секвенирования ДНК СО РАН. Полученные последовательности вы-
