CC BY
22
УДК - 615.072:543.865:543.867
РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ТРИТЕРПЕНОВЫХ САПОНИНОВ В СУХОМ ЭКСТРАКТЕ ИЗ ОКОЛОПЛОДНИКОВ СТИРАКСА ЛЕКАРСТВЕННОГО (STYRAX OFFICINALIS L.)
Хамама З., Ивлев В.А., Суслина С.Н., Лазар С.
ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов», г. Москва, Российская Федерация
Аннотация. Количественная спектроскопия ЯМР1-Н считается надёжным методом определения концентрации ЛС в отсутствие стандартного образца с использованием сигналов введенного в аналит любого калибровочного соединения в известной концентрации (ГФ ХШ, ОФС.1.2.1.1.0007.15). Исторически именно растения являются источником фармацевтических субстанций, химическое производство более затратный и сложный процесс, требующий дорогостоящего оборудования, специальных условий и высококвалифицированного персонала. Несмотря на большое разнообразие растений в Сирии, лишь немногие фармацевтические субстанции выделяются из растительного сырья. Очень мало лекарственных препаратов, на основе растительных субстанций, хотя выделение и местное производство простое и недорогое. Целью данной работы являлась разработка методики количественного определения тритерпеновых сапонинов в сухом экстракте из растительного сырья - околоплодников стиракса лекарственного (Styrax officinalis L.), произрастающего в Сирии. Проводимое исследование требует разработки новых аналитических методов контроля качества полученной лекарственной субстанции, обязательным требованием к которым является их валидация. Проведенная нами валидация показала, что методика количественного определения сапонинов в сухом экстракте с помощью ЯМР - спектроскопии пригодна и соответствует заложенным критериям приемлемости.
Ключевые слова: Styrax officinalis L., сапонины, стандартизация экстракта, валидация, спектроскопия ЯМР1-Н.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
[1] Bock B. Référentiel des trachéophytes de France métropolitaine/ B. Bock et al// eFlore, la flore électronique de Tela Botanica- 2016. -№3.02. - P.1-7.
http://dx.doi.org/10.26787/nydha-2226-7425-2018-20-4-88-92
ELABORATING AND VALIDATING THE METHOD OF QUANTITATIVE ASSESSMENT OF THE CONTENT OF TRITERPENE SAPONINS IN DRY EXTRACT OF PERICARP (STYRAX OFFICINALIS L)
Hamama Z., Ivlev V.A., Suslina S.N., Lazar S.
RUDN University, Moscow, Russian Federation
Annotation. According to Russian pharmacopoeia XIII (1.2.1.1.0007.15), quantitative NMR-H1 spectroscopy is considered to be a reliable method for determining concentration of medicinal substances with the absence of a standard by using signals of any calibration compound introduced into the analyte in a known concentration. Historically, plants are sources of pharmaceutical substances, while their chemical production is more expensive and complex process, requiring expensive equipment, special conditions and highly qualified personnel. Despite the great variety of plants in Syria, only a few pharmaceutical substances are isolated from plant raw materials and fewer drugs are made based on plant substances, although isolation and local production of these kinds of medicines are simple and inexpensive. The purpose of this work is developing a methodology for the quantitative determination of triterpene saponins in a dry extract of the pericarp of the Styrax officinalis L., growing in Syria. The research requires the development of new quality control analytical method of the obtained pharmaceutical substance, which required validation. The performed validation demonstrates that the method of quantitative determination of saponins in a dry extract by NMR spectroscopy is suitable and corresponds to the established eligibility criteria.
Key words: Styrax officinalis L., saponins, extraction standardization, validation, NMR1-H spectroscopy.
REFERENCES
[1] Bock B. Référentiel des trachéophytes de France métropolitaine/ B. Bock et al// eFlore, la flore électronique de Tela Botanica- 2016. -№3.02. - P.1-7.
2 Mohd J. Pharmacological scientific evidence for the promis of Tribulus terrestris/ J. Mohd et al// International Research Journal of Pharmacy-2012-3- P.403-406.
[3] Tayoub G. Composition of volatile oils of Styrax (Styrax officinalis L.) leaves at different phenological stages / G. Tayoub, I. Schwob et al// Biochemical Systematics and Ecology- 2006. - № 34. - P.705-709.
[4] Yayla Y. Saponins from Styrax officinalis/ Y. Yayla, O. Alankus-Caliskan et al// Fitoterapia- 2002. - №73. -P.320-326.
[5] Хамама З. Разработка технологии получения сухого экстракта из околоплодников Styrax officinalis L. методом циркуляционной экстракции./ З. Хамама, Хомик А.С., Суслина С.Н. и др.// Сборник научных трудов по итогам IV Международной научно-практической кон-ференции-Актуальные проблемы и достижения в медицине.- Самара.- 2017.- С. 110-113.
[6] Хамама З. Фармакогностическое изучение околоплодников Styrax officinalis L./ З. Хамама, Хомик А.С., Суслина С.Н.// Сборник V научно-практической конфе-ренции-Современные аспекты использования растительного сырья и сырья природного происхождения в
_медицине.- Москва.- 2017.- С. 232-235._
[2] Mohd J. Pharmacological scientific evidence for the promis of Tribulus terrestris/ J. Mohd et al// International Research Journal of Pharmacy-2012.-3- P.403-406.
[3] Tayoub G. Composition of volatile oils of Styrax (Styrax officinalis L.) leaves at different phenological stages / G. Tayoub, I. Schwob et al// Biochemical Systematics and Ecology- 2006. - № 34. - P.705-709.
[4] Yayla Y. Saponins from Styrax officinalis/ Y. Yayla, O. Alankus-Caliskan et al// Fitoterapia- 2002. - №73. -P.320-326.
[5] Hamama Z. Development technology of obtaining a dry extract from the pericarp of Styrax officinalis L. by circulation extraction. / Z. Hamama, Khomik A.S., Suslina S. N. et al. // Collection of scientific works of the IV International Scientific and Practical Conference-Actual problems and achievements in medicine. - Samara. - 2017.- p. 110113.
[6] Hamama Z. Pharmacognostic study of the pericarp of Styrax officinalis L./ Z. Hamama, Khomik A.S., Suslina S.N. // Collection of the V scientific-practical conferenceModern aspects of the use of plant raw materials and raw materials of natural origin in medicine. - Moscow. - 2017.-p. 232-235._
Стиракс лекарственный - невысокое дерево (4-6 метров) широко распространённое в восточных странах Средиземноморья, в Италии, Греции, Турции, Сирии и Палестине [1]. Дерево цветет в конце весны. Плоды созревают в сентябре-ноябре [3]. В плодах стиракса лекарственного содержатся тритерпеновые сапонины. В 2002 году Yayla et а1. [4] опубликовал исследование о выделении и идентификации сапони-нов-стиракса (А, В, С и деацил сапонина стиракса) из околоплодников стиракса лекарственного. Их структура была изучена с помощью ЯМР и масс-спектрометрии.
Сапонин стиракса А является аморфным порошком с молекулярной формулой С61Н96027. Структура сапонина А была установлена, как (22-0-асе!у1- 21-О- %1у13- О- [а- L- rhamnopyranosy1 (1—2)- в- D-g1actopyranosy1 (1^-2)]-[Р-Э^1исоругапо5у1 (1—^4)]-р-D-g1ucuronopyranosy1barringtogeno1 С).
Сапонин стиракса В был выделен в виде аморфного порошка. Сапонин В имеет на 22 массовые единицы больше, чем сапонин А. Молекулярная формула сапонина В - С63Н94О27. Структура сапонина В была установлена, как (22-O-acety1-21-O-benzoy1-3-O-[а-L-rhamnopyranosy1 (1—2)-P-D-ga1actopyranosy1 (1—2)]-[P-D-g1ucopyranosy1 (1—4)]-р^-
g1ucuronopyranosy1barringtogeno1 С).
Сапонин стиракса С имеет молекулярную формулу С62Н98О27 и структуру (22-O-acety1-21-O-(2-hexenoy1)-3-O-[а-L-rhamnopyranosy1 (1—2)-в-
Dga1actopyranosy1 (1—2)]-[P-D-g1ucopyranosy1(1 —4)] -P-D-g1ucuronopyranosy1 barringtogeno1 С) стиракс-сапонины (А, В, С) и стиракс-деацил сапонин (Рис.1) [4]. Тритерпеновые сапонины являются естественными поверхностно-активными веществами, чем и обусловлены их биологические свойства: антибактериальное, фунгицидное, гипохолестеринемическое и др. [2].
стиракс сапонин А
стиракс сапонин В
стиракс сапонин С диацил сапонин
Рис. 1. Структура стиракс-сапонинов (А, В, С) и стиракс-диацил сапонина
В разных опубликованных работах [5, 6] были проведены исследования по разработке технологии получения сухого экстракта из околоплодников Styrax officinalis L. и подбору оптимальных условий экстрагирования. Сухой очищенный экстракт околоплодников стиракса лекарственного - аморфный порошок от светло-кремового до кремового цвета с серым оттенком, со специфическим запахом. Проведенное нами исследование (реакция Либермана-Бурхарда, реакция гемолиза эритроцитов и реакция пенообразования) было доказано наличие сапонинов.
Цель работы заключается в разработке и валида-ции методики количественного определения тритер-пеновых сапонинов в сухом экстракте околоплодников стиракса лекарственного (Styrax officinalis L.) с помощью ЯМР1-Н.
Материалы и методы. В ходе исследований была использована методика ЯМР1-Н для количественного определения сапонинов в сухом экстракте. Исследование проводились на ЯМР спектрометрах (JEOL, Япония) «Jeol JNM-ECA 600» и «Jeol JNM-ECS 400», на базе Центра коллективного пользования ЦКП (НОЦ) РУДН. Методика оценивалась по валидацион-ным характеристикам: специфичность, сходимость, точность и воспроизводимость. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью статистического пакета программы «Ехсе1».
Результаты и обсуждение. Проведен анализ сухого экстракта стиракса лекарственного на содержание сапонинов методом количественной спектроскопии ЯМР1Н. Для анализа взяли 46,3 мг экстракта, добавили 1 мл DMSO-d6, встряхивали в течение 1 минуты, центрифугировали в течение 5 минут при 14000 об/мин. Раствор перенесли в стандартную ампулу для ЯМР d=5 мм. Регистрировали спектр ЯМР1Н при следующих условиях: 90° импульс, смещение 5 м.д., развертка 15 м.д., 32 К точек на спектр, 32 повторения, задержка между импульсами 40 с. Определение содержания сапонинов проводили сравнением интегральной интенсивности откалиброванного по остаточному содержанию протонсодержащего изотопоме-ра DMSO-d6, и сигналов сапонинов, описанных в ста-
тье Y. Yayla et а1. (2002 г.) [4]. Условия регистрации спектра ЯМР:Н сапонинов образца были такими же, как и для стандартного образца в статье.
В качестве реперного сигнала для сапонина В был выбран сигнал при 5.94 м.д., для сапонинов А и С выбрана совокупность сигналов в области 5.70-5.8 м.д. Сигналов деацилсапонина, не перекрывающихся другими сигналами, не обнаружено. В результате получено содержание сапонина В=2,7±0,1 мг (5,8±0,21%), суммы сапонинов А и С=10,4±0,21 мг (22,5±0,45%) (Рисунок 2). Содержание сапонинов А, В, С в образцах сухого экстракта стиракса лекарственного составило от 27,5 до 30%.
Проведенная валидация показала, что методика количественного определения сапонинов в сухом экстракте с помощью ЯМР- спектроскопии пригодна и соответствует заложенным критериям приемлемости.
Валидацию проводили по следующими аналитическими параметрам:
Специфичность - способность методики однозначно оценивать активные вещества (сапонины стиракса) в присутствии других компонентов, которые могут присутствовать в образце.
Критерии приемлемости и их оценки:
1- Примесные соединения: (А) должны отсутствовать пики, которые мешают определению анализируемых веществ. Оценка критерия: на хроматограмме -ЯМР1Н суммы сапонинов стиракса нет никаких сигналов мешающих определению пиков сапонинов стиракса А, В, С. Б) На хроматограмме образца сапонинов не должно быть пиков, принадлежащих растворителю и имеющих такое же удерживание.
Оценка критериев была достигнута при использовании сухого экстракта сапонинов и DMSO-d6 в качестве растворителя для подготовки образцов для ЯМР1Н.
2- Содержание основных веществ: интенсивность сигналов спектра ЯМР1Н испытуемого образца, должна соответствовать интенсивности сигналов стандартного спектра ЯМР1Н.
JU
и
Рис. 2. Спектр ЯМР *Н сухого экстракта стиракса лекарственного
Оценка критерия: на хроматограмме образца сапонинов, сигналы в области 5,41-5,74 и при 5,73 соответствуют сапонинам стиракса 1 (А) и 3 (С). Сигналы при 5,73 соответствуют сапонину стиракса 2 (В). Условия регистрации стандартного спектра ЯМР1Н (Y. Yayla et al. / Fitoterapia 73 (2002) 320-326) были такими же, как и для наших образцов (1Н, 500 и 125 MHz, DMSO-d6).
Сходимость - критерий сходимости характеризует прецизионность методики при ее выполнении в одних и тех же условиях с одним и тем же аналитиком в течение небольшого промежутка времени. В течение
одного дня, один лаборант-исследователь проводил 5 измерений количественного содержания сапонинов в экстракте для одного и того же образца с помощью ЯМР-1Н.
Критерии приемлемости и их оценки. Относительное стандартное отклонение (8Г%) при оценке сходимости полученных результатов определения содержания сапонинов стиракса в сухом экстракте должно быть <5% (а=0,05).
Результаты определения количественного содержания сапонинов стиракса и их статистической обработки представлены в таблице 1.
Таблица 1
Математические обработки результатов измерений и испытания сходимости методики
№ образца XI 1 2 3 4 5
Массовое содержание сапонинов стиракса в сухом экстракте, % 28,3 29,1 29,4 28,7 29,3
Х-среднее массовое содержание сапонинов стиракса в сухом экстракте, % 28,96
(х{ - х)2 0,435 0,019 0,193 0,067 0,115
Стандартное отклонение S Л 0,829 = 0,455 4
Относительное стандартное отклонение Sr% 0,455 -^——х 100 = 1,571 28,96
Приемлемость результатов Sr% < 5 ^ удовлетворяет требованиям
Точность - методика количественного определения сапонинов в сухом экстракте должна обеспечивает требуемую точность оценки показателей. Для определения точности методики готовили 5 параллельных образцов и проводили количественное определение сапонинов в сухом экстракте методом ЯМР 1Н.
Критерии приемлемости и их оценки. Относительное стандартное отклонение ^г%) при оценке точно-
сти полученных результатов определения содержания сапонинов стиракса в сухом экстракте должно быть <5% (а=0,05).
Результаты определения количественного содержания сапонинов стиракса в 5 параллельных образцов и их статистической обработки представлены в таблице 2.
—--—
Журнал включен в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК
~ 91 ~
Таблии 2
Математические обработки результатов измерений и испытания точности методики
№ образца X! 1 2 3 4 5
Массовое содержание сапонинов стиракса в сухом экстракте, % 30,4 30,1 29,3 28,3 29,7
х-среднее массовое содержание сапонинов стиракса в сухом экстракте, % 29,56
О; - х)2 1,587 0,291 0,705 0,019 0,067
Стандартное отклонение 8 Л 2,669 -= 0,816 4
Относительное стандартное отклонение 8г% 0,816 -X 100 = 2,7 29,3
Приемлемость результатов Sr% < 5 ^ удовлетворяет требованиям
Воспроизводимость результатов анализов отражает близость результатов измерений, выполняемых в различных условиях по данной методике. Например в различное время, в различных местах или на различных приборах.
Для определения воспроизводимости нашей методики проводили анализ количественного определения сапонинов стиракса из одного и того же образца на двух разных ЯМР-спектрометрах, <^ео1 ЖМ-ЕСА 600» и <^ео1 ЖМ-ЕС8 400».
Математическая обработка результатов измер
Критерии приемлемости и их оценки: Относительное стандартное отклонение (8г%) при оценке воспроизводимости полученных результатов определения содержания сапонинов стиракса в сухом экстракте должно быть <5% (а=0,05).
Результаты определения количественного содержания сапонинов стиракса на двух разных ЯМР-спектрометрах и их статистическая обработка представлены в таблице 3.
Таблица 3
ий и испытания воспроизводимости методики
ЯМР-спектрометр Jeol JNM -ECA 600 Jeol JNM -ECS 400
Массовое содержание сапонинов стиракса в сухом экстракте, % 29,4 30,1
х-среднее массовое содержание сапонинов стиракса в сухом экстракте, % 29,75
Стандартное отклонение 8 0,494
Относительное стандартное отклонение 8г% 0 494 .Hllx 100 =1,66 29,75
Приемлемость результатов Sr% < 5 ^ удовлетворяет требованиям
Вышеуказанные тесты подтверждают достоверность данной методики для количественного определения сапонинов в сухом экстракте с помощью ЯМР-1Н.
Выводы. Разработана и валидирована методика установления подлинности и количественного опре-
деления сапонинов стиракса лекарственного с помощью ЯМР - Н1. При изучении состава сухого экс-тракста околоплодников стиракса лекарственного по ЯМР-спектру установлено, что экстракт содержит сумму сапонинов - от 27,5 до 30%.
