CC BY
105
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ НАУКИ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 615.322:547.972.2].074(571.15)
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММЫ ГИДРОКСИКОРИЧНЫХ КИСЛОТ В ЭКСТРАКТЕ СБОРА ОДУВАНЧИКА ЛЕКАРСТВЕННОГО ТРАВЫ И ЛОПУХА БОЛЬШОГО ЛИСТА СУХОМ © Чистова Ю.И.
Алтайский государственный медицинский университет, Россия, 656038, Барнаул, пр. Ленина, 40
Резюме
Цель. Определение количественного содержания суммы гидроксикоричных кислот в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом.
Методика. Объект исследования - экстракт сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухой, полученный методом ремацерации, экстрагент - вода очищенная, соотношение «сырье/экстрагент» - 1/10. Количественное определение суммы гидроксикоричных кислот в экстракте определяли методом спектрофотометрии.
Результаты. В результате исследований установлено, что экстракт сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухой содержит 5,43-7,51% гидроксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту. Проведена валидационная оценка спектрофотометрического метода определения количественного содержания суммы гидроксикоричных кислот по показателям: специфичность, линейность, аналитическая область, прецизионность, правильность.
Выводы. Содержание гидроксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом составляет от 5,43 до 7,51%. Проведена валидация методики количественного определения гидроксикоричных кислот в экстракте сбора сухом. Методика является валидной и может применяться для определения количественного содержания суммы гидроксикоричных кислот в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом.
Ключевые слова: экстракт, одуванчик лекарственный, лопух большой, сбор, хлорогеновая кислота
QUANTITATIVE DETERMINATION OF THE SUM OF HYDROXYCINNAMIC ACIDS IN THE DRY EXTRACT OF DANDELION HERB AND LARGE BURDOCK LEAF SPECIE Chistova Yu.I.
Altai State Medical University, 40, Lenina St., 656038, Barnaul, Russia
Abstract
Objective. To determine the quantitative content of hydroxycinnamic acids in the dry extract of dandelion herb and large burdock leaf specie.
Methods. The object of study is the dry extract dandelion medicinal herb and burdock large leaf, obtained by the method of rematseration, the extractant - purified water, the ratio "raw material/extractant" is 1/10. Quantitative determination of the amount of hydroxycinnamic acids in the extract were held by spectrophotometry.
Results. As a result of the research, it was established that the dry extract of dandelion medicinal herb and burdock large leaf contains 5,43-7,51% hydroxycinnamic acids in conversion to chlorogenic acid. A validation evaluation of the spectrophotometric method for determining the quantitative content of the sum of hydroxycinnamic acids were carrying out by the following indicators: specificity, linearity, analytical rage, precision, accuracy.
Conclusions. The content of hydroxycorenic acids in conversion to chlorogenic acid in the dry extract of dandelion medicinal herb and burdock large leaf was 5,43 to 7,51%. The method of quantitative determination of hydroxycinnamic acids in the dry extract were validated. The method is valid and can be
used to determine the quantitative content of the sum of hydroxycorenic acids in the dry extract of specie of dandelion medicinal herb and burdock large leaf.
Keywords: extract, dandelion, burdock, specie, chlorogenic acid
Введение
Нами разработана технология получения экстракта сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухого методом ремацерации, экстрагентом является вода очищенная, соотношение «сырье/экстрагент» - 1/10 [7, 8]. Необходимо провести стандартизацию экстракта сбора сухого для разработки проекта нормативной документации. В ходе изучения фитохимического состава экстракта сбора сухого установлено наличие фенольных соединений: гидролизуемые и конденсированные дубильные вещества, гидроксикоричные кислоты, флавоноиды. Проведенные исследования по изучению специфической активности установили наличие противовоспалительного эффекта у экстракта сбора на модели острого и хронического воспаления. Данный эффект, по-видимому, объясняется наличием комплекса гидроксикоричных кислот [3, 6, 9].
Цель - определение количественного содержания суммы гидроксикоричных кислот в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом.
Методика
Объектом исследования является экстракт сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухой, полученный методом ремацерации, экстрагент - вода очищенная, соотношение «сырье/экстрагент» - 1/10.
Содержание гидроксикоричных кислот находили методом спектрофотомерии [4]. 0,5 г экстракта сбора сухого растворяли в 100 мл спирта этилового 70%, раствор фильтровали. 2 мл полученного раствора помещали в мерную колбу на 25 мл, доводили до метки спиртом этиловым 70%. Оптическую плотность данного раствора измеряли на спектрофотометре «Schimadzu UV-mini 1240» при длине волны 329 нм. Толщина рабочего слоя кюветы - 1 см.
Количественное содержание гидроксикоричных кислот определяли в пересчете на хлорогеновую кислоту. Определение проводили в пяти сериях экстракта в пяти повторениях. Статистическую обработку результатов проводили в соответствии с требованиями ГФ XIII 0ФС.1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов эксперимента» [5]. Затем проводили валидацию спектрофотометрической методики количественного определения гидроксикоричных кислот в соответствие с 0ФС.1.1.0012.15 «Валидация аналитических методик». Оценивали параметры: специфичность, линейность, аналитическая область методики, правильность, прецизионность [5].
Для определения специфичности готовили спиртовой раствор экстракта сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа и раствор стандартного образца хлорогеновой кислоты («Сигма-Алдрич Рус», каталожный номер - С3878). Полученные растворы исследовали методом спектрофотометрии. Регистрацию спектров проводили в диапазоне от 200 до 500 нм. Сравнивали спектральные характеристики исследуемого экстракта сбора и стандартного образца.
Для определения линейности готовили серию разведений: в мерные колбы на 25 мл помещали по 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0 мл спиртового раствора экстракта сбора, доводили объем до метки раствором этилового спирта 70%. Измеряли оптическую плотность полученных растворов. Составляли уравнение регрессии и рассчитывали коэффициент корреляции. Аналитическую область методики находили по интервалу экспериментальных данных, полученных и удовлетворяющих линейную модель.
Для оценки правильности методики из спиртового раствора экстракта сбора готовили разведение: 1/1; 1/1,5; 1/2. Определяли количественное содержание гидроксикоричных кислот, рассчитывали открываемость (R, %) и относительное стандартное отклонение (RSD, %).
Презиционность оценивалась по критерию повторяемости (сходимости) и воспроизводимости. Для определения повторяемости готовили 6 спиртовых растворов экстракта сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа. Определяли количественное содержание гидроксикоричных кислот в исследуемых растворах в соответствии с методикой, описанной выше. Определение проводили в одной лаборатории, в одинаковых условиях, в короткий промежуток времени. Рассчитывали относительное стандартное отклонение (RSD, %).
Воспроизводимость определяли 2 исследователя на 3-х образцах в трёх повторениях по валидируемой методике. Рассчитывали относительное стандартное отклонение (RSD, %).
171
Результаты исследования и их обсуждение
На первом этапе исследования по описанной методике снимали УФ-спектры поглощения спиртового раствора экстракта сбора и стандартного раствора хлорогеновой кислоты в диапазоне 200-500 нм. Установлено, что максимумы спектров имеют одинаковые спектральные характеристики. Максимум при длине волны 329 нм и плечо при 295 нм, что также согласуется с рядом литературных источников [1, 4, 6]. Таким образом, преобладающим соединением в экстракте сбора является хлорогеновая кислота, поэтому расчет содержания гидроксикоричных кислот проводили в пересчете на хлорогеновую кислоту при длине волны 329 нм (рис. 1).
1 г
О,8 г
[
0,6 г
:
:
0,4 :
Е
:
0,2 -
|
о :
200 ЗОО 400 500
Рис. 1. Спектры поглощения СО хлорогеновой кислоты (1) и спиртового раствора экстракта сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа (2)
Далее проводили определение содержания суммы гидроксикоричных кислот в 5 сериях экстракта сбора сухого в пересчете на хлорогеновую кислоту методом спектрофотометрии. Выбор данного метода обусловлен тем, что область поглощения 325-330 нм наиболее часто используется для прямого спектрофотометрического определения гидроксикоричных кислот в растительных экстрактах [1, 2]. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1. Результаты количественного определения суммы гидроксикоричных кислот в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом
Серия № Содержание гидроксикоричных кислот (%) (п=5, P=95%, tp=2,78)
х ±Д х Sx £, %
1 5,43±0,09 0,0437 1,57
2 7,51±0,10 0,0525 1,37
3 5,88±0,08 0,0417 1,39
4 7,23±0,08 0,0424 1,15
5 6,93±0,09 0,0442 1,25
В результате исследования установлено, что экстракт сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухой содержит 5,43-7,51% гидроксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту.
Для валидации методики количественного определения суммы гидроксикоричных кислот в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом оценивали следующие показатели: специфичность, линейность, аналитическая область, правильность, прецизионность в соответствии с требованиями ОФС.1.1.0012.15 [5].
Специфичность оценивали путем сравнения спектров спиртового раствора экстракта сбора и стандартного образца хлорогеновой кислоты. Регистрацию спектров проводили в диапазоне 200500 нм. Критерием приемлемости специфичности является способность однозначно определять анализируемое соединение в присутствии других соединений, содержащихся в исследуемом образце. В данном случае, это совпадение максимумов поглощения спектров хлорогеновой кислоты и раствора экстракта сбора. Полученные спектры имеют максимумы поглощения при длине волны 329 нм (рис. 1). Это подтверждает специфичность валидируемой методики.
При определении линейности в мерные колбы на 25 мл отбирали аликвоты спиртового раствора экстракта сбора, соответствующие 50 (1 мл), 75 (1,5 мл), 100 (2,0 мл), 125 (2,5 мл), 150% (3,0 мл) от номинального содержания гидроксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту, что позволяло получить аналитические сигналы в интервале значений, используемых в спектрофотометрических измерениях. Доводили объем до метки спиртом этиловым 70%. Определяли количественное содержание гидроксикоричных кислот. Строили график зависимости оптической плотности от количественного содержания гидроксикоричных кислот (рис. 2).
Анализ полученных данные проводили методом наименьших квадратов с использованием линейной модели (у=Ьх+а, где у - величина отклика, Ь - угловой коэффициент, х - количество определяемого соединения, а - свободный член) и рассчитывали коэффициент корреляции (Я). Если величина данного коэффициента близка к единице, то совокупность полученных данных можно описать прямой линией.
1,8
1,6
< 1,4
л ь-
о
2 1,2 I-
о с
3£ О О
г о,8
0,6 0,4
у = 0,210х + 0,0001 = 0,9999
8.2549; 1,7332
6,9370; 1,4565
5,3396; 1,1211
4,0912; 0,8590
2,6667; 6,5599
Содержание гидроксикоричных кислот, %
Рис. 2. График зависимости оптической плотности от содержания гидроксикоричных кислот в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом
Из данных рис. 2 видно, что экспериментальные точки лежат на одной прямой линии. Коэффициент корреляции равен 0,9999 и приближается к единице, что свидетельствует о линейной зависимости оптической плотности от концентрации гидроксикоричных кислот в исследуемых растворах экстракта сбора. Полученная зависимость аппроксимируется уравнением прямой у=0,210х+0,0001. Таким образом, полученные результаты, свидетельствуют о том, что методика линейна в диапазоне применяемых концентраций.
Критерием для оценки аналитической области методики является интервал от 80 до 120% от номинального значения определяемой концентрации. В данном случае, аналитическую область оценивали по диапазону данных, полученных при оценке линейности. Таким образом, аналитическая область методики находится в пределах от 50 до 150%, что удовлетворяет критерию приемлемости.
Для определения правильности из спиртового раствора экстракта сбора готовили модельные разведения на 3 уровнях концентрации, соответствующих 100, 150, 200% от номинальной концентрации гидроксикоричных кислот в испытуемом растворе. Для этого в колбы на 25 мл помещали по 2,0; 3,0; 4,0 мл раствора экстракта сбора. Доводили объем до метки спиртом этиловым 70%. В каждом разведении проводили определение содержания гидроксикоричных кислот в трех повторениях (табл. 2).
Критерием приемлемости является средний % открываемости при использовании растворов заданной концентрации, скорректированный на 100%. Его величина должна находиться в пределах 100±5%, а величина относительной ошибки среднего результата для спектрофотометрических методов не должна превышать 2%. В результате исследований значение открываемости составило 99,59%, предел окрываемости равный 97,6-102,9%, относительная ошибка среднего результата 1,6%. Полученные данные указывают на высокую степень
соответствия между значениями расчетного и полученного содержания гидроксикоричных кислот в исследуемых образцах.
Таблица 2. Результаты оценки правильности методики количественного определения гидроксикоричных кислот в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом_
№ Разведение модельной смеси Расчетное содержание Полученное содержание Открываемость, Метрологические
п/п гидроксикоричных кислот, % гидроксикоричных кислот, % % характеристики
1 5,33 99,8
2 1/1 5,34 5,21 97,6
3 5,30 99,3 х = 99,59 %, 8 = 1,59 е = 1,24 % ИЗБ = 1,60 %
1 2 3 1/1,5 8,01 7,92 8,25 7,99 98,9 102,9 99,7
1 10,77 100,8
2 1/2 10,68 10,45 97,8
3 10,63 99,5
Прецизионность методики оценивали по критериям повторяемости (сходимости) и вопсроизводимости. Повторяемость (сходимость) методики определяли в шести повторениях в одном образце экстракта сбора в короткий промежуток времени одним исследователем (табл. 3). Критерий приемлемости выражается величиной относительного стандартного отклонения (ИЗБ, %), которое не должно превышать 2%.
Таблица 3. Результаты оценки повторяемости (сходимости) методики количественного определения гидроксикоричных кислот в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом_
Навеска, г Оптическая плотность Содержание гидроксикоричных кислот, % Метрологические характеристики
0,5023 1,1211 5,34 Р=95%, п=6, 1р=2,57, х ±Дх =5,43±0,09 8=0,08 е=1,66% Я8Б=1,58%<2%
0,5195 1,2032 5,45
0,5148 1,1469 5,33
0,5168 1,1968 5,54
0,5067 1,1649 5,50
0,5096 1,1481 5,39
В результате оценки повторяемости относительное стандартное отклонение составило 1,58%, что не превышает критерий приемлемости для спектрофотометрических методов. Это свидетельствует о прецизионности методики в условиях повторяемости.
Воспроизводимость оценивали по результатам определения содержания гидроксикоричных кислот в 3 образцах 2 исследователями (табл. 4). Рассчитывали относительное стандартное отклонение (ИЗБ, %), которое не должно превышать 2%. При оценке воспроизводимости значение относительного стандартного отклонения составило 1,78%. Из этого следует, что методика количественного определения гидроксикоричных кислот удовлетворяет требованию по прецизионности в условиях воспроизводимости.
Таким образом, подтверждены валидационные характеристики представленной методики по критериям - специфичность, линейность, аналитическая область, прецизионность, правильность. Методика является валидной и может применяться для определения количественного содержания суммы гидроксикоричных кислот в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом.
Таблица 4. Результаты оценки воспроизводимости методики количественного определения гидроксикоричных кислот в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом
Определение воспроизводимости
Повторность Исследователь Содержание гидроксикоричных кислот, % (P = 95%, n = 6, tp = 2,57)
Образец 1 Образец 2 Образец 3
1 1 5,51 7,65 6,81
2 1 5,34 7,54 6,98
3 1 5,46 7,35 6,75
4 2 5,41 7,43 6,86
5 2 5,39 7,56 7,02
6 2 5,44 7,71 6,91
Среднее значение 5,43 7,54 6,89
Относительное стандартное отклонение, RSD (%) 1,09 1,78 1,48
Выводы
1. Содержание гидроксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом составляет от 5,43 до 7,51%.
2. Проведена валидация методики количественного определения гидроксикоричных кислот в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа по показателям: специфичность, линейность, аналитическая область, правильность, прецизионность. Доказано, что методика является валидной и может применяться для определения количественного содержания суммы гидроксикоричных кислот в экстракте сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухом.
Литература (references)
1. Абрамова А.И., Калинкина Г.И., Чучалин В.С. Разработка методики количественного опредления фенольных соединений в желчегонном сборе №2. // Химия растительного сырья. - 2011. - №4. - С. 265268. [Abramova A.I., Kalinkina G.I., CHuchalin V.S. Khimija Rastitel'nogo Syr'ja. Chemistry of plant raw material. - 2011. - N4. - P. 265-268. (in Russian)]
2. Адиходжаева К.Б. Хроматоспектрофотометрический метод определения суммы фенилкарбоновых кислот в препарате танацин и соцветиях пижмы обыкновенной // Химико-фармацевтический журнал. -1979. - №5. - С. 113-115. [Adihodzhaeva K.B. Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal. Pharmaceutical Chemistry Journal. - 1979. - N5. - P. 113-115. (in Russian)]
3. Бельтюкова С.В., Бычкова А.А. Биологически активные полифенолы и методы их определения // Пищевая наука и технология. - 2013. - №3. - С. 18-25. [Bel'tyukova S.V., Bychkova A.A. Pishchevaya nauka i tekhnologiya. Food science and technology. - 2013. - N3. - P. 18-25. (in Russian)]
4. Бубенчикова В.Н., Левченко В.Н. Разработка и валидация методики количественного определения суммы гидроксикоричных кислот в траве хондриллы ситниковидной // Научные ведомости белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. - 2015. - №16(213). - С. 168-173. [Bubenchikova V.N., Levchenko V.N. Nauchnye vedomosti belgorodskogo gosudarstvennogo universiteta. Seriya: Medicina. Farmaciya. Belgorod State University Scientific Bulletin Medicine Pharmacy. -2015. - N16(213). - P. 168-173. (in Russian)]
5. Государственная фармакопея Российской Федерации XIII издание. М., 2015. - Т.1. - 1470 с. - 31.01.19. URL:http://193.232.7.120/feml/clinical_ref/pharmacopoeia_1_html/HTML/#1/z [Russian Federation State Pharmacopoeia XIII ed. M., 2015. - V.1. - 1470 p. - 31.01.19. URL:http://193.232.7.120/feml/ clinical_ref/pharmacopoeia_1_html/HTML/#1/z (in Russian)]
6. Лекарь А.В., Филонова О.В., Борисенко С.Н. и др. Разработка способа экстракции хлорогеновой кислоты из зерен зеленого кофе в среде субкритической воды // Сверхкритические Флюиды: Теория и Практика. -2014. - №3. - С. 21-27. [Lekar' A.V., Filonova O.V., Borisenko S.N. i dr. Sverkhkriticheskie Flyuidy: Teoriya i Praktika. Supercritical Fluids: Theory and Practice. - 2014. - N3. - P. 21-27. (in Russian)]
7. Федосеева Л.М., Чистова Ю.И. Разработка технологии производства экстракта сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа // Актуальные проблемы фармакологии и фармации. -
2018. - №15. - С. 100-103. [Fedoseeva L.M., CHistova YU.I. Aktual'nye problemy farmakologii i farmacii. Actual problems of pharmacology and pharmacy. - 2018. - N15. - P. 100-103. (in Russian)]
8. Чистова Ю.И. Определение оптимальных условий экстракции сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа методами математического планирования многофакторного эксперимента // Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2019. - №8(1). - С. 24-28. [CHistova YU.I. Razrabotka i registraciya lekarstvennyh sredstv. Drug development & registration. - 2019. - N8(1). - P. 24-28. (in Russian)]
9. Чистова Ю.И., Федосеева Л.М. Качественный анализ экстракта сбора одуванчика лекарственного травы и лопуха большого листа сухого // Молодежь - Барнаулу: материалы городской научно-практической конференции молодых ученых. Барнаул, 13 ноября 2017 г. - Барнаул, 2018. - С. 899-901. [CHistova YU.I., Fedoseeva L.M. Molodezh' - Barnaulu: materialy XVII-XIX gorodskoj nauchno-prakticheskoj konferencii molodyh uchenyh. Youth - Barnaul: materials of XVII-XIX municipal scientific-practical conference of young scientists. - Barnaul, 2018. - P. 899-901. (in Russian)]
Информация об авторе
Чистова Юлия Игоревна - аспирант кафедры фармации ФГБОУ ВО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздрава России. E-mail: juls.chistova@mail.ru
