CC BY
12DOI: 10.24412/1999-6780-2023-2-65-68 УДК 632.937.155
Для цитирования: Кумпан Л.В., Абрамова Н.В., Штрек С.В., Рудаков Н.В., Самойленко И.Е., Решетникова Т.А., Шпынов С.Н., Матущен-ко Е.В. Разработка и получение антигенных препаратов для диагностики клещевых риккетсиозов. 2023; 25 (2): 65-68. DOI: 10.24412/19996780-2023-2-65-68
For citation: Kumpan L. V., Abramova N. V., Shtrek S. V., Rudakov N. V., Samoylenko I.E., Reshetnikova T.A., Shpynov S.N., Matushchenko E. V. Development and production of antigenic drugs for the diagnosis of tick-borne rickettsioses. Problems in Medical Mycology. 2023; 25 (2): 65-68. (In Russ). DOI: 10.24412/1999-6780-2023-2-65-68
РАЗРАБОТКА И ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ КЛЕЩЕВЫХ РИККЕТСИОЗОВ
1,2Кумпан Л.В. (доцент)*, 12Абрамова Н.В. (доцент), 1,2Штрек С.В. (доцент), 12Рудаков
H.В. (зав. кафедрой), 2Самойленко И.Е. (в.н.с.), 2Решетникова Т.А. (с.н.с.), 12Шпынов С.Н. (профессор), 12Матущенко Е.В. (доцент)
'Омский государственный медицинский университет; 2Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций, Омск, Россия
Целью работы была разработка диагностических препаратов на основе использования биологических моделей (культур клеток) коллекционных штаммов риккетсий и их использование для проведения диагностических исследований при клещевыхриккетсиозах.
Ключевые слова: культура клеток, серологические методы ИФА, антитела к риккетсиям группы КПЛ
DEVELOPMENT AND PRODUCTION OF ANTIGENIC DRUGS FOR THE DIAGNOSIS OF TICK-BORNE RICKETTSIOSES
I,2Kumpan L.V. (associate professor), ^Abramova N.V. (associate professor), 1,2Shtrek S.V. (associate professor), 12Rudakov N.V. (head of the department), 2Samoylenko I.E. (leading scientific researcher), 2Reshetnikova T.A. (senior scientific researcher), 1,2Shpynov S.N. (professor),1,2 Matushchenko E.V. (associate professor)
'Omsk State Medical University;2 Omsk Research Institute of Natural Focal Infections, Omsk, Russia
* Контактное лицо: Кумпан Людмила Валерьевна, e-mail: ludmilavirus@mail.ru
The aim of the work was to develop diagnostic drugs based on the use of biological models (cell cultures) of collection strains of rickettsias and their use for diagnostic studies in tick-borne rickettsioses.
Key words: cell's culture, serological methods, enzyme immunoassay, antibodies to rickettsia of the tick-spot fever group
ВВЕДЕНИЕ
В системе эпидемиологического надзора за рик-кетсиозами существенное значение имеют лабораторные методы исследования, в том числе мониторинг штаммов возбудителей и надзор за источниками инфекции. Мониторинг риккетсий представляет сложную задачу в связи с отсутствием стандартных, достаточно чувствительных и специфичных методов их индикации и идентификации. Совершенствование эпидемиологического надзора за риккетсиозами требует дальнейшего изучения этиологической роли риккетсий как хорошо известных, так и новых, что в значительной степени сдерживается отсутствием высокочувствительных и доступных методов серологической диагностики. Применяемые в лабораторной диагностике риккетсиозов реакция связывания комплемента (РСК) и реакция непрямой имму-нофлуоресценции (РНИФ) обладают рядом недостатков, одним из которых является невозможность идентифицировать этиологический агент. Постановка серологических реакций требует наличия набора специфических антигенов и антисывороток. Применительно к риккетсиям это связано с необходимостью накопления биомассы определенных штаммов микроорганизмов. До сегодняшнего времени широко используют биопробы на морских свинках для пассирования различных штаммов риккетсий, обладающих различной степенью вирулентности. Однако при широком распространении возбудителей со сниженной вирулентностью эта экспериментальная модель не может быть пригодной для выявления и накопления биомассы слабовирулентных штаммов риккетсий. Наиболее универсальной моделью для культивирования и накопления биомассы риккетсий является культура клеток, которая позволяет культивировать и накапливать как высоковирулентные, так
и низковирулентные штаммы риккетсий. Основой серологического изучения риккетсий (анализа антигенной структуры) является приготовление антигенов, что связано с необходимостью массового накопления возбудителя. Для повышения эффективности верификации диагноза сибирского клещевого тифа (СКТ) в последние годы в Омском НИИ при-родно-очаговых инфекций предложен непрямой твердофазный вариант иммуноферментного анализа на основе цельнорастворимого антигена. Также нами на основе полученных антигенов были получены корпускулярные слайд-антигены [1]. Подобные исследования проводят и ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» [2]. Для верификации астраханской пятнистой лихорадки была разработана экспериментальная иммуноферментная тест-система на основе инактивированных цельнорастворимых / растворимых антигенов Rickettsia conorii, накопление которых проводили в овокультурах (желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов) [3].
Иммуноферментный анализ является высокочувствительным и специфичным методом обнаружения антител к антигенам риккетсий. Применение иммуноферментного анализа (ИФА) с конъюгатами к разным типам иммуноглобулинов (IgG и IgM) позволяет дифференцировать антитела по классам иммуноглобулинов. РНИФ характеризуется высокой чувствительностью, быстротой получения результата, низкой затратой сыворотки и антигенов для проведения анализа и возможностью одновременного тестирования одного образца сыворотки с несколькими антигенами.
Цель исследования: разработка диагностических препаратов на основе использования биологических моделей (культур клеток) коллекционных штаммов риккетсий и их использование для проведения диагностических исследований при клещевых риккетсиозах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Применяли культуральные, риккетсиологиче-ские, серологические, микроскопические, статистические методы исследования. В работе были использованы риккетсиальные антигены пяти видов рик-кетсий: Rickettsia sibirica subsp. sibirica, R. raoultii, R. akarii, Candidatus R. tarasevichiae, R. heilongjiangensis.
С целью получения антигенов нами было проведено накопление биомассы риккетсий на культурах клеток Vero и Hep-2. В работе показано накопление риккетсий на примере 2-х штаммов R. raoultii: штамм «5/98-Караганда» генотип R. RpA 4, штамм «Шайман» генотип R. DnS 14, R. akari, Candidatus R. tarasevichiae, R. heilongjiangensis. Культивирование риккетсий осуществляли на протяжении 6 пассажей (срок наблюдения). За этот период у генотипов R. RpA 4 и R. DnS14 отмечали незначительные деге-
неративные изменения в обеих клеточных культурах. Из зараженной культуры клеток после каждого пассажа готовили препарат-мазок, чтобы определить уровень накопления риккетсий. При окрашивании препаратов-мазков по Здродовскому наблюдали внутриядерную локализацию риккетсий, характерную для группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ). Точно такая же локализация была выявлена в культурах клеток почечного эпителия, при заражении культур R. ттп (Кокорин И.Н. и др. «Размножение риккетсий в культурах клеток», 1963; Рыбкина Н. Н. и др. « Культивирование риккетсий в трипсинизированных клетках почечного эпителия морских свинок», 1961). Уровень накопления риккетсий исследовали методом флуоресцирующих антител по стандартной методике, используя иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие антивидовые против иммуноглобулинов человека, сухие (ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи»). Первоначально для проведения испытания 5 антигенов на полистироловых планшетах использовали 276 сывороток крови из трех групп. Первая (референтная) группа состояла из 36 больных с типичной клинической картиной клещевого риккетсиоза, госпитализированных в инфекционное отделение МУЗ «Городская больница №11 г. Барнаула». Во вторую (контрольную) группу вошли 80 клинически здоровых жителей г. Омска, обследованных вне эпидемического сезона клещевого риккетсиоза (КР). В третью (опытную) группу включили 58 лихорадящих больных Тарского района Омской области, обследованных по подозрению на клещевой энцефалит (КЭ) и иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) (Абрамова Н.В. и др. «Апробация иммуноферментного анализа для серологической диагностики инфекций, вызываемых риккетсиями группы клещевой пятнистой лихорадки», 2010). На разработанной тест-системе, несколькими годами позже, была исследована 161 сыворотка крови, полученная из районов Омской области от людей с подозрением на клещевые инфекции, имевших в анамнезе присасывание клеща или клиническую картину, схожую с риккетсиозом группы КПЛ. Из них: 24 сыворотки жителей из г. Омска, 124 - жителей из Называевского района и 13 - из Исилькульского, Большереченского, Калачин-ского районов Омской области, собранные в период с 2012 г. по 2015 г. Изучение проводили на базе «Омского НИИ природноочаговых инфекций» [4]. В РНИФ было исследовано 96 сывороток из Кемеровской области и 57 — из Омской.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В соответствии с рекомендациями Здродовского П.Ф., Голиневич Е.М. «Учение о риккетсиях и рик-кетсиозах» (1972) получены экспериментальные серии цельнорастворимых антигенов, которые испытывали в перекрестной РСК на специфичность, чувствительность. На основе цельнорастворимых антигенов была сконструирована иммуноферментная тест-система [5] для выявления антител к риккетси-ям группы клещевой пятнистой лихорадки. Исходную активность каждого из иммобилизованных антигенов проверяли в реакциях с контрольными сыворотками непосредственно после нанесения на планшет, а также через 1, 3, 6 и 12 месяцев хранения. Для апробации разработанной тест-системы использовали сыворотки пациентов трех референтных групп. Анализ активности антигенов методом ИФА показал, что наибольшей активностью обладали антигенные фракции, сорбированные на полистироле в разведении 1:4 (содержание белка — 1,24%, аминно-го азота — 0,007%) в течение 18 часов при температуре 4-10 оС, рН - 7,3 [6]. Активность этих антигенов, разведенных 1:8 и 1:16, также достаточна для выявления антител в сыворотках крови больных в титре 1:10 и 1:50 (Абрамова Н.В. и др., 2010). В ходе работы проведено сравнение результатов лабораторного подтверждения СКТ с помощью ИФА с результатами серологической верификации с использованием РСК и РНИФ. Исследование парных сывороток в РСК позволило верифицировать диагноз КР в 66,7% случаев, с помощью ИФА на и на -в 80% случаев.
Из биомассы R. raoultii штаммов «5/98-Караганда» и «Оп814-Шайман» получены корпускулярные антигены путем центрифугирования биомассы. Корпускулярные антигены изучены при исследовании в РНИФ сывороток крови, полученных из Кемеровской и Омской областей, от больных с клиническим диагнозом сибирского клещевого тифа. Результаты приведены в таблице.
Таблица
Результаты исследования в РНИФ сывороток крови, полученных от пациентов из Кемеровской и Омской областей
Кол-во исследованных сывороток Область Результаты
96 Кемеровская R. sibirica R. raouitii
Отр. Полож. /% Отр. Полож. /%
79 17/17,7±3,9 85 11/11,5±3,3
57 Омская 34 23/40,4±6,6 38 19/33,3±6,3
ВЫВОДЫ
Таким образом, проведено культивирование на культуре клеток Vero 5 штаммов риккетсий. С помощью культуры клеток нам удалось накопить достаточное количество биомассы риккетсий и получить цельнорастворимые и корпускулярные антигены для создания новых диагностических препаратов. Нами были отработаны основные параметры постановки ИФА для выявления IgM- и IgG-антител к риккетсиям группы КПЛ. Установлено, что каждый из иммобилизованных на планшеты антигенов может сохранять свою активность на уровне 85-89% от исходного, при хранении в течение 12 месяцев при температуре 4-8 °С. Для постановки диагноза СКТ наиболее приемлемо применение серологических методов, из которых наиболее чувствительным является ИФА, позволяющий выявить антитела в более ранние сроки. В связи с наличием перекрестно-реагирующих антигенных детерминант у разных видов риккетсий ни ИФА, ни РНИФ не обладают ви-доспецифичностью. Корпускулярный антиген успешно апробирован в РНИФ при исследовании сывороток крови, полученных от пациентов из Кемеровской и Омской областей, и в настоящее время используется в серодиагностике для научных целей. По нашим данным, РНИФ для исследования парных сывороток следует проводить со специфичными антигенами патогенных риккетсий, циркулирующих в данном очаге.
Результаты исследований свидетельствуют о высокой эффективности серологических методов исследования (РСК, РНИФ, ИФА) и служат обоснованием для разработки и регистрации отечественных стандартных тест-систем и их использования в лабораторной диагностике для подтверждения диагноза СКТ.
ЛИТЕРАТУРА
1. Самойленко И.Е., Рудаков Н.В., Решетникова Т.А. и др. Результаты выявления антител к риккетсиям в сыворотках крови пациентов в Омской области и Западно-Казахстанской области Республики Казахстан. Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2015; 14 (1): 36-38. [Samoylenko I.E., Rudakov N.V., Reshetnikova T.A., et al. Results of detection antibodies against rickettsiae in the blood sera at the Omsk region of Russia and the West-
Kazakhstan region of Republic Kazakhstan. Epidemiology and Vaccinal Prevention. 2015;14 (1):36-38. (In Russ.)]. doi.org/10.31631/2073-3046-2015-14-1-36-38
2. Чеканова Т.А., Костарной А.В., Кондратьев А.В., Гинцбург А.Л. Способ диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки, иммуноферментная диагностическая тест-система для его осуществления: Патент на изобретение 2726484 C1, 14.07.2020. Заявка № 2019113159 от 29.04.2019. [Chekanova T.A., Kostarnoy A.V., Kondratiev A.V., Ginzburg A.L. Method of diagnosing rickettsioses of the tick-spot fever group, enzyme immunoassay diagnostic test system for its implementation: Patent for invention 2726484 C1, 07/14/2020. Application No. 2019113159 dated 29.04.2019. (In Russ.)].
3. Чеканова Т.А., Неталиева С.Ж., Шпынов С.Н. и др. Ретроспективная серологическая диагностикариккетсиозов гркппы клещевой пятнистой лихорадки на территории высокого риска инфицирования Ricketsia conorii subsp caspia. Клиническая лабораторная диагностика. 2019; 64 (6): 354-359. [Chekanova T.A., Netalieva S.Zh., Shpynov S.N., et al. Retrospective serological diagnostics of spotted fever group rickettsioses in high risk areas of Rickettsia conorii subsp. caspia. Russian Qinical Laboratory Diagnostics. 2019; 64 (6): 354-359 (in Russ.)]. doi: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2019-64-6-354-359
4. Штрек С.В., Рудаков Н.В., Березкина Г.В и др. Апробация серологических методов для выявления антител к риккетсиям группы клещевой пятнистой лихорадки у пациентов после присасывания иксодовых клещей на эндемичных территориях Омской области. Национальные приоритеты России. 2017; 4 (26). С. 110-116. [Shtrek S.V., Rudakov N.V., Berezkina G.V., et al. Approbation of serological methods for detection of antibodies to the rikket-siae of the spotted fever group in patients after suction of tickson the endemic territories of the Omsk region. National priorities of Russia. 2017; 4 (26). pp. 110-116. (In Russ.)].
5. Кумпан Л.В., Рудаков Н.В., Самойленко И.Е. и др. Получение и экспериментальное изучение антигенов клещевых А-протеобактерий. Здоровье населения и среда обитания. 2014; 12: 36-39. [Kumpan L.V., Rudakov N.V., Samoylenko I.E., et al. Production and experimental study of tick-borne A-proteobacteria antigens. Public health and habitat. 2014; 12: 36-39 (In Russ)].
6. Рудаков Н.В., Абрамова Н.В., Пеньевская Н.А. и др. Способ лабораторной диагностики клещевого риккетсиоза с использованием иммуноферментного анализа для определения антител к антигену R.sibirica: Патент на изобретение RU2477860 C2, 20.03.2013. Заявка №2010134106/10 от 13.08.2010. [Rudakov N.V., Abramova N.V., Penevskaya N.A., et al. Method of laboratory diagnostics of tick-borne rickettsiosis using enzyme immunoassay to determine antibodies to the R.sibirica antigen: Patent for invention RU 2477860 C2, 03/20/2013. Application no. 2010134106/10 dated 13.08.2010 (In Russ.)].
Поступила в редакцию журнала 15.03.2023 Принята к печати 03.04.2023
