CC BY
14
© Коллектив авторов, 2023
Авоян Г.Э.1, Кулага О.С.1, Нечай К.О.1, Есаулова Д.Р.1, Андреев А.И.1, Андреев И.В.1, Сетдикова Н.Х.1, Швец С.М.1, Черченко Н.Г.1, Топтыгин А.Ю.1, Санков М.Н.1, Миславский О.В.1, Кофиади И. А.1, 2, Гудима Г.О.1' 3, Мартынов А.И.1, Смирнов В.В.1 4, Кудлай Д. А.1' 4, Хаитов М.Р.1, 2
Разработка и экспериментальная оценка аллергоида из пчелиного яда
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
3 Академия постдипломного образования Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России», 125371, г. Москва, Российская Федерация
4 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Высокая степень гиперчувствительности к яду пчелы медоносной, высокие показатели анафилаксии при ужалении пчелой (в РФ до 6,4 %), отсутствие в широкой аллергологической практике лечебных препаратов, позволяющих осуществлять проведение единственно эффективного и надежного метода лечения и профилактики -аллерген-специфической иммунотерапии - больным инсектной аллергией к яду пчел, позволяющей снизить или полностью исключить риск развития реакций анафилактического типа, в том числе анафилактического шока с летальным исходом, свидетельствуют об актуальности проблемы создания отечественных лечебных препаратов.
Цели работы - разработка технологии получения и экспериментальная оценка аллер-гоида из пчелиного яда.
Материал и методы. Провели очистку пчелиного яда-сырца, препаративную и аналитическую хроматографию и электрофорез в полиакриламидном геле. Для анализа примесей применяли газовую хроматографию. Провели конкурентный иммуноферментный анализ (ИФА) для определения специфических циркулирующих ^Е-антител у экспериментальных животных и человека.
Результаты. Был изготовлен аллергоид из очищенного пчелиного яда. Анализ связывания очищенного пчелиного яда, аллергена и аллергоида при конкуренции с биоти-нилированным аллергеном пчелиного яда в конкурентном реверсивном ИФА показал, что в результате обработки формальдегидом аллергоид утратил большее количество сайтов связывания для специфических ]^-антител к белкам пчелиного яда. Оценка им-муногенности аллергоида, проведенная с помощью ИФА, показала, что в сыворотках 104 иммунизированных самцов мышей спустя 1, 2, 3 и 4 нед после начала иммунизации животных определяются циркулирующие специфические ^в-антитела и наблюдается постепенный рост их уровня.
Заключение. Разработанный аллергоид обладает высокой способностью к индукции образования специфических ^в-антител, что свидетельствует о возможности его практического применения для проведения аллерген-специфической иммунотерапии.
Ключевые слова: пчелиный яд; аллерген; аллергоид; мелиттин; аллерген-специфическая иммунотерапия
Статья получена 11.04.2023. Принята в печать 15.05.2023.
Для цитирования: Авоян Г.Э., Кулага О.С., Нечай К.О., Есаулова Д.Р., Андреев А.И., Андреев И.В., Сетдикова Н.Х., Швец С.М., Черченко Н.Г., Топтыгин А.Ю., Санков М.Н., Миславский О.В., Кофиади И.А., Гудима Г.О., Мартынов А.И., Смирнов В.В., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Разработка и экспериментальная оценка аллергоида из пчелиного яда. Иммунология. 2023; 44 (3): 345-357. Б01: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-3-345-357
Для корреспонденции
Андреев Игорь Владимирович -кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории моделирования иммунологических процессов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: iva66@list.ru https://orcid.org/0000-0001-6162-6726
Финансирование. Исследование выполнено за счет средств Государственного контракта от 27.11.17 № 14. N08.11.0206 в рамках ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу».
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Вклад авторов. Все авторы внесли равный вклад в написание статьи.
Avoyan G.E.1, Kulaga O.S.1, Nechay K.O.1, Esaulova D.R.1, Andreev A.I.1, Andreev I.V.1, Setdikova N.Kh.1, Shvets M.S.1, Cherchenko N.G.1, Toptygin A.J.1 2 Sankov M.N.1, Mislavsky O.V.1, Kofiadi I.A.1 2, Gudima G.O.1 3, Martynov A.I.1, Smirnov V.V.1' 4, Kudlay D.A.1 4, Khaitov M.R.1 2
Development and experimental evaluation of the bee venom allergoid
1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation
2 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
3 Academy of Postdiplomal Education of Federal Research and Clinical Center of Specialized Types of Health Care and Medical Technology of the Federal Medical-Biological Agency, 125371, Moscow, Russian Federation
4 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. A high degree of hypersensitivity to honey bee venom, high rates of anaphylaxis when stung by a bee (in the Russian Federation up to 6.4 %), the absence of therapeutic drugs in a wide allergological practice that allow the only effective and reliable method of treatment and prevention - allergen-specific immunotherapy - for patients with insect allergy to bee venom, which allows to reduce or completely eliminate the risk of anaphylactic type reactions, including anaphylactic shock with a fatal outcome, indicate the urgency of the problem of creating medicinal products.
The aims of the study - development of technology for obtaining and experimental evaluation of the bee venom allergoid.
Material and methods. The raw bee venom was purified, preparative and analytical chromatography and electrophoresis in polyacrylamide gel were performed. The gas chromatography technique was used for the analysis of impurities. A competitive enzyme immunoassay (EIA) was performed to determine specific circulating IgE antibodies in experimental animals and human.
Results. An allergoid was made from purified bee venom. Analysis of the binding of purified bee venom, allergen and allergoid in competition with biotinylated bee venom allergen in competitive reverse EIA showed that allergoid, as a result of formaldehyde treatment, lost majority binding sites for specific IgE antibodies to bee venom proteins. Evaluation of the im-munogenicity of the allergoid using EIA, showed that in the sera of 104 immunized male mice 1, 2, 3 and 4 weeks after the start of immunization of animals, circulating specific IgG antibodies are determined and a gradual increase of its level is observed.
Conclusion. The developed allergoid has a high ability to induce the specific IgG antibodies, which indicates the possibility of its practical application for allergen-specific immunotherapy.
Keywords: bee venom; allergen; allergoid; melittin; allergen immunotherapy
Received 11.04.2023. Accepted 15.05.2023.
For citation: Avoyan G.E., Kulaga O.S., Nechay K.O., Esaulova D.R., Andreev A.I., Andreev I.V., Setdikova N.Kh., Shvets M.S., Cherchenko N.G., Toptygin A.J., Sankov M.N., Mislavsky O.V., Kofiadi I.A, Gudima G.O., Martynov A.I., Smirnov V.V., Kudlay D.A., Khaitov M.R. Development and experimental evaluation of the bee venom allergoid. Immunologiya. 2023; 44 (3): 345-57. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-3-345-357
Funding. The study was supported by State Contract No. 14.N08.11.0206 dated 11/27/17, within the framework ofthe Federal Target Program «Development of the pharmaceutical and medical industry of the Russian Federation for the period up to 2020 and beyond».
Conflict of interests. Authors declare no conflict of interests.
For correspondence
Igor V. Andreev -PhD, Senior Researcher of the Laboratory of Modeling of Immunological Processes of NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: iva66@list.ru https://orcid.org/0000-0001-6162-6726
Authors' contribution. Authors contributed equally to the writing of the article.
Введение
Аллергия на яд перепончатокрылых провоцирует стремительно развивающиеся угрожающие жизни состояния. Несмотря на то, что аллергия к яду перепончатокрылых в Российской Федерации составляет 0,4-8 % [1], этот вид аллергии не зря признан одним из наиболее опасных.
Значительную долю таких аллергий занимает сенсибилизация к яду пчелы медоносной. По числу госпитализаций, вызванных укусами, пчелы превосходят всех ядовитых существ.
Яд пчелы медоносной - это бесцветная, жгучая и очень горькая жидкость со своеобразным запахом, которая быстро высыхает на воздухе. Яд растворим в воде, в растительных маслах. Содержание сухого вещества составляет ~ 45 % [2], реакция водного раствора яда является кислой (рН 4,5-5,5). Пчелиный яд тяжелее воды, его относительная плотность - 1,08-1,13 г/см3; он содержит ряд фармакологически и биохимически активных веществ: биогенные амины (норадреналин, гиста-мин, серотонин и др.), пептиды (мелиттин, МС-пептид, секапин, минимин и др.), ферменты (фосфолипазы А2, В, гиалуронидаза, кислая и щелочная фосфатазы и др.). В развитии аллергических реакций ведущую роль играют ферменты и высокомолекулярные пептиды, такие как фермент фосфолипаза А и полипептид мелиттин.
Фермент фосфолипаза А действует на молекулы фосфолипидов (лецитинов), при этом образуется токсичное вещество - лизолецитин, который повреждает мембраны клеток, вызывает гемолиз. Фосфолипаза А ускоряет реакции отщепления остатка жирной кислоты. Фермент гиалуронидаза увеличивает проницаемость клеток кровеносных капилляров. Помимо ферментов, при разделении пчелиного яда на фракции в одной из них обнаруживают полипептиды мелиттин и апамин, которые вызывают гемолиз, сокращение гладких мышц, блокируют передачу нервного возбуждения [3].
При ужалении пчелами лиц, имеющих сенсибилизацию к яду перепончатокрылых, могут возникать острые аллергические реакции вплоть до анафилактического шока. Системные аллергические реакции выявляются у 0,8-5 % населения, что составляет 77 % аллергических реакций на яд перепончатокрылых [3-7].
Хотя, согласно существующим стандартам, терапия при ужалении остается неотложной, это не решает проблему наличия высокого риска у определенной группы людей, подверженных частым укусам пчел, таких как пчеловоды, чья профессиональная деятельность напрямую связана с контактами с этим видом перепончатокрылых. Так, среди пчеловодов аллергия к яду пчелы встречается в 15-43 % случаев, что значительно превышает распространенность данной аллергии в популяции в целом.
Для профилактики и терапии острых аллергических реакций, включая молниеносную форму развития патологического состояния, существует современная им-муномодулирующая терапия - аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ).
Зарегистрированных лекарственных препаратов (отечественного или зарубежного производства), разрешенных для проведения АСИТ, нет [1, 4-6, 10-11]. Среди разработанных препаратов на основе яда пчелы выделяют Venomil и Pharmalgen (Великобритания).
В процессе проведения АСИТ возникает проблема сохранения у пациентов риска реакций анафилактического типа при введении малых доз аллергенов. Решением такой задачи может стать аллергоид, обладающий сниженной аллергенной активностью (по сравнению с исходным аллергеном), но обладающий большей иммуногенностью, что представляется более безопасным и эффективным.
Основанием для проведения данного исследования в рамках федеральной целевой программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» является Государственный контракт № 14.N08.11.0206 от 27 ноября 2017 г.
Цели настоящего исследования - разработка технологии получения и экспериментальная оценка аллерго-ида из пчелиного яда.
Материал и методы
Получение аллергоида. Очистку пчелиного яда-сырца проводили по методике, опубликованной нами ранее [3]. Хроматографический анализ выполняли с помощью хроматографической системы среднего давления FPLC Pharmacia Biotech (Швеция). Для препаративной хроматографии использовали колонку Superdex 75 (Pharmacia Biotech, Швеция) (16 х 60, скорость потока - 1,5 мл/мин, детектирование при 280 нм, объем образца - 3,6 мл с концентрацией очищенного пчелиного яда 10,0 мг/мл). Объем одной фракции, собираемой после гель-фильтрации на коллекторе Pharmacia Biotech, составлял 6 мл. Колонка предварительно была откалибрована по белкам с известной молекулярной массой: IgG 150 кДа, бычий сывороточный альбумин 66 кДа, пероксидаза хрена 44 кДа (Pharmacia Biotech, Швеция). Для аналитической хроматографии использовали колонку Superdex 200HR (Pharmacia Biotech, Швеция) (10 х 30, скорость потока - 0,5 мл/мин, детектирование при 280 нм, объем образца - 0,2 мл).
Сенсибилизация лабораторных животных. Сенсибилизацию исследовали на мышах CBA х C57B1/6 (F1), самцы, n = 40, массой 18-20 грамм, полученные из питомника «Столбовая». Животные содержались на стандартной диете в стандартных условиях вивария ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (приказ от 12.11.2015), сертифицированными локальным комитетом по этике (Резолюция 4/17 от 13.07.2017). Животных выводили из эксперимента с помощью цервикальной дислокации.
Проводили 3-кратную подкожную сенсибилизацию мышей с интервалом 7 дней (1-е введение - 1-й день,
2-е введение - 7-й день, 3-е введение - 14-й день). Доза очищенного пчелиного яда (ОПЯ), аллергена (АН) или аллергоида (АД), вводимая подкожно одной особи, составила 20 мкг. В качестве растворителя использовали жидкость для разведения АН (Микроген, Россия). Для создания депо сенсибилизирующего вещества в организме животного использовали адъювант - гидроксид алюминия Al(OH)3 в дозе 2 мг/особь. Соотношение объемов вводимого вещества и адъюванта 1:1, на одну особь - 20 мкг ОПЯ, АН или АД в 0,1 мл жидкости для разведения АН и 2 мг Al(OH)3 в 0,1 мл PBS (Sigma Ald-rich, США), pH 7,2-7,4. Общий объем смеси, вводимой подкожно, составил 0,2 мл на одно животное. На 21-й день от начала сенсибилизации проводили забор крови у мышей для определения уровня специфических IgE.
Иммунизация лабораторных животных. В эксперименте использованы 104 особи, самцы, весом 18-22 г линии CBA х C57B1/6 (F1). Доза АН или АД, вводимая внутрибрюшинно одной особи, составила 20 мкг/мышь (группы 1 и 2) и 100 мкг/мышь (группы 3 и 4). В качестве растворителя использован PBS (Sigma Aldrich, США), рН 7,2-7,4. Для создания депо препарата в организме животного использовали адъювант -гидроксид алюминия Al(OH)3 в дозе 2 мг/особь. Соотношение объемов препарата и адъюванта 1:1, на одну особь 100 мкг АД или АН в 0,1 мл PBS и 2 мг Al(OH)3 в 0,1 мл PBS, pH 7,2-7,4. Общий объем смеси, вводимой внутрибрюшинно, на одно животное составил 0,2 мл.
Лабораторные исследования. Электрофорез в поли-акриламидном геле был проведен по методу Лэмли [10]. Содержание белка определяли по методу Лоури (метод А) [11].
Для анализа примесей использовали газовую хроматографию. Анализ проводили на газовом хроматографе Agilent7890B с пламенно-ионизационными детекторами и парофазным пробоотборником Agilent 7697A (Agilent Technologies, США), оборудованном двумя хроматогра-фическими кварцевыми капиллярными колонками DB-ALC-1 и DB-ALC-2 (Agilent Technologies, США) длиной 30 м, с внутренним диаметром 0,32 мм, толщиной фазы 1,80 мкм. Газ-носитель - азот, скорость потока газа-носителя через колонку - 7,3 мл/мин. Температура испарителя поддерживалась 140 °С. Режим программирования температуры термостата колонки: 40 °С - 4 мин. Общее время анализа - 4 мин. Ввод пробы осуществляли в режиме с делением потока (split) 1 : 5. Объем вводимой парогазовой фазы составлял 100 мкл. Температура равновесия - 80 °С, время установления равновесия -7 мин, температура проточной линии 85 °С, время нагнетания - 5 с. Детекторы - пламенно-ионизационные. Время удерживания для метанола - 0,8-0,9 мин. Время удерживания формальдегида - 1,0-1,1 мин.
Специфические IgE-антитела человека определяли с помощью конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). Постановка проводилась с использованием набора реагентов «АллергоИФА-специфические IgE» фирмы «Алкор Био» (Россия), необходимого для количественного определения в сыворотке крови человека
специфических IgE. В данном наборе сорбция монокло-нальных антител против IgE человека была проведена на твердой фазе (планшет для ИФА).
В авторской модификации (внесение исследуемого АН в конкуренции с биотинилированным АН) провели конкурентный анализ. В каждую лунку планшета было внесено по 50 мкл пулированной сыворотки лиц с высокой сенсибилизацией к исследуемому АН. Далее вносили 50 мкл исследуемого препарата в заданных количествах (10; 5; 2,5; 1,25; 0,625 мкг/лунку) и 50 мкл коммерческого биотинилированного АН. Исследуемый препарат - исследуемый АН, разведенный на PBS (Sigma Aldrich, США). В контрольную лунку были внесены только 50 мкл биотинилированного АН и 50 мкл PBS (Sigma Aldrich, США).
После выдерживания на шейкере в течение 1 ч при температуре 37 ± 3 °С 5-кратно промывали раствором для промывания. Далее в каждую лунку вносили по 150 мкл конъюгата стрептавидин-пероксидаза хрена (Алкор Био, Россия). Снова выдерживали на шейкере в течение 1 ч при температуре 37 ± 3 °С и 5-кратно промывали раствором для промывания. В конце вносили в каждую лунку по 100 мкл хромогена (тетраметилбензидин, ТМБ двухкомпонентный, Алкор Био, Россия) и выдерживали на шейкере 15 мин при температуре 37 ± 3 °С. Реакцию останавливали стоп-реагентом (серной кислотой). Результаты колориметрической реакции определяли, измеряя оптическую плотность при длине волны 450 нм с помощью многоканального спектрофотометра Multiscan mcc/340 (Labsystems Titertek, Finland).
Количество циркулирующих специфических ^Е-антител в сыворотках мышей определяли с использованием модифицированных коммерческих наборов Mouse ^Е ELISA Kit (R&D Systems, США). Вместо планшета из набора с сорбированными антителами против ^Е мыши мы использовали планшеты Grainer high binding (Greiner Bio-One, Германия) с сорбированным на них АН или АД пчелиного яда. Сорбцию проводили в концентрации 10 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,5-9,7 (таблетированный, ПанЭко, Россия), в течение 24 ч при 8 °С. Далее исследование выполняли согласно инструкции к набору Mouse ^Е ELISA Kit (R&D Systems, США). Оптическую плотность определяли на многоканальном спектрофотометре Multiscan mcc/340 (Labsystems Titertek, Finland) при длине волны 450 нм.
Количество циркулирующих специфических IgG-антител в сыворотках мышей определяли с использованием модифицированных коммерческих наборов Mouse IgG ELISA Kit (Sigma Aldrich, США). Вместо планшета из набора с сорбированными антителами против IgG мыши мы использовали планшеты Grainer high binding с сорбированным на них ОПЯ. Сорбцию раствором ОПЯ в концентрации 10 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,5-9,7 (таблетированный, ПанЭко, Россия), проводили в течение 24 ч при 8 °С. Далее исследование выполняли согласно инструкции к набору Mouse IgG ELISA Kit (R&D Systems, США). Оптическую плот-
Рис. 1. Результаты препаративной хроматографии очищенного пчелиного яда (ОПЯ), БиреМех 75 (колонка 16 х 60)
ность определяли на многоканальном спектрофотометре МиШБсап тсс/340 (ЬаЬзу51ет5 ТИеПек, Финляндия) при длине волны 450 нм.
Результаты
Получение аллергоида
Для удаления низкомолекулярных компонентов в связи с их токсическими свойствами представлялось оптимальным использовать гель-фильтрацию на носителе БиреМех 75, диапазон его фракционирования -3-70 кДа. Аналитическая хроматография на носителе БиреМех 75 (колонка 10 х 30) выполнена нами ранее [3]. При анализе профиля элюции были определены пики, соответствующие интересующим нас АН: выраженный пик, соответствующий фосфолипазе (16 кДа), и незначительный пик в диапазоне 39-43 кДа, что соответствует гиалуронидазе и кислой фосфатазе. На рис. 1 представлен типичный результат препаративной хроматографии ОПЯ, БиреМех 75 (колонка 16 х 60). Номера фракций обозначены по верхней границе рис. 1.
На рис. 2 представлены результаты электрофореза в 15 % ПААГ фракций пчелиного яда, полученных разделением на БиреМех 75.
Наибольший интерес представляют фракции 3, 4 и 5, где находятся фосфолипаза А2, гиалуронидаза, кислая фосфатаза (диапазон молекулярных масс 16-43 кДа). Для контроля нахождения интересующих нас белков в диапазоне молекулярных масс от 16 до 43 кДа в ка-
честве маркеров молекулярной массы мы использовали пероксидазу (43 кДа) и лизоцим (14,3 кДа) (см. рис.2).
Белки из объединенной фракции 3-4-5 находятся именно в интересующем нас диапазоне молекулярных масс. Фосфолипаза А2 (16 кДа), в значительных количествах находится и во фракции 6, но со значительной примесью мелиттина (3 кДа). Это неприемлемо для получения АД, поскольку, как мы установили, при добавлении 1 % формальдегида присутствующий в растворе мелит-тин за 15-20 мин образует белый нерастворимый осадок.
1 2 3 4 5 6
Рис. 2. Результаты вертикального электрофореза в 15 % ПААГ фракций пчелиного яда, полученных разделением на Бирег-(!ех 75: 1 - маркер молекулярной массы пероксидаза, 43 кДа; 2 - объединенная фракция 4-5, 16 кДа; 3 - объединенная фракция 3-4-5, 39-43 и 16 кДа; 4 - фракция 6, 16 и 3 кДа, 5 - фракция 7,3 кДа, 6 - маркер молекулярной массы лизоцим, 14,3 кДа
350
Методы
А.
280 0,5 -
150 kD 66 kD 44 kD
I II
0,25 -
0 J
0
10
15
20
25 мл
Рис. 3. Результат аналитической хроматографии аллергена (АН) из пчелиного яда на колонке БиреМех 200 (10 х 30), стрелками на верхней границе обозначены вершины пиков калибраторов
Разработанная нами технология препаративного разделения пчелиного яда-сырца дополнительно позволяет получить мелиттин - дорогостоящий продукт, перспективный к использованию в онкологии, обладающий антимикробными и противовирусными свойствами [12].
Полученные фракции 3, 4 и 5 объединяли и концентрировали методом ультрафильтрации под давлением, пористость фильтра для ультрафильтрации - 6-8 кДа. Таким образом, был получен очищенный АН пчелиного яда, оптимальный по белковому составу, который использовали для последующего получения АД методом полимеризации формальдегидом.
Очищенный АН доводили до концентрации 6 мг АН на 1 мл 0,01 М PBS (Sigma Aldrich, США), рН 7,5. Для получения АД к прозрачному раствору АН по каплям, при перемешивании, добавляли формальдегид (36-40 %), так, чтобы концентрация формальдегида в растворе АН составляла 1 %. Полученную смесь фильтровали через бактериальный фильтр с диаметром пор 22 мкм. Реакционную смесь инкубировали 30 дней при комнатной температуре, периодически перемешивая.
Полученный раствор АД стабилизировали бор-гидридом натрия (Sigma Aldrich, США). Далее проводили диализ против апирогенной воды, при 4 °С в течение 2 дней. После завершения диализа АД лиофильно высушивали. Степень полимеризации АД анализировали в сравнении с исходным АН хроматографией на Superdex 200, результаты представлены на рис. 3 и 4.
Исходный АН из пчелиного яда-сырца (объединенные фракции 3-4-5, полученные при препаративной хроматографии на БиреМех 75) и АД сравнивали с помощью аналитической хроматографии на БиреМех 200.
Колонка предварительно была откалибрована по белкам с известной молекулярной массой, вершины пиков калибраторов обозначены стрелками на верхней границе хроматограмм. На хроматограмме, представленной на рис. 3, видно, что исходный продукт представляет собой монокомпонентный пик в диапазоне 16-50 кДа. Полученный АД, как видно на рис. 4, представляет собой многокомпонентный пик с диапазоном молекулярных масс 16-600 кДа. Наибольшее количество белка в АД находится в диапазоне молекулярных масс 120-220 кДа, что характерно для полимеризации формальдегидом. Видно, что в результате полимеризации произошло значительное увеличение молекулярной массы АД в сравнении с исходным АН.
Подобное связано, скорее всего, с образованием комплексов в растворе. Чтобы проанализировать белки вне комплексов, в их третичной структуре, необходимо было выполнение вертикального электрофореза в 12 % ПААГ. Результаты представлены на рис. 5. Отчетливо видно, что полимеризация привела к увеличению молекулярной массы каждой фракции не менее, чем в 2-3 раза. Это сходно с результатами, полученными при получении так называемого мономерного АД путем карбамилирования.
020105010241010209000001050100110100100602010507051001013903
А.
280 0,5
66 kD 44 kD
0,25 -
0 J
0
10
15
20
25 мл
Рис. 4. Результат аналитической хроматографии аллергоида (АД) из пчелиного яда на колонке БиреМех 200 (10 х 30), стрелками на верхней границе обозначены вершины пиков калибраторов
В составе АД могут находиться остаточные количества формальдегида и метанола, образующегося в результате инактивации альдегидных групп боргидри-дом натрия. Если определение остаточного формальдегида предусмотрено ОФС.1.7.1.0001.15 «Аллергены», то определение метанола в составе АД ранее никем не проводилось. В соответствие с ОФС.1.7.1.0001.15 «Аллергены» (ГФ, XIV издание) содержание остаточного формальдегида для АД допустимо до концентрации 0,14 мг/мл. Формальдегид определяется колориметрическим методом с использованием фуксин-сернистой кислоты, который, несомненно, уступает в чувствительности газовой хроматографии.
Исследовали полупродукт - АД с неинактивирован-ным формалином и конечный продукт - препарат АД из пчелиного яда. Площадь пика на хроматограмме исследуемого раствора не должна превышать (или быть равной) площади соответствующего пика на хромато-грамме рабочего стандартного раствора. Полученные результаты представлены в табл. 1 и 2.
В результате проведенного анализа установлено, что содержание остаточного формальдегида в препарате АД составляет 0,00249 мг/мл, т. е. в 56 раз ниже допустимой концентрации 0,14 мг/мл.
Содержание метанола в препарате АД составляет 0,017 мг/мл. Для сравнения: по нормативам в США максимальная суточная доза метанола (Reference Dose), не связанная ни с каким неблагоприятным действием на
здоровье, составляет 2 мг на кг массы тела (с 1988 г.). Учитывая, что максимальная поддерживающая доза АД составляет 0,1 мг, возможно получение пациентом при подкожной инъекции не более 0,002 мг метанола. На сегодняшний день вопрос о регистрации остаточного метанола в АД, невзирая на применение полимеризации формалином с 1980-х гг., не обсуждался. По нашему мнению, невзирая на столь незначительную концентрацию метанола в АД, контроль его содержания необходим при изготовлении препарата.
i
Рис. 5. Результаты вертикального электрофореза в 12 % ПААГ аллергоида (АД) и аллергена (АН) пчелиного яда: 1 - маркер молекулярной массы лизоцим (14,3 кДа); 2 - АД из пчелиного яда; 3 - АН из пчелиного яда серии 16-43 кДа; 4 - маркер молекулярной массы пероксидаза (43 кДа)
150 kD
3
4
020105010011010009010201050001100101390510400507091004053905
Таблица 1. Площади хроматографических пиков
Образец S, формальдегид, FID 1 S, формальдегид, FID 2 S, метанол, FID 1 S, метанол, FID 2
Контроль-0 0,00 0,00 0,00 0,00
Контроль-1 42,39 41,89 14,52 14,55
Контроль-2 46,25 45,76 15,70 15,53
Контроль-3 48,21 47,70 16,26 16,20
Аллергоид до диализа (полупродукт) 98,34 88,42 0,00 0,00
Препарат аллергоида 2,73 2,67 6,30 10,89
Примечание. Б - площадь соответствующего пика на хроматограмме.
Таблица 2. Концентрация остаточных растворителей в образцах
Образец Расчетная концентрация растворителя, мг/мл
формальдегид, FID 1 формальдегид, FID 2 метанол, FID 1 метанол, FID 2
Аллергоид до диализа (полупродукт) 1,17856 0,83678 0,00000 0,00000
Препарат аллергоида 0,00249 0,00246 0,01006 0,01746
Изучение специфической активности аллергоида
Известно, что АД после полимеризации формальдегидом характеризуются снижением способности связываться со специфическим ^Е в сравнении с исходным АН, что подтверждает снижение аллергенно-сти. В конкурентном реверсивном ИФА сравнивали ^Е-связывающую способность ОПЯ, АН и конечного продукта - АД. При выполнении ИФА использовали коммерческие жидкие биотинилированные АН («Алкор Био», Россия), как цельный пчелиный яд, так и очищенную фосфолипазу А2 из пчелиного яда. Результаты оценивали по точке 50 % снижения ОП исследуемого образца по отношению к положительному контролю (точка 50 % ингибирования). Результаты представлены в табл. 3 и 4.
Как видно из данных, приведенных в табл. 3, точка 50 % ингибирования в конкурентном ИФА для АД опре-
деляется при концентрации препарата 10 мкг/лунку при конкуренции с биотинилированным АН пчелиного яда, тогда как для ОПЯ и АН эта точка соответствует 0,625 мкг/лунку.
Как видно из данных, приведенных в табл. 4, точка 50 % ингибирования в конкурентном ИФА для АД определяется при концентрации препарата 10 мкг/лунку при конкуренции с биотинилированным АН фосфо-липазой А2 (пАр1 т1 Фосфолипаза А2 пчелы), тогда как для ОПЯ и АН эта точка приходится на концентрацию 1,25 мкг/лунку.
Следовательно, в результате полимеризации формальдегидом АД утратил большее количество сайтов связывания специфических ^Е-антител к белкам пчелиного яда. Таким образом, препарат АД соответствует требованиям, предъявляемым к АД по критерию снижения аллергенности. Модифицированная нами
Таблица 3. Результаты анализа конкурентного связывания очищенного пчелиного яда (ОПЯ), аллергена (АН) и аллергоида (АД) по изменениям параметров оптической плотности в зависимости от концентрации при конкуренции с биотинилированным аллергеном пчелиного яда
Препарат Концентрация, мкг/лунку
10 5 2,5 1,25 0,625 0
ОПЯ 0,159 ± 0,021 0,196 ± 0,018 0,232 ± 0,02 0,386 ± 0,03 0,471 ± 0,021 1,094 ± 0,091
АН 0,145 ± 0,014 0,169 ± 0,02 0,211 ± 0,01 0,335 ± 0,02 0,490 ± 0,02 1,094 ± 0,091
АД 0,501 ± 0,01 0,558 ± 0,02 0,647 ± 0,03 0,740 ± 0,022 0,942 ± 0,06 1,094 ± 0,091
Таблица 4. Результаты анализа конкурентного связывания очищенного пчелиного яда (ОПЯ), аллергена (АН) и аллергоида (АД) по изменениям параметров оптической плотности в зависимости от концентрации при конкуренции с биотинилированной фос-фолипазой А2 (пАр1 т1 Фосфолипаза А2 пчелы)
Препарат Концентрация, мкг/лунку
10 5 2,5 1,25 0,625 0
ОПЯ 0,303 ± 0,026 0,395 ± 0,03 0,511 ± 0,03 0,637 ± 0,02 0,701 ± 0,03 1,280 ± 0,05
АН 0,338 ± 0,02 0,431 ± 0,02 0,531 ± 0,05 0,617 ± 0,024 0,678 ± 0,03 1,280 ± 0,05
АД 0,772 ± 0,02 0,895 ± 0,042 0,903 ± 0,031 0,960 ± 0,04 1,116 ± 0,026 1,280 ± 0,05
тест-система может быть использована для оценки подлинности АН и АД в конкурентном иммуноанализе, в соответствии с требованиями ГФ (XIV издание).
Исследование специфической активности полученного аллергоида
Аллергическая реакция на пчелиный яд развивается по I типу и обусловлена наличием специфического IgE. Изучение специфической активности АД in vivo выполняли с использованием модели сенсибилизации животных с последующим сравнением уровней специфических IgE-антител. Изучение аллергенной активности препарата проводили с использованием одной дозы для оценки снижения аллергенности тестируемого АД в сравнении с очищенным пчелиным ядом и безмелит-тиновым АН.
Из данных, представленных в табл. 5, видно, что АД в модели сенсибилизации животных демонстрирует снижение аллергенности. Способность АД индуцировать синтез специфического IgE после полимеризации формальдегидом достоверно снижается как в сравнении с ОПЯ, так и с АН пчелиного яда, который был использован для полимеризации.
Оценка иммуногенной активности аллергоида
Иммуногенную активность исследовали на мышах, разделенных на 4 опытных группы по 24 мыши и интак-тную группу из 8 мышей. Через 1, 2, 3, и 4 нед после начала иммунизации животных выводили из эксперимента и в их сыворотке методом ИФА определяли количество циркулирующих специфических IgG-антител. ОПЯ в эксперименте не использовали, так как для мыши расчетное LD50 = 660,8 мкг/мышь, и при введении ОПЯ с адъювантом не исключается токсическое действие (100 мкг - 1/6 LD). АН не содержит мелиттин, а токсическое действие пчелиного яда обусловлено одновременным наличием фосфолипазы А2 и мелиттина.
Как видно из данных, приведенных в табл. 6, большей иммуногенной активностью при однократной иммунизации, особенно в дозе 100 мкг/мышь, обладал АД в сравнении с исходным АН. Уровни специфических IgG-антител при однократной иммунизации животных постепенно возрастали до 4-й недели исследования. При этом средняя оптическая плотность реакции ИФА, свидетельствующая о количестве IgG, в группе иммунизированных АД не менее чем в 1,5 раза превышала значения для АН, его исходного продукта. Следовательно, в результате полимеризации формальдегидом усили-
Таблица 5. Результаты анализа динамики специфических ]^Е-антител в сыворотке мышей, сенсибилизированных ОПЯ, АН и АД (по изменениям параметров оптической плотности)
Наименование образцов Среднее значение ОП при 450 нм
Отрицательный контроль (n = 10) 0,087 ± 0,003
ОПЯ (n = 10) 1,101 ± 0,051
АН (n = 10) 1,317 ± 0,048
АД (n = 10) 0,374 ± 0,011
лась способность АД к индукции синтеза специфических IgG-антител, что необходимо для эффективного проведения АСИТ.
Обсуждение
Пчелиный яд состоит из белков и органических молекул, которые, попадая в организм человека, вызывают местные реакции: боль, отек, зуд и покраснение. Один пчелиный укус редко вызывает сильную аллергию, однако у некоторых людей существует гиперчувствительность к отдельным белкам пчелиного яда, так что даже одно ужаление может привести к угрожающей жизни анафилактической реакции. Вследствие этого по всему миру ежегодно госпитализируют тысячи людей.
Разработка препаратов на основе пчелиного яда важна для патогенетической терапии (АСИТ), позволяющей снизить повышенную чувствительность организма к АН жалящих насекомых.
В Европе и США для проведения АСИТ используют следующие препараты: 1) Venomil (Allergy Therapeutics, Worthing, UK); 2) Reless (также известный как Pharmal-gen; ALK-Abello, Hamburg, Germany); 3) ALK lyophylisi-ert SQ (также известный как Aquagen SQ; ALK-Abello), 4) Venomenhal (HAL Allergy, Leiden, Netherlands).
Несмотря на исследования, показавшие уменьшение симптомных показателей после специфической иммунотерапии АН из пчелиного яда у пациентов с аллергией на ужаление пчелами, существует необходимость усовершенствовать препараты для клинического применения [8]. АСИТ пчелиным ядом имеет значительный риск системных реакций - до 14,2% [9].
Нами разработана технология получения АД из пчелиного яда без низкомолекулярных компонентов (< 3 кДа, таких как мелиттин, апамин, допамин, ингибитор протеазы), что сводит к минимуму возможные нежелательные побочные эффекты без уменьшения десенсибилизирующего эффекта традиционной терапии.
Таблица 6. Результаты анализа динамики специфических ^О-антител в сыворотке мышей, иммунизированных исходным аллергеном (АН) или аллергоидом (АД), по изменениям параметров оптической плотности
Препарат Интактные мыши (n = 8) Недели после однократной иммунизации
1 (n = 6) 2 (n = 6) 3 (n = 6) 4 (n = 6)
АН 20 мкг/мышь 0,093 ± 0,004 0,141 ± 0,022 0,285 ± 0,019 0,377 ± 0,012 0,501 ± 0,012
АД 20 мкг/мышь 0,093 ± 0,004 0,243 ± 0,026 0,357 ± 0,011 0,468 ± 0,018 0,600 ± 0,016
АН 100 мкг/мышь 0,093 ± 0,004 0,207 ± 0,013 0,615 ± 0,036 0,789 ± 0,055 0,812 ± 0,09
АД 100 мкг/мышь 0,093 ± 0,004 0,299 ± 0,015 1,116 ± 0,083 1,257 ± 0,058 1,415 ± 0,027
У пациентов с аллергическими реакциями IgE-ответ преимущественно направлен на определенные глико-протеины. Из них с клинической точки зрения фосфолипаза A2 является наиболее значимым АН, поскольку она распознается сывороточным IgE почти у всех индивидуумов с аллергическими реакциями. Другие менее важные АН - гиалуронидаза и кислая фосфатаза. Все эти компоненты находятся в диапазоне молекулярных масс 16-60 кДа. Высокомолекулярные протеины пчелиного яда практически не способны связываться с IgE, а следовательно, они считаются менее клинически релевантными и даже полностью нерелевантными. Низкомолекулярные компоненты необходимо было удалить в связи с их токсическими свойствами. В этой связи представлялось оптимальным использование гель-фильтрации на носителе Superdex 75, диапазон фракционирования которого составляет 3-70 кДа.
Полученный очищенный АН пчелиного яда, оптимальный по белковому составу, использовался для последующего изготовления АД методом полимеризации формальдегидом.
При сравнении методом аналитической хроматографии АН из пчелиного яда-сырца и АД получили АН как мономерный пик в диапазоне 16-50 кДа, а АД как многокомпонентный пик с молекулярной массой 16-600 кДа. В результате полимеризации молекулярная масса АД значительно увеличилась.
Проведенный анализ остаточного количества формальдегида и метанола показал концентрацию этих веществ в препарате АД ниже допустимых значений.
■ Литература
1. Швец С.М. Аллергические реакции на яд жалящих насекомых // Российский аллергологический журнал. 2004. № 3. C. 9-18.
2. Ali M.A. Al-Samie M. Studies on bee venom and its medical uses. Int. J. Adv. Res. Technol. 2012; 1 (2): 69-83.
3. Авоян Г.Э., Кулага О.С., Николаева И.А., Андреев И.В., Топтыгин А.Ю., Черченко Н.Г.,Санков М.Н., Мартынов А.И., Гегечкори В.И., Салтыкова О.В., Смирнов В.В. Стандартизация пчелиного яда как сырья для производства лекарственных средств для иммунотерапии, в том числе аллергена и аллергоида из пчелиного яда. Иммунология. 2021; 42 (1): 60-7. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-1-60-67
4. Antonicelli L., Bilo M.B., Bonifazi F. Epidemiology of hymeno-ptera allergy. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2002; 2 (4): 341-6. DOI: https://doi.org/10.1097/00130832-200208000-00008
5. Bilo B.M., Bonifazi F. Epidemiology of insect-venom anaphylaxis. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2008; 8 (4): 330-7. DOI: https://doi. org/10.1097/ACI.0b013e32830638c5
6. Trumbeckaite S., Dauksiene J., Bernatoniene J., Janulis V. Knowledge, Attitudes, and Usage of Apitherapy for Disease Prevention and Treatment among Undergraduate Pharmacy Students in Lithuania. Evid. Based Compl. Alternat. Med. 2015; 2015: 172502. DOI: https://doi. org/10.1155/2015/172502
7. Bilo M.B., Bonifazi F. The natural history and epidemiology of insect venom allergy: clinical implications. Clin. Exp. Allergy. 2009; 39 (10): 1467-76. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2222.2009.03324.x
■ References
1. Shvets S.M. Allergic reactions to poisonous insects. Russian Aller-gological Journal. 2004. № 3. C. 9-18.
2. Ali M.A. Al-Samie M. Studies on bee venom and its medical uses. Int. J. Adv. Res. Technol. 2012; 1 (2): 69-83.
При анализе конкурентного связывания ОПЯ, АН и АД при конкуренции с биотинилированным АН пчелиного яда в конкурентном реверсивном ИФА установлено, что в результате полимеризации АД утратил большую часть сайтов связывания специфических ^Е-антител к белкам пчелиного яда.
При проведении 3-кратной подкожной сенсибилизации самцов мышей с интервалом 7 дней для оценки снижения аллергенности у тестируемого АД в сравнении с ОПЯ и безмелиттиновым АН получили достоверное снижение синтеза специфических ^Е-антител при введении АД. При этом при оценке иммуногенности с помощью ИФА у самцов мышей спустя 1, 2, 3, 4 нед после начала иммунизации животных в их сыворотке определялись циркулирующие специфические ^в-антитела и наблюдался постепенный рост их уровня.
Разработанный нами способ получения АД запатентован [13].
Заключение
Разработанный АД обладает высокой способностью к индукции синтеза специфических ^в-антител, что свидетельствует о возможности его практического применения для эффективного проведения АСИТ.
Разработанная нами технология препаративного разделения компонентов пчелиного яда-сырца позволила также дополнительно получить дорогостоящий продукт мелиттин, который, обладая антимикробными и противовирусными свойствами, является перспективным препаратом для применения в онкологии [12].
8. Calderon M.A., Alves B., Jacobson M., Hurwitz B., Sheikh A., Durham S. Allergen injection immunotherapy for seasonal allergic rhinitis. Co-chrane Database Syst. Rev. 2007; 2007 (1): CD001936. DOI: https://doi. org/10.1002/14651858.CD001936.pub2
9. Boyle R.J., Elremeli M., Hockenhull J., Cherry M.G., Bul-sara M.K., Daniels M., Oude Elberink J.N. Venom immunotherapy for preventing allergic reactions to insect stings. Cochrane Database Syst. Rev. 2012; 10(10): CD008838. DOI: https://doi.org/10.1002/14651858.CD00 8838.pub2
10. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981. 288 с.
11. Определение белка. Общая фармакопейная статья. ОФС.1.2.3. 0012.15. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Москва, 2018. URL: https://docs.cntd.ru/document/554031266. Дата обращения: 15.03.2023.
12. Lyu C., Fang F., Li B. Anti-Tumor Effects of Melittin and Its Potential Applications in Clinic. Curr Protein Pept Sci. 2019; 20 (3): 240-50. DOI: https://doi.org/10.2174/1389203719666180612084615
13. Хаитов М.Р., Мартынов А.И., Андреев И.В., Смирнов В.В., Топтыгин А.Ю., Черченко Н.Г., Авоян Г.Э., Кулага О.С., Способ получения аллергоида на основе пчелиного яда для проведения аллерген-специфической иммунотерапии, Патент на изобретение 2731509 C1, 03.09.2020. Заявка № 2019128234 от 09.09.2019.
3. Avoyan G.E., Kulaga O.S., Nikolaeva I.A., Andreev I.V., Topty-gin A.J., Cherchenko N.G., Sankov M.N., Martynov A.I., Gegechkori V.I., Saltykova O.V., Smirnov V.V. Standardization of bee venom as a raw material for the production of medicines for immunotherapy, including allergen
and allergoid from bee venom. Immunologiya. 2021; 42 (1): 60-7. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-1-60-67 (in Russian)
4. Antonicelli L., Bilo M.B., Bonifazi F. Epidemiology of hymeno-ptera allergy. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2002; 2 (4): 341-6. DOI: https://doi.org/10.1097/00130832-200208000-00008
5. Bilo B.M., Bonifazi F. Epidemiology of insect-venom anaphylaxis. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2008; 8 (4): 330-7. DOI: https://doi. org/10.1097/ACI.0b013e32830638c5
6. Trumbeckaite S., Dauksiene J., Bernatoniene J., Janulis V. Knowledge, Attitudes, and Usage of Apitherapy for Disease Prevention and Treatment among Undergraduate Pharmacy Students in Lithuania. Evid. Based Compl. Alternat. Med. 2015; 2015: 172502. DOI: https://doi. org/10.1155/2015/172502
7. Bilo M.B., Bonifazi F. The natural history and epidemiology of insect venom allergy: clinical implications. Clin. Exp. Allergy. 2009; 39 (10): 1467-76. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2222.2009.03324.x
8. Calderon M.A., Alves B., Jacobson M., Hurwitz B., Sheikh A., Durham S. Allergen injection immunotherapy for seasonal allergic rhinitis. Cochrane Database Syst. Rev. 2007; 2007 (1): CD001936. DOI: https:// doi.org/10.1002/14651858.CD001936.pub2
Сведения об авторах
Авоян Гаяне Эммануиловна - мл. науч. сотр. лаб. моделирования иммунологических процессов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: avoyan.gayane@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-4428-0801
Кулага Ольга Сергеевна - мл. науч. сотр. лаб. моделирования иммунологических процессов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: olga.surova.94@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1675-3691
Нечай Ксения Олеговна - мл. науч. сотр. лаб. моделирования иммунологических процессов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: xenya.ne4ay2016@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-6052-9721
Есаулова Дарья Ростиславовна - аспирант лаб. моделирования иммунологических процессов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: esaulova.d.r@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-0283-5637
Андреев Александр Игоревич - мл. науч. сотр. лаб. моделирования иммунологических процессов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: cahek_ahdreeb@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-6257-6289
Андреев Игорь Владимирович - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. моделирования иммунологических процессов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: iva66@list.ru https://orcid.org/0000-0001-6162-6726
9. Boyle R.J., Elremeli M., Hockenhull J., Cherry M.G., Bulsara M.K., Daniels M., Oude Elberink J.N. Venom immunotherapy for preventing allergic reactions to insect stings. Cochrane Database Syst. Rev. 2012; 10 (10): CD008838. DOI: https://doi.org/10.1002/14651858.CD008838. pub2
10. Osterman L.A. Methods of research of proteins and nucleic acids: electrophoresis and ultracentrifugation: Practical guide. Moscow: Nauka, 1981: 288 p. (in Russian)
11. Determination of protein. General pharmacopoeia article. 0FS.1.2.3.0012.15. State Pharmacopeia of the Russian Federation. XIV edition. Moscow; 2018. URL: https://docs.cntd.ru/document/554031266. Accessed: 15.03.2023 (in Russian)
12. Lyu C., Fang F., Li B. Anti-tumor effects of melittin and its potential applications in clinic. Curr Protein Pept Sci. 2019; 20 (3): 240-50. DOI: https://doi.org/10.2174/1389203719666180612084615
12. Khaitov M.R., Martynov A.I., Andreev I.V., Smirnov V.V., Top-tygin A.J., Cherchenko N.G., Avoyan G.E., Kulaga O.S. A method for producing an allergoid based on bee venom for allergen-specific immunotherapy, Patent for invention 2731509 C1, 09/03/2020. Application No. 2019128234 dated 09/09/2019. (in Russian)
Authors' information
Gayane E. Avoyan - Junior Researcher of the Lab. of Modeling of Immunological Processes, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: avoyan.gayane@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-4428-0801
Olga S. Kulaga - Junior Researcher of the Lab. of Modeling of Immunological Processes, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: olga.surova.94@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1675-3691
Ksenia O. Nechay - Junior Researcher of the Lab. of Modeling of Immunological Processes, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: xenya.ne4ay2016@yandex.ru https://orcid.org/0000-0001-6052-9721
Daria R. Esaulova - Postgraduate Student of the Lab. of Modeling of Immunological Processes, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: esaulova.d.r@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-0283-5637
Alexandr I. Andreev - Junior Researcher of the Lab. of Modeling of Immunological Processes, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: cahek_ahdreeb@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-6257-6289
Igor V. Andreev - PhD, Senior Researcher of the Lab. of Modeling of Immunological Processes, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: iva66@list.ru https://orcid.org/0000-0001-6162-6726
Сетдикова Наиля Харисовна - д-р мед. наук, вед. науч. сотр. отделения иммунопатологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: nh.setdikova@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-2587-7928
Швец Светлана Михайловна - канд. мед. наук, ст. науч. сотр. отделения общей аллергологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: smshvets@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-9642-4016
Черченко Николай Георгиевич - канд. биол. наук, технолог лаб. моделирования иммунологических процессов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: cherchenk-o@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-5714-0045
Топтыгин Андрей Юрьевич - канд. мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: atop2007@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-4232-0670
Санков Михаил Николаевич - канд. биол. наук, вед. науч. сотр. лаб. моделирования иммунологических процессов ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: sankov_m54@mail.ru http://orcid.org/0000-0003-4969-1626
Миславский Олег Владимирович - канд. фарм. наук, ст. науч. сотр. лаб. фармакологии и фармацевтической разработки ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: mislavsky.oleg@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-9996-5050
Кофиади Илья Андреевич - д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунологии МБФ, ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: kofiadi@mail.ru http://orcid.org/0000-0001-9280-8282
Гудима Георгий Олегович - д-р биол. наук, проф., зав. лаб. физиологии иммунитета и аллергии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунопатологии и иммунодиагностики Академии постдипломного образования ФГБУ ФНКЦ ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: g.gudima@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-2864-6949
Nailya Kh. Setdikova - Dr. Sci, Senior Researcher of the Immunopathology and Intense Care Dept., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: nh.setdikova@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-2587-7928
Svetlana M. Shvets - PhD, Senior Researcher of General Allergy Dept. of NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: smshvets@gmail.com https://orcid.org/0000-0001-9642-4016
Nikolai G. Cherchenko - PhD, Technologist of Lab. of Modeling of Immunological Processes, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: cherchenk-o@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-5714-0045
Аndrey J. Toptygin - PhD, Leader Researcher of the Im-munochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: atop2007@yandex.ru https://orcid.org/0000-0003-4232-0670
Mikhail N. Sankov - PhD, Leader Researcher of the Lab. of Modeling of Immunological Processes, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: sankov_m54@mail.ru http://orcid.org/0000-0003-4969-1626
Oleg V. Mislavsky - PhD, Senior Researcher of the Pharmacology and Pharmaceutical Development Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: mislavsky.oleg@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-9996-5050
Ilya A. Kofiadi - Dr.Sci., Head of the Molecular Immu-nogenetics Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof of the Immunology Chair of MBF, N.I. Pi-rogov RNRMU, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: kofiadi@mail.ru http://orcid.org/0000-0001-9280-8282
Georgii O. Gudima - Dr.Sci, Prof., Head of Lab. of Physiology of Immunity and Allergy, NRC Institute of Immunology of the FMBA of Russia; Prof. of Immunopathology and Immunodiagnostics Chair, Acad. of Postdiplomal Education, FRCC FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: g.gudima@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-2864-6949
Мартынов Александр Игоревич - канд. мед. наук, первый зам. директора ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail:immune48@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-9761-8058
Смирнов Валерий Валерьевич - д-р фарм. наук, зав. лаб клинической фармакологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация; проф. каф. фармацевтической и токсикологической химии им. А.П. Арзамасцева Института фармации им. А.П. Нелюбина, ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Российская Федерация E-mail: vall@mail.mipt.ru https://orcid.org/0000-0002-8232-6682
Кудлай Дмитрий Анатольевич - член-корр. РАН, д-р мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. персонализированной медицины и молекулярной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация; проф. каф. фармакологии Института фармации им. А.П. Нелюбина, ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), Москва, Российская Федерация E-mail: D624254@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1878-4467
Хаитов Муса Рахимович - член-корр. РАН, д-р мед. наук, проф., директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; зав. каф. иммунологии МБФ, ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: mr.khaitov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-4961-9640
Аlexandr I. Martynov - PhD, First Deputy Director of NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: immune48@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-9761-8058
Valery V. Smirnov - Dr.Sci., PhD, Head of Clinical Pharmacology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation; Prof. of Pharmaceutical and Toxicological Chemistry Chair named after A.P. Arzamastsev, Institute of Pharmacy named after A.P. Neliubin, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); Moscow, Russian Federation
E-mail: vall@mail.mipt.ru https://orcid.org/0000-0002-8232-6682
Dmitry A. Kudlay - Corr. Member of RAS, MD, PhD, Leader Researcher of Lab. of Personalized Medicine and Molecular Immunology, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Pharmacology Dept., Institute of Pharmacy named after A.P. Neliubin, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: D624254@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1878-4467
Musa R. Khaitov - Corr. Member of RAS, MD, Prof., Director of NRC Institute of Immunology, of the FMBA of Russia; Head of Immunology Chair of the MBF, N.I. Pi-rogov RNRMU, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: mr.khaitov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-4961-9640
