CC BY
72
© Коллектив авторов, 2019
Николаева И. А.1, Кулага О.С.1, Авоян Г.Э.1, Смирнов В.В.1' 2, Топтыгин А.Ю.1, Павленко М.К.2, Гороховец Н.В.2, Андреев И.В.1, Селезнев А.С.2, Мартынов А.И.1
Изучение аллергенов березы бородавчатой, выделенных из пыльцы, собранной в период с 2008 по 2015 г.
1 ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, 115522, г. Москва, Россия
2 ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)», 119991, г. Москва, Россия
Резюме
Введение. Аллергия к пыльце березы относится к числу наиболее распространенных в России пыльцевых аллергий. Для ее этиологического лечения применяют аллерген-специфическую иммунотерапию (АСИТ). Для проведения АСИТ используют аллергены, полученные из натурального сырья, что может привести к различиям между сериями препарата. Выполнение требований надлежащей производственной практики (GMP) на всех стадиях производства, начиная от получения сырья и заканчивая контролем качества готового продукта, позволит обеспечить стандартный состав и иммунологическую активность аллергенов (нативных экстрактов) от различных производителей и партий препаратов от одного производителя.
Цель - изучение с помощью современных физико-химических методов аллергенов березы бородавчатой (лат. Bétula péndula), выделенных из пыльцы, собранной в период с 2008 по 2015 г.
Материал и методы. Аллергены выделяли из пыльцы путем обезжиривания и водно-солевой экстракции. Белковый состав аллергенов анализировали с помощью гель-фильтрации и электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ), специфическую активность определяли с помощью твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА).
Результаты. На примере аллергенов пыльцы березы бородавчатой представлена технология получения и результаты контроля качества пыльцевых аллергенов. Профили гель-фильтрации экстрактов пыльцы, собранной в разные годы, различаются, тогда как профили электрофореза в ПААГ сходны. Препараты аллергенов проявляют сходную способность связываться с IgE-антителами сыворотки крови пациентов с аллергией, т. е. специфическую активность. Сходство профилей белкового электрофореза и сходная специфическая активность указывают на однородность препаратов и адекватность метода выделения.
Заключение. Исследование препаратов аллергенов с помощью комплекса современных методов (хроматография, электрофорез в ПААГ и конкурентный ИФА) обеспечивает стандартизацию согласно требованиям GMP. Использование конкурентного ИФА позволяет оценить способность препаратов аллергенов связываться с IgE, что позволяет рекомендовать этот метод для оценки аллергенности препарата в качестве информативного теста для подтверждения специфической активности препаратов наряду с кожными пробами. Можно ожидать, что дальнейшие исследования позволят исключить необходимость проведения испытаний каждой серии препарата в кожных пробах с привлечением пациентов-добровольцев. Использование современных методов контроля позволит обеспечить стандартность и стабильное высокое качество выпускаемых препаратов.
Ключевые слова: пыльцевые аллергены; экстракты аллергенов; береза; стандартизация; АСИТ; гель-хроматография; электрофорез в ПААГ; иммуноферментный анализ (ИФА)
Для корреспонденции
Смирнов Валерий Валерьевич -кандидат фармацевтических наук, заведующий лабораторией клинической фармакологии ФГБУ «ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Россия E-mail: vall@mail.mipt.ru http://orcid.org/0000-0002-8232-6682
Статья поступила 12.09.2019. Принята в печать 16.10.2019.
Для цитирования: Николаева И.А., Кулага О.С., Авоян Г.Э., Смирнов В.В., Топтыгин А.Ю., Павленко М.К., Гороховец Н.В., Андреев И.В., Селезнев А.С., Мартынов А.И. Изучение аллергенов березы бородавчатой, выделенных из пыльцы, собранной в период с 2008 по 2015 г. Иммунология. 2019; 40 (6): 50-56. doi: 10.24411/0206-4952-2019-16007
Финансирование. Исследование проводили в рамках госзадания ФМБА по теме «Разработка технологий, создание и испытание противоаллергических лекарственных препаратов» (шифр: «Аллергобиотехнологии-16»).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Nikolaeva I.A.1, Kulaga O.S.1, Avoyan G.E.1, Smirnov V.V.1 2, Toptygin A.Yu.1, Pavlenko M.K.2, Gorokhovets N.V.2, Andreev I.V.1, Seleznev A.S.2, Martynov A.I.1
Studies of birch wart allergens obtained from pollen collected from 2008 to 2015 years
1 National Research Center - Institute of immunology of Federal Medico-Biological Agency, 115522, Moscow, Russia
2 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Ministry of Healthcare of the Russian Federation, 119991, Moscow, Russia
Abstract
Introduction. Birch pollen allergy is one of the most frequent pollen allergies in Russia. In the case of allergy, preventive strategies include mainly allergen-specific forms of prevention, i.e., allergen avoidance and allergy vaccination, i.e., allergen-specific immunotherapy, AIT.
Since extracts of allergens are obtained from natural raw materials, their composition may be highly biologically variable. This variability causes differences between consignments of medicine. Quality of drugs directly depends on the quality of the raw materials, thus it must meet the highest standards. Compliance with the requirements of standardization ensures the same composition and immunological activity of allergens (native extracts), issued by different manufacturers as well as from different batches issued by the same manufacturer.
Aim - studies of birch wart allergens obtained from pollen collected from 2008 to 2015 years using the complex of contemporary methods.
Material and methods. Allergens were extracted from pollen via degreasing with ether followed by water-salt extraction. Allergen proteins were analyzed with gel filtration and PAAG electrophoresis. Specific activity was determined with solid-phase competitive enzyme immunoassay (ELISA).
Results. On the example of birch wart pollen we present production technology and the results of quality control for pollen allergens. Gel chromatography profiles of pollen extracts collected during different years are different, while PAAG electrophoresis profiles are identical. Allergens show similar ability to bind IgE antibodies from sera of allergic patients (i.e. specific activity). These results demonstrate homogeneity of preparations and compliance of extraction methods.
Conclusion. Studies of birch wart allergen with complex of methods (chromatograpy, PAAG electrophoresis and competitive ELISA) allows to standardize preparations according to GMP. Competitive ELISA allows evaluate the ability of allergens to bind with IgE. Therefore we recommend this method for the evaluation of allergenic properties of preparations. This test allows, along with skin tests, to prove specific activity of preparations. Further studies will allow to exclude skin tests for each batch of allergens with involvement of volunteers. The use of contemporary methods of control would enable to ensure standardization and stable high quality of production.
Keywords: pollen allergens; allergenic extracts; birch; standardization; AIT; gel-chromatography; SDS-PAGE; ELISA
Received 12.09.2019. Accepted 16.10.2019.
For citation: Nikolaeva I.A., Kulaga O.S., Avoyan G.E., Smirnov V.V., Toptygin A.Yu., Pavlenko M.K., Gorokhovets N.V., Andreev I.V., Seleznev A.S., Martynov A.I. Studies of birch wart allergens obtained from pollen collected from 2008 to 2015 years. Immunologiya. 2019; 40 (6): 50-6. doi: 10.24411/0206-4952-2019-16007
Funding. The study was carried out within the framework of the FMBA state task on the topic «development of technologies, creation and testing of anti-allergic drugs» (code: «Allergobiotechnologies-16»).
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
For correspondence
Smirnov Valery V. -PhD, Head of Laboratory of Clinical Pharmacology, NRC Institute of Immunology FMBA of Russia, Moscow, Russia E-mail: vall@mail.mipt.ru http://orcid.org/0000-0002-8232-6682
По данным эпидемиологических исследований, проведенных в различных странах, распространение аллергических заболеваний в течение последних десятилетий возросло в 3-4 раза и охватило от 10 до 30% населения Земли [1]. Ни в одной стране не отмечается ни снижения, ни стабилизации роста данной патологии. Так, в Центральной и Северной Европе пыльца березы как причина поллиноза составляет почти 20% всех случаев пыльцевой аллергии [1]. Приблизительно 70% пациентов с респираторной аллергией, обусловленной пыльцой березы, также страдают пищевой аллергией (в основном на фрукты семейства розоцветных, а также на фундук, сельдерей и морковь). Единственным доступным на сегодняшний момент этиологическим методом лечения является аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ). Цель лечения - снижение чувствительности пациента к естественной экспозиции c данным аллергеном - специфическая гипосенсибилизация [1-3]. Для достижения цели необходимо введение соответствующих препаратов, в основном представляющих собой продукты экстракции из натуральных источников, в частности из пыльцы растений. Белковый состав пыльцы и, следовательно, количественное содержание аллергенов в исходном сырье может зависеть от различных факторов, таких, как погодные условия, географическое происхождение сырья и т.д. Выделение аллергенов методом экстракции не гарантирует одинаковое количественное содержание веществ в экстракте. В связи с этим необходима стандартизация состава аллергенов в полученных экстрактах для обеспечения надлежащего качества полученного продукта с целью повышения эффективности и безопасности АСИТ [4]. На сегодняшний день в стандартизации аллергенов существует несколько подходов: в США внедряется система национальных стандартных образцов, биологическая активность которых определена одной методикой, в Европе каждая фирма-производитель создает собственные внутренние стандарты (IHRS), охарактеризованные различными методами, но с обязательной оценкой мажорных аллергенов. Производимые в Российской Федерации препараты аллергенов стандартизуют по содержанию единиц белкового азота (protein nitrogen unit - PNU). В основе стандартизации по системе PNU лежит утверждение, что большинство аллергенов имеет белковую природу. Однако содержание белкового азота не отражает в полной мере биологическую активность
Таблица 1. Препараты аллергенов, полученных из пыльцы березы бородавчатой, собранной в разные годы
Год сбора сырья Название препарата
2008 АНБ С-1-08
2010 АНБ С-2-10
2012 АНБ С-3-12
2013 АНБ С-4-13
2015 АНБ С-5-15
аллергенов, так как не все экстрагируемые белки обладают аллергенными свойствами. В системе стандартизации по PNU специфическую активность препаратов необходимо подтверждать кожными пробами [5, 6]. В связи с тем, что выпускаемые отечественными производителями лечебные и диагностические аллергены стандартизуются по содержанию единиц белкового азота, необходимо привести отечественные технологии получения и стандартизации аллергенных препаратов в соответствие с мировым уровнем. Это может быть достигнуто путем внедрения в стандартизацию и контроль качества современных физико-химических методов [7].
Материал и методы
Объект исследования: пыльца березы бородавчатой (сбор в 2008, 2010, 2012, 2013 и 2015 гг.). Сбор пыльцы проводили в период цветения. Высушивали до остаточной влажности 3 ± 0,5%. Пыльцу характеризовали по морфологическим признакам (диаметр пыльцевого зерна, структура экзимы, форма пыльцевого зерна). Допускается не более 10% примесей других видов пыльцы (определяется микроскопическим способом). Содержание тяжелых металлов в сульфатной золе из 1 г пыльцы (точная навеска) не более 0,001%. Зараженность растительной пыльцы амбарными вредителями не превышала I степени чистоты (что отвечает требованиям). Все показатели отвечали требованиям ГФ XIV
Для обезжиривания пыльцы смешивали навеску сырья с диэтиловым эфиром в соотношении 1 : 4. После 2-3 ч настаивания раствор фильтровали через складчатый фильтр. Содержимое высушивали на фильтре. Препарат взвешивали и затем проводили водно-солевую экстракцию раствором бикарбоната аммония 4,0 г/л в соотношении обезжиренная пыльца - экстрагент 1 : 20. Раствор перемешивали на магнитной мешалке и оставляли в прохладном месте на 24 ч. Полученный экстракт центрифугировали, собирали надосадочную жидкость и последовательно фильтровали через фильтры с различным диаметром пор. Далее проводили диализ надосадочной жидкости против апирогенной воды на холоде в течение 24 ч. Диализат центрифугировали и выполняли стерилизующую фильтрацию. Полученные аллергены лиофильно высушивали и использовали в дальнейших исследованиях.
Хроматографический анализ аллергенов березы бородавчатой осуществляли с помощью хроматогра-фической системы среднего давления FPLC Pharmacia Biotech (США). Использовали колонку Superdex 200 HR 10x30. Скорость потока 0,5 мл/мин; детектирование при 280 нм, объем образца 0,2 мл.
Электрофорез в полиакриламидном геле проводили по методу Лэмли [8]. Белок определяли по методу Ло-ури (метод А) [9].
Для определения специфических ^Е-антител человека выполняли конкурентный иммуноферментный анализ (ИФА). Для выполнения ИФА использовали набор реагентов «АллергоИФА-специфические IgE» про-
изводства фирмы «Алкор-Био» (Россия), предназначенный для количественного определения специфических IgE в сыворотке крови человека. Конкурентный анализ проводили в авторской модификации, а именно вносили исследуемый аллерген в конкуренции с биотинилиро-ванным аллергеном. В используемых наборах на твердой фазе (планшетах для ИФА) сорбированы монокло-нальные антитела против IgE человека.
1. В каждую лунку вносили 50 мкл пулированной сыворотки пациентов, сенсибилизированных к исследуемому аллергену.
2. В каждую лунку добавляли 50 мкл исследуемого препарата испытуемого аллергена, разведенного на фосфатном солевом буфере (Sigma) в следующих ко -личествах: 5,000; 2,500; 1,250 и 0,625 мкг/лунка и по 50 мкл коммерческого биотинилированного аллергена березы (из набора «АллергоИФА-специфические IgE» фирмы «АлкорБио»). В контрольную лунку вносили только 50 мкл биотинилированного аллергена и 50 мкл фосфатного солевого буфера.
3. Выдерживали при температуре 37 ± 3 оС в течение одного часа на шейкере.
4. По окончании инкубации пятикратно промывали раствором для промывания.
5. В каждую лунку вносили по 150 мкл конъюгата (стрептавидин-пероксидаза).
6. Выдерживали при температуре 37 ± 3 оС в течение одного часа на шейкере.
7. По окончании инкубации пятикратно промывали раствором для промывания.
8. В каждую лунку вносили по 100 мкл раствора субстрата пероксидазы (тетраметилбензидина) и выдерживали 15 мин на шейкере при 37 ± 3 оС.
9. Через 15 мин реакцию останавливали стоп-реагентом (серной кислотой).
10. Оптическую плотность продуктов ферментативной реакции определяли при длине волны 450 нм с помощью многоканального спектрофотометра Multiscan.
Результаты и обсуждение
С помощью экстракции из образцов пыльцы, собранной в 2008, 2010, 2012, 2013 и 2015 гг., были получены следующие препараты аллергенов (табл. 1).
Из лиофильно высушенных аллергенов (см. раздел «Материал и методы») брали навеску и готовили растворы с концентрацией по массе 1 мг/мл.
В аллергенах количественно определяли белок в соответствии с ГФ XIV по методу Лоури [9] и анализировали с помощью электрофореза в ПААГ в диссоциирующих условиях по Лэмли [8]. Результаты определения концентрации общего белка в образцах аллергенов по Лоури представлены на рис. 1.
Как видно из гистограммы (см. рис. 1), различия концентрации белка в образцах, полученных одним и тем же методом из экстрагированного сырья, статистически недостоверны, и с точки зрения стандартизации их можно считать одинаковыми.
§ АНБ С-5-15
f АНБ С-4-13
ср
о
о
| АНБ С-3-12
Й АНБ С-2-10
й
I АНБ С-1-0
68
4
27 6,92 32 6,38
]374
,72
0 50 100 150 200 250 300 350 400 Концентрация, мкг/мл
Рис. 1. Определение концентрации общего белка в образцах аллергенов березы бородавчатой методом Лоури без осаждения [9]
По оси абсцисс - концентрация белка в мкг/мл; по оси ординат - номер серии аллергена.
Белковые профили серий аллергенов исследовали с помощью электрофореза по Лэмли в 12% полиакрила-мидном геле в диссоциирующих условиях [8]. Результаты электрофореза представлены на рис. 2.
Как видно из рис. 2, белковый профиль всех пяти образцов аллергенов из пыльцы березы одинаков. Во всех образцах присутствуют полосы, соответствующие по молекулярной массе мажорным антигенам Bet v4, Bet v1, Bet v2, Bet v7, Bet v3, Bet v6.
При гель-хроматографии было установлено, что белковые профили аллергенов березы бородавчатой из пыльцы, собранной в разные годы, значительно различаются: при гель-хроматографии в мягких условиях в аллергенах обнаруживается целый ряд пиков высоко-и низкомолекулярных соединений, высота и положение которых для различных образцов различается (рис. 3).
Bet v6 Bet v3 -
Bet v1, Bet v2, Bet v7
Bet v4
1
2 3
4
5
Рис. 2. Исследование аллергенов, выделенных из пыльцы березы бородавчатой, собранной в разные годы, с помощью электрофореза в диссоциирующих условиях 1 - АНБ-С-1-08; 2 - АНБ-С-2-10; 3 - АНБ-С-3-12; 4 -АНБ-С-4-13; 5 - АНБ-С-5-15. Справа - маркеры молекулярной массы. Антигены Bet v1, Bet v2, Bet v7 слабо разрешаются электрофорезом и видны как одна широкая полоса.
Возможно, различия белковых профилей связаны с погодными условиями и условиями сбора пыльцы.
Для нашего исследования наиболее важно было определить, влияют ли эти различия на аллергенность препарата.
Специфические аллергенные компоненты в образцах выявляли с помощью конкурентного ИФА с использованием полученной авторами пулированной специфической ]^Е-содержащей сыворотки крови пациентов, сенсибилизированных к исследуемому аллер-
0 5 10 15 20 25 55 мл чатой методом гель-хроматографии
О Профили гель-фильтрации аллергенов: А - АНБ С-1-08; Б -
АНБ С-2-10; В - АНБ С-3-12; Г - АНБ С-4-13; Д - АНБ С-5-15.
Таблица 2. Связывание препаратов аллергенов, выделенных из пыльцы березы бородавчатой, с ^Е в зависимости от концентрации аллергена
Исследуемый препарат ОП450/% ингибирования
Количество аллергена, мкг/лунка
5,000 2,500 1,250 0,625 0,000
АНБ С-1-08 0,098/94,3 0,156/88,3 0,227/80,8 0,355/66,9 1,081
АНБ С-2-10 0,061/98,2 0,073/97,0 0,100/94,0 0,139/90,0 1,081
АНБ С-3-12 0,06/98,3 0,072/96,9 0,099/94,1 0,137/90,2 1,081
АНБ С-4-13 0,059/98,5 0,072/97,4 0,089/95,2 0,130/90,9 1,081
АНБ С-5-15 0,061/98,2 0,073/96,8 0,093/94,8 0,139/90,0 1,081
гену. Результаты типичного эксперимента представлены в табл. 2.
В табл. 2 приведены значения оптической плотности колориметрической реакции при 450 нм в конкурентном ИФА (ОП450) (в числителе) и % ингибирования (в знаменателе). Для конкуренции с исследуемыми аллергенами использовали стандартный препарат биотинилиро-ванного аллергена березы бородавчатой, прилагаемый к набору «Алкор-Био» (Россия). В контрольную лунку (без испытуемого аллергена) вносили только препарат биотинилированного аллергена.
Как видно из табл. 2, все исследуемые препараты аллергенов, выделенных из пыльцы березы бородавчатой, собранной в разные годы, проявляют сходную способность связываться с антителами класса ]^Е, т. е. аналогичную способность ингибировать связывание биотинилированного аллергена в зависимости от концентрации. Эти результаты свидетельствуют об однородности препаратов и адекватности метода выделения.
Таким образом, использование конкурентного ИФА дает возможность оценить способность препаратов аллергена связываться с ]^Е, что позволяет рекомендовать описанный метод для оценки аллергенности препарата в качестве информативного теста, подтверждающего специфическую активность препаратов наряду с кожными пробами [5, 6].
Заключение
При получении препаратов аллергенов необходима стандартизация на каждом этапе производства, начиная со сбора пыльцы. Различные условия сбора пыльцы могут сказаться на составе конечного продукта. Очевидно, что вследствие сложного состава получаемых экстрактов пыльцы для подтверждения качественного и количественного состава препаратов аллергенов необходимо совместно использовать несколько инструментальных методов анализа.
В настоящей работе сравнивали результаты различных методов исследования препаратов аллергенов, полученных из пыльцы березы бородавчатой, собранной в разные годы, а именно гель-фильтрации, электрофореза в ПААГ в диссоциирующих условиях и иммуноферментного анализа. Показано, хотя профили гель-фильрации экстрактов пыльцы различаются, профили электрофореза образцов сходны.
Вероятно, наблюдаемое несходство результатов исследования аллергенов связано с различными методами подготовки образцов к анализу и отличием условий проведения самого анализа.
Подготовка образцов к гель-фильтрации и сама гель-фильтрация проводятся в мягких условиях, и профили гель-фильтрации отражают простую агрегацию молекул. Напротив, при электрофорезе по Лэмли в жестких условиях подготовки проб (применение додецилсуль-фата натрия) агрегация отсутствует, вторичная и третичная структура нативных белков нарушается, и профиль отражает разделение индивидуальных молекул белка по молекулярной массе и заряду.
Таким образом, профили гель-фильтрации не отражают качественного и количественного состава белков аллергенов. Природу различных профилей гель-фильтрации еще предстоит выяснить, можно предполагать, что эта несхожесть отражает несовпадение по качеству (размеру) и количеству агрегатов белковых молекул, сохраняющееся в мягких условиях гель-фильтрации.
Показано, что исследуемые препараты аллергенов, выделенных из пыльцы березы бородавчатой, собранной в различные годы, проявляют сходную способность связываться с антителами класса ]£Е, что указывает на однородность препаратов и адекватность метода выделения.
Применение метода Лоури для определения концентрации белка и электрофореза в ПААГ для оценки белкового профиля аллергенов необходимы для стандартизации и обеспечения стабильного качества выпускаемых препаратов аллергенов. Стандартность аллергенов - сырья для получения аллергоидов, в свою очередь, обеспечит лучшие условия и результаты проведения АСИТ.
Конкурентный ИФА дает возможность оценить способность препаратов аллергена связываться с ]£Е, что позволяет рекомендовать описанный метод для оценки аллергенности препарата в качестве информативного теста для подтверждения специфической активности препаратов наряду с кожными пробами. Можно ожидать, что дальнейшие исследования позволят исключить необходимость испытаний каждой серии препарата в кожных пробах с привлечением пациентов-добровольцев.
Таким образом, использование современных методов контроля обеспечит стандартизацию и стабильное качество выпускаемых препаратов.
■ Литература
1. Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Медуницын Н.В. Механизмы аллергической реакции немедленного типа, препараты и методы специфической иммунотерапии. Иммунология. 2016; 37 (1): 51-60.
2. Коваленко Н.В., Кутузова Е.А., Богаченко С.М. Безопасность и эффективность аллерген-специфической иммунотерапии в лечении поллинозов. Главный врач Юга России. 2018; 3 (62): 22-4.
3. Сновская М.А., Намазова-Баранова Л.С., Семикина Е.Л. и др. Особенности диагностического обследования пациентов с поливалентной сенсибилизацией перед проведением аллерген-специфической иммунотерапии и оценка ее результатов лабораторными методами. Вестник Российской академии медицинских наук. 2014; 7-8: 85-92.
4. Jutel M. Allergen-specific immunotherapy in Asthma. Curr Treat Options Allergy. 2014; 1 (2): 213-9.
5. Общая фармакопейная статья 1.7.1.0001.15. Аллергены. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 1, М.; 2018.
6. Невская Л.В., Лавренчик Е.И., Жданова М.Ю. и др. Международный опыт стандартизации препаратов аллергенов. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2017; 17 (4): 222-9.
7. Игнатов А.А., Раменская Г.В., Смирнов В.В. Современные тенденции в стандартизации препаратов аллергенов. Фармакоки-нетика и фармакодинамика. 2015; 1: 16-20.
8. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М. : Наука, 1981.
9. Общая фармакопейная статья 1.2.3.0012.15. Определение белка. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Т. 1, М.; 2018.
■ References
1. Soldatov A.A., Avdeeva Zh.I., Medunitsyn N.V. Mechanisms of allergic reactions of immediate type, drugs and methods of immunotherapy. Immunologiya. 2016; 37 (1): 51-60. (in Russian)
2. Kovalenko N.V., Kutuzova E.A., Bogachenko S.M. Safety and efficacy of allergen-specific immunotherapy in the treatment of pollinosis. Chief Doctor of the South of Russia. 2018; 3 (62): 22-4. (in Russian)
3. Snovskaya M.A., Namazova-Baranova L.S., Semikina E.L., et al. Features of diagnostic examination of patients with polyvalent sensitization before conducting allergen-specific immunotherapy and evaluation of its results using laboratory methods. Bulletin of the Russian Academy of Medical Sciences. 2014; 7-8: 85-92. (in Russian)
4. Jutel M. Allergen-specific immunotherapy in Asthma. Curr Treat Options Allergy. 2014; 1 (2): 213-9.
5. General pharmacopoeial article 1.7.1.0001.15. Allergens. State Pharmacopoeia of the Russian Federation. XIV ed. Vol. 1. Moscow; 2018.
6. Nevskaya L.V., Lavrenchik E.I., Zhdanova M.Yu., et al. International experience in the standardization of allergen preparations. Biopreparations. Prevention, diagnosis, treatment. 2017; 17 (4): 222-9. (in Russian)
7. Ignatov A.A., Ramenskaya G.V., Smirnov V.V. Current trends in the standardization of drugs allergens. Pharmacokinetics and pharmacodynamics. 2015; 1: 16-20. (in Russian)
8. Osterman L.A. Methods of research of proteins and nucleic acids: Electrophoresis and ultracentrifugation (practical guide). M.: Science (Nauka), 1981. (in Russian)
9. General pharmacopoeial article 1.2.3.0012.15. Determination of protein. State Pharmacopoeia of the Russian Federation. XIII ed. Vol. 1. Moscow; 2015.
