CC BY
219
УДК 615.33:543(072)
РАЗРАБОТКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ МЕТОДИКИ АНАЛИЗА АЗИТРОМИЦИНА И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРИ ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА И СТАБИЛЬНОСТИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ
ФОРМ ЛОКАЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ
Предложена методика идентификации азитромицина в субстанции и разработанных лекарственных формах локального действия (вагинальные суппозитории, изготовленные на основах витепсол и бутирол, гель на основе метилцеллюлозы) с помощью хроматографии в тонком слое сорбента. Определены наиболее оптимальные системы хроматографирования и условия экстракции антибиотика из лекарственных форм. ТСХ-методика использована при стандартизации и установлении сроков годности для суппозиториев и геля с азитромицином.
Ключевые слова: азитромицин, суппозитории, гели, тонкослойная хроматография, качественный анализ, стабильность.
Азитромицин - антибиотик макролидного ряда, является полусинтетическим производным эритромицина. В клинической практике применяется уже более 30 лет и рекомендуется, в том числе, для лечения различных инфекций, передаваемых половым путем [5, 6]. Выпускается в лекарственных формах для энтерального и парентерального применения и имеет более 20 торговых названий [3]. При лечении гинекологических и урологических заболеваний широко используются лекарственные препараты местного действия. В связи с изложенным, нами были разработаны новые лекарственные формы азитромицина - суппозитории и гели, предназначенные для лечения инфекционных урогенитальных и кожных заболеваний.
Целью настоящего исследования явилось определение качества и стабильности суппозиториев и гелей азитромицина методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).
При разработке методики хроматографии в тонком слое сорбента использовали субстанцию азитромицина, соответствующую требованиям фармакопейной статьи ГФ XII изд. (ФС 42-0213-07), органические растворители различной полярности квалификации «чда». Исследовали серийные образцы разработанных препаратов - 1% гель азитромицина на основе метилцеллюлозы и вагинальные суппозитории на основах бутирол и витепсол с дозировкой азитромицина 200 мг. Показатели качества всех вспомогательных веществ, используемых для получения опытных образцов, отвечали нормативным требованиям.
Хроматографические исследования проводили в стеклянной ^камере прямоугольного сечения по высоте, которую предварительно насыщали парами подвижной фазы в течение 30 мин при постоянной температуре. Хроматографировали восходящим способом на пластинах <^огЬШ» ПТСХ-П-В-УФ 100х100 мм для ВЭТСХ (ЗАО «Сорбполимер», РФ). Тип сорбента - силикагель с добавлением люминесцентного индикатора. Высота подъема фронта элюента - 80 мм.
На этапе пробоподготовки для извлечения азитромицина из лекарственных препаратов использовали метод двойной экстракции, которую проводили следующим образом: для суппозиториев - одну свечу массой 1,5 г тщательно измельчали, навеску измельченного суппозитория массой 0,3 г помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляли 15 мл воды очищенной и нагревали на водяной бане до полного расплавления, энергично взбалтывая в течение 5 мин, затем охлаждали до застывания основы и сливали жидкую часть в мерную колбу на 50 мл. Экстракцию проводили три раза, водные вытяжки объединяли, фильтровали и доводили объем водой очищенной до метки. Для гелей -навеску лекарственной формы массой 4 г помещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, приливали около 40 мл воды очищенной с температурой 40°С, встряхивали в течение 5 мин до полного растворения геля и доводили объем водой очищенной до 50 мл.
Извлечение азитромицина из водной фазы в органическую для суппозиториев и гелей проводили по три раза, используя делительную воронку и расходуя каждый раз по 10 мл хлороформа, после чего вытяжки объединяли, фильтровали через бумажный фильтр
Т.А. БРЕДИХИНА1 Т.А. ПАНКРУШЕВА2
'Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко
2Курский государственный медицинский университет
e-mail: [email protected]
«синяя лента» или фильтр типа «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм, отбрасывая первые порции фильтрата, и упаривали до объема 10 мл (испытуемый раствор).
Параллельно путем последовательных разбавлений готовили растворы рабочего стандартного образца (РСО) азитромицина с концентрацией 0,1% (раствор А), 0,05% (раствор В), 0,02% (раствор С). В работе использовали только свежеприготовленные растворы. С учетом требований к пробоподготовке и растворимости анализируемого вещества в качестве растворителя был выбран хлороформ [4, 7].
На линию старта, расположенную на расстоянии 10 мм от нижнего края пластины, с помощью микрошприца наносили последовательно через 15 мм по 10 мкл испытуемого раствора азитромицина, извлеченного из лекарственных форм, растворов А, В и С, соответственно эквивалентным 10, 5 и 2 мкг РСО азитромицина. Пластину с нанесенными пробами высушивали и хроматографировали восходящим методом. Пятна на полученных хроматограммах открывали при просматривании в УФ свете при длине волны 254 нм, сравнивая при этом значения Rf исследуемых образцов и РСО. Пригодность хроматографической системы оценивали по следующим параметрам: на хроматограмме раствора С азитромицина отчетливо видно пятно.
Статистическую обработку результатов исследований проводили согласно ГФ Х! изд. С использованием пакета компьютерных программ Microsoft Excel 2002 (номер продукта 54521-701-3227086-17559). Оценку значимости различий проводили по t-критерию Стьюдента при уровне значимости р < 0,05 [2].
Азитромицин растворим в неполярных и универсальных растворителях (хлороформ, ацетонитрил, спирт 96%), практически нерастворим в воде, т.е. обладает выраженными гидрофобными свойствами. Расчетное значение критерия гидрофобности Шатца Н = 29 [4]. Для подбора оптимального состава подвижной фазы (ПФ) изучали хроматографическую подвижность субстанции азитромицина в индивидуальных и комбинированных растворителях различной полярности, а также в системах с различным содержанием кислотного и щелочного модификаторов (кислота уксусная и аммиака раствор концентрированный 25%). На линию старта хроматографической пластины с помощью микрошприца в одну точку наносили 10 мкл 0,5% раствора азитромицина (50 мкг). Элюирование проводили восходящим способом при наклонном положении хроматографических пластинок, располагая их под углом около 70° к горизонтали. Полученные хроматограммы высушивали в токе воздуха при комнатной температуре, проявляли в УФ свете и рассчитывали значения Rf. Результаты хроматографирования азитромицина в индивидуальных растворителях представлены в табл. 1.
Таблица 1
Подвижность азитромицина при хроматографировании в индивидуальных растворителях на пластинах «Sorbfil»
Группы растворителей по Снайдеру Растворитель Rf Диэлектрическая проницаемость
I гексан 0,03 1,88
пропанол-2 0,27 19,13
II этанол 0,37 24,55
IV ледяная уксусная кислота 0,10 6,30
V 1,2-дихлорэтан 0,09 10,38
этилацетат 0,06 6,02
VI ацетон 0,36 20,54
ацетонитрил 0,23 35,94
VIII хлороформ 0,09 4,72
При исследовании хроматографической подвижности субстанции азитромицина в индивидуальных гидрофобных и гидрофильных органических растворителях на пластинах <^огЬШ» была выявлена следующая закономерность: с увеличением полярности элюента увеличивается хроматографическая подвижность азитромицина. Это может быть обусловлено более прочными связями между активными центрами силикагеля и адсорбционным слоем, образованным полярными растворителями, в сравнении с неполярными, вследствие чего происходит снижение способности молекул азитромицина вытеснять адсорбированные полярные молекулы ПФ с поверхности адсорбента.
Далее был подобран состав подвижной фазы путем смешивания растворителей из начала и конца элюотропного ряда в различных соотношениях. Полярность комбинированных элюентов оценивали по значению диэлектрической проницаемости и объемной доли индивидуальных растворителей, входящих в состав ПФ. При этом установлено, что оптимальная подвижность азитромицина наблюдается в бинарных системах хлороформ - ацетон (1:5) - Rf = 0,58 и хлороформ - этанол (1:1) - Rf = 0,51, для которых среднеприближенное значение диэлектрической проницаемости составило 17,9 и 14,6 соответственно.
В дальнейшем эксперименте было исследовано влияние щелочного (аммиака раствор концентрированный 25%) и кислотного (кислота уксусная) реагентов на изменение величины Rf азитромицина в указанных системах. При этом установлено, что в присутствии раствора аммиака происходит увеличение хроматографической подвижности азитромицина, а введение в состав ПФ кислоты уксусной ведет к ее уменьшению для обеих систем. Результаты хроматографирования в системах с различным содержанием кислотного и щелочного реагентов, как среднее пяти параллельных определений, представлены в табл. 2.
Таблица 2
Подвижность азитромицина при хроматографировании
в комбинированных элюентах на пластинах «Sorbffl» в присутствии кислотного и щелочного модификаторов
( х ± Л х, п = 5)
Система элюирования Доля модификатора в ПФ
без добавления модификатора аммиака раствор концентрированный 25% кислота уксусная
0,25 I 0,5 | 1 0,25 | 0,5
Хлороформ -ацетон (1:5) 0,58±0,01 0,б9±0,02 0,83±0,03 0,89±0,03 0,54±0,02 0,40±0,01
Хлороформ -этанол (1:1) 0,51±0,01 0,64±0,03 0,79±0,02 0,85±0,03 0,45±0,02 0,34±0,01
Азитромицин содержит два основных радикала и относится к слабым основаниям [1, 8]. Однако наличие в молекуле не только основных, но и кислотных центров обусловливает его способность к ионизации как в кислой, так и в щелочной среде. Положительное влияние щелочного модификатора может быть обусловлено одновременной диссоциацией гидроксильных групп сорбата и свободных ОН-групп силикагеля, что ведет к снижению удерживания азитромицина. С учетом параметров эффективности в качестве ПФ были выбраны системы хлороформ - ацетон - аммиак концентрированный (1:5:0,5) и хлороформ - этанол - аммиак концентрированный (1:1:0,5). Значения коэффициентов подвижности Rf субстанции азитромицина в указанных системах составили 0,8з±0,02 и 0,79±0,02, соответственно. Чувствительность методики определения - 2 мкг азитромицина. Статистически обработанные результаты ТСХ-исследования в оптимальных системах растворителей приведены в табл. 3.
Таблица 3
Метрологические характеристики качественного анализа субстанции азитромицина с использованием метода тонкослойной хроматографии
Система растворителей Мет] рологические характеристики
X Б Бх Л х
Хлороформ - ацетон - аммиак концентрированный (1:5:0,5) 0,83±0,02 0,83 0,0122 0,0055 0,0153
Хлороформ - этанол - аммиак концентрированный (1:1:0,5) 0,79±0,02 0,79 0,0150 0,0067 0,0186
На основании проведенных опытов обоснован выбор растворителей и условия элюирования для идентификации азитромицина методом ТСХ.
В задачи следующего этапа входило изучение возможности использования разработанной методики хроматографирования для анализа подлинности азитромицина в
суппозиториях и гелях и выбор оптимальных условий его проведения: кратность экстракции действующего вещества из лекарственной формы и состав экстрагентов, объем пробы и др. По результатам предварительных исследований была разработана методика получения извлечения из суппозиториев и гелей для ТСХ-анализа с использованием метода двойной экстракции.
При проведении качественного анализа азитромицина в суппозиториях и гелях по разработанной методике наблюдали соответствие значений Rf исследуемых образцов хроматографической подвижности РСО. Дополнительные пятна не обнаружены, следовательно, продукты взаимодействия между компонентами препаратов не образуются, азитромицин совместим с ингредиентами основ и не подвергается деструкции в процессе изготовления.
На хроматограммах, полученных при исследовании извлечений из суппозиториев и гелей плацебо, не содержащих активного ингредиента и изготовленных на тех же основах, что и опытные образцы лекарственных форм, неидентифицируемые пятна обнаружены не были, что свидетельствует о правильном выборе условий экстракции действующего вещества.
Важным критерием оценки качества лекарственных препаратов является их стабильность в процессе хранения. Изучение стабильности проводили методом естественного хранения, в условиях холодильника при температуре (4±1)°С. Для упаковки суппозиториев использовали контурно-ячейковую упаковку из поливинилхлорида и алюминиевой фольги, а для гелей — металлические тубы с лаковым покрытием.
Показатели качества, в том числе определение значения Rf азитромицина в оптимальных системах растворителей, оценивали в день приготовления и через промежутки времени, равные 6 мес хранения: по истечении 6, 12, 18 и 24 мес. Полученные результаты представлены в табл. 4.
Таблица 4
Результаты ТСХ-анализа лекарственных форм с азитромицином ( х ± Л х, n = 5, р < 0,05)*
Срок хранения, мес. Объекты исследования
суппозитории на основе витепсол суппозитории на основе бутирол гель на основе метилцеллюлозы
Значение Rf в системе элюирования хлороформ - ацетон - аммиак концентрированный (1:5:0,5)
0** (контроль) 0,83±0,02 0,83±0,02 0,83±0,02
6 0,82±0,01 0,8з±0,01 0,8з±0,01
12 0,82±0,01 0,83±0,02 0,83±0,02
18 0,83±0,02 0,82±0,01 0,82±0,01
24 0,82±0,01 0,84±0,01 0,83±0,02
Значение Rf в системе элюирования хлороформ - этанол - аммиак концентрированный (1:1:0,5)
0** (контроль) 0,79±0,02 0,79±0,02 0,79±0,02
6 0,79±0,01 0,79±0,02 0,79±0,02
12 0,78±0,01 0,79±0,01 0,80±0,01
18 0,78±0,02 0,78±0,01 0,78±0,01
24 0,80±0,01 0,79±0,01 0,78±0,01
Примечание: *- р - достоверность различий по отношению к контролю;
**- 0 - свежеприготовленные лекарственные формы.
Соответствие величины Rf исследуемых образцов и РСО азитромицина при отсутствии дополнительных пятен свидетельствовало о том, что качество исследуемых препаратов в процессе хранения не изменилось.
Таким образом, на основании проведенного исследования осуществлен выбор растворителей и условий элюирования для идентификации азитромицина методом ТСХ, а также предложена методика экстракции антибиотика из суппозиториев и гелей для проведения ТСХ-анализа. Разработанная ТСХ-методика использована для определения показателей качества суппозиториев и гелей с азитромицином, на основании которого подтверждена их стабильность и установлен срок хранения 2 года (срок наблюдения).
Литература
1. Государственная фармакопея РФ XII изд. - Ч. 1. - М : Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. - 704 с.
2. Государственная фармакопея СССР XI изд. - Вып. 1. - М.: Медицина, 1987. - 369 с.
3. Регистр лекарственных средств России : Энциклопедия лекарств [Электронный ресурс] / http://www.rlsnet.ru.
4. Спутник хроматографиста : методы жидкостной хроматографии / О.Б. Рудаков, И.А.Востров, С.В.Федоров и др. - Воронеж : Водолей, 2004. - 528 с.
5. Страчунский, Л.С. Макролиды в современной клинической практике /Л.С.Страчунский, С.Н.Козлов. - Смоленск : Русич, 1998. - 302 с.
6. Bignell, C. Azithromycin in the treatment of infection with Neisseria gonorrhoeae / C.Bignell, J. Garley // Sex Transm Infect. - 2010. - V. 86, № 6. - Р. 422-426.
7. Sadek, P.S. Troubleshooting HPLC Systems : A Bench Manual / P.S. Sadek. - NY, USA : J.Wiley & Sons, 2000. - 306 p.
8. USP Pharmacists Pharmacopeia. - II ed. - Rockville. The United State Pharmacopeial. Lnc., 2008. - 1519 p.
THE DEVELOPMENT OF CHROMATOGRAPHYCAL METHODIC OF AZITHROMYCIN ANALYSIS AND ITS USE IN THE ASSESSMENT OF QUALITY AND STABILIZATION OF LOCAL ACTION MEDICINAL FORMS
The method of azithromycin identification in substance and developed medicinal forms of local action (vaginal suppositories made on the basis of vitepsol and butirol; gel made on the basis of methylcellulose) with the help of thin-layer chromatography in sorbent is suggested. The most optimal systems of chromatography and the conditions of antibiotic extraction from the medicinal forms are determined. The TLS-method is used in the standardization and establishment of expiry dates for pull-dates for suppositories and gels with azithromycin.
Key words: azithromycin, suppositories, gels, thin-layer chromatography, quality analysis, stabilization.
M. BREDIKHINA 1 M PANKRUSHEVA 2
1Voronezh State Medical Academy
2 Kursk State Medical University
e-mail: [email protected]
