CC BY
12ISSN 0868-5886 НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2018, том 28, № 2, c. 11-19
^^ПРИБОРОСТРОЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ БИОЛОГИИ =
УДК543.426; 543.9
© Д. А. Белов, Ю. В. Белов, А. Л. Широкорад
РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕРСИИ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ НОВОЙ МЕТОДИКИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ
ПЛАВЛЕНИЯ ДНК
Предложена новая методика автоматического определения температуры Тт плавления ДНК, основанная на аппроксимации зависимости флуоресцентного отклика плавления ДНК. Диапазон аппроксимации определяется автоматически и используется для вычислений величины Тт. Полностью исключена составляющая погрешности, которая определяется дискретностью сигналов. Показана возможность сокращения времени анализа. На основе предложенной методики разработана экспериментальная версия программного обеспечения режима плавления ДНК высокого разрешения для анализаторов нуклеиновых кислот АНК-32, АНК-48 и экспериментального образца АНК-96. Экспериментально определены случайная и систематическая погрешности измерения величины Тт.
Кл. сл.: ДНК, генетический анализатор, флуоресцентная детекция
ВВЕДЕНИЕ
Метод плавления ДНК основан на эффекте перехода двойной спирали молекулы ДНК в клубко-образное состояние при повышении температуры [1]. При этом наблюдается резкое изменение интенсивности флуоресцентного отклика (ФО) красителей, присоединенных к молекуле ДНК [2].
Значение температуры плавления ДНК (Тт) зависит от длины фрагмента ДНК и процентного содержания суммы нуклеотидов С и G [3-6], поэтому метод плавления ДНК используется в частности для анализа однонуклеотидных замен.
Можно привести следующие способы определения значения Тт.
1) В качестве величины Тт обычно принимается положение на температурной оси максимума первой производной зависимости флуоресцентного отклика плавления ДНК по температуре (1ПФО).
2) В качестве величины Тт можно принять положение на температурной оси точки перегиба графика зависимости ФО от температуры пробы.
В соответствии с первым способом определения значения Тт ранее в наших статьях [7, 8] были предложены методики определения значения Тт на основе аппроксимации 1ПФО с помощью модели на основе функции Гаусса и модели на основе полинома седьмой степени.
В соответствии со вторым способом определения значения Тт в статье [9] предложена методика
аппроксимации зависимости ФО с помощью модели на основе сигмоидальной функции.
Все предложенные методики обладают общими преимуществами: в процессе аппроксимации значительно уменьшаются погрешности определения значения Тт, обусловленные шумами и дискретностью сигналов.
Однако предложенные методики требуют ручного определения начальных и конечных значений диапазона аппроксимации, поэтому возникает необходимость разработки методики, обеспечивающей автоматическое определение границ аппроксимации зависимости ФО.
В известном программном обеспечении режима плавления ANK_Shell, разработанном в ИАП РАН для анализаторов нуклеиновых кислот, пользователем последовательно активизируются операции: фильтрация, привязка к нулю, привязка к максимуму, дифференцирование и определение Тт. Поскольку аппроксимация ФО не используется, значения Тт вычисляются с дискретностью, равной шагу изменения температуры. Для обеспечения высокого разрешения шаг изменения температуры не должен превышать 0.1 °С, при этом с уменьшением шага значительно увеличивается время измерений [10]. Для исключения операций привязки к нулю, привязки к максимуму и ручного определения границ аппроксимации разработано программное обеспечение режима плавления ДНК, позволяющее аппроксимировать ФО, автоматически определять Тт и исключить погрешность дискретизации.
ОСОБЕННОСТИ ПОЛУЧЕНИЯ ИСХОДНЫХ ДАННЫХ ЗАВИСИМОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОТКЛИКА ПЛАВЛЕНИЯ ДНК
В флуориметрическом детекторе анализатора нуклеиновых кислот применен алгоритм, при котором выполняется оценка по методу максимальной апостериорной плотности вероятностей. Для уменьшения шумов отсчеты флуоресцентного отклика суммируются (интегрируются) на интервале наблюдения [11, 12]: в детекторе используется выборка отсчетов 12-разрядного АЦП с периодом 100 мкс, общее время измерений составляет 80 мс, что позволяет накопить нужную статистику для оценки плотности вероятности и построить ФНЧ с полосой 12.5 Гц. Такой алгоритм позволил обеспечить период опроса всех образцов за 3 с.
В качестве примеров использованы исходные (сырые) данные, полученные при плавлении ДНК на анализаторе АНК-48, который серийно выпускается в ИАП РАН, и на экспериментальном образце АНК-96. Для получения исходных данных были применены пробы, содержащие зонд— ДНК—мишень с флуорофором (ЯОХ) в комбинации с гасителем, производства ЗАО "СИНТОЛ". Параметры эксперимента: температура изменялась в диапазоне 76-86 °С при шаге 0.5 °С. Каждое значение флуоресцентного отклика определяется как сумма 5 измерений при каждом шаге изменения температуры пробы в интервале 20 с (АНК-48) или сумма 8 измерений в интервале 30 с (АНК-96). Общее время эксперимента — не более 10 мин.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАПАЗОНА АППРОКСИМАЦИИ ЗАВИСИМОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОТКЛИКА ПЛАВЛЕНИЯ ДНК
При ручном задании диапазона аппроксимации зависимости ФО результат измерения величины Тт зависит от взаимного расположения на графике зависимости ФО начала и конца диапазона. В настоящей работе предложен и реализован автоматический способ для выбора диапазона аппроксимации зависимости ФО плавления ДНК, при этом использованы сигналы первой и второй производных зависимости ФО по температуре.
Можно отметить некоторые особенности дифференцирования зависимости ФО. Первое дифференцирование предложено выполнять по формуле
- Fl, (1)
где Fi+1' — результат первого дифференцирования при температуре и+\, Fi+l и Fi — исходные данные ФО при температуре ti+\ и ^ соответственно.
Второе дифференцирование предложено выполнять по формуле
F1'' = F1' - Ъ+1', (2)
где Fi '' — результат второго дифференцирования при температуре и,; Fi' и Fi+1' — результаты первого дифференцирования при температуре и, и соответственно.
Преимущество такого способа дифференцирования заключаются в том, что при втором дифференцировании результат Fi" не сдвинут по шкале температур по отношению к исходным данным Fi , поскольку при втором дифференцировании компенсируется сдвиг по температуре результатов первого дифференцирования.
В качестве левой границы диапазона аппроксимации зависимости ФО для каждой пробы принимается максимальное значение второй производной зависимости ФО, а в качестве правой границы диапазона — минимальное значение второй производной. Такой диапазон соответствует условию максимального отношения сигнала к шуму для значений первой производной ФО, поскольку границы диапазона аппроксимации зависимости ФО соответствуют точкам перегиба графика первой производной зависимости ФО.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ПЛАВЛЕНИЯ ДНК Тт
Для определения величины Тт предлагается аппроксимировать зависимость ФО с помощью модели на основе полинома 3-й степени, приведенной ранее в нашей работе [13], по формуле:
Fa = /0 +/V и + / • и, 2 +/з • и 3, (3)
где FСi — относительная величина интенсивности ФО при каждом шаге температуры образца ti (°С); /0/ — коэффициенты при степенных слагаемых полинома, значения которых вычисляются по методу наименьших квадратов (МНК) [14, с. 105108], [15].
При реализации МНК определяется сумма квадратов отклонений Q модели FСi от экспериментальных данных Fi :
е = |>с, (и,, /0, /1, /2, /3) - F1 )2, (4)
i=0
где п — количество отсчетов.
Минимум суммы квадратов отклонений е определяется из условий равенства нулю частных производных функции е путем изменения коэффициентов /о^/3.
Можно отметить особенности этой модели: значение температуры для точки FС" = 0 соответствует максимуму первой производной
Рис 1. Окно выбора параметров для просмотра и обработки зависимости флуоресцентного отклика плавления ДНК
Рис. 2. Активное окно с графиками зависимостей ФО (верхний пучок кривых) и их первой и второй производных (нижний пучок кривых). Вертикальная ось — относительные единицы флуоресценции
и значению точки перегиба зависимости ФО от температуры. Поэтому в качестве величины Тт принимается значение температуры при FC" = 0 по формуле
Тт = - /2 / 3/з. (5)
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ВЕРСИЯ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ НА ОСНОВЕ НОВОЙ МЕТОДИКИ
На основе предложенной методики разработана экспериментальная версия программного обеспечения для анализаторов нуклеиновых кислот АНК-32, АНК-48 и экспериментального образца АНК-96 с условным названием ANK_Melting.
На рис. 1 изображена левая часть окна, в котором осуществляется выбор анализируемых пробирок для вывода графиков исходных зависимостей ФО, графиков аппроксимации, графиков первой и второй производных, выбор диапазона по времени, например до 6000 с, и начального диапазона по температуре (76 °С и 86 °С).
Для определения диапазона аппроксимации сырые данные дважды дифференцируются, однако в результате дифференцирования значительно уменьшаются сигналы, как это видно на рис. 2, при этом ухудшается отношение сигнала к шуму. Для повышения отношения сигнала к шуму программное обеспечение ANK_Melting позволяет
применять различные способы фильтрации первой и второй производных зависимости ФО, в частности фильтр скользящего среднего и медианный фильтр.
Фильтр скользящего среднего является одним из наиболее простых фильтров, но при этом отлично сокращает шумы. Медианный фильтр удаляет из сигнала фрагменты с размерами, меньшими, чем половина размера окна фильтра. Наиболее известным применением медианной фильтрации является устранение из сигнала коротких импульсных помех [16]. Фильтры использованы только для определения диапазона аппроксимации, поэтому не влияют на значение определяемой величины Тт.
На рис. 2 изображена правая часть активного окна на экране компьютера, в котором выводятся графики зависимостей ФО 48 проб (АНК-48) с наложением графиков аппроксимации (верхние), графики первых (средние) и вторых (нижние) производных зависимостей ФО.
На рис. 3 в окне, удобном для наблюдения,
приведены графики первых и вторых производных зависимостей ФО плавления ДНК в 8 пробирках одного ряда.
В табл. 1 приведены результаты определения величины Tm от 48 проб. Для сравнения в последней строке табл. 1 приведены результаты применения известной программы ANK_Shell.
Высокое качество аппроксимации зависимостей ФО можно оценить с помощью коэффициента детерминации R2. Определенные в программе Excel для всех проб значения R2 — не менее 0.99.
Сравнение результатов определения величины Tm позволяет сделать следующие выводы:
- при применении известной программы ANK_Shell обеспечивается дискретность результатов, равная шагу изменения температуры (0.5 °С); определена величина, которая является характеристикой погрешности, СКО = 0.29 °С;
- при применении известной вновь разработанной программы ANK_Melting обеспечивается дискретность результатов не более 0.01 °С. Величина СКО = 0.20 °С.
Время Температура Циклы
<t>1:ROX
Ф2 ФЗ | Ф4 Ф5 Фб Ф7 ФЗ
Плавление
79 S0 81 82 S3 84 S5 Температура. °С
Рис. 3. Окно с графиками первой и второй производных зависимостей ФО. Вертикальная ось — относительные единицы флуоресценции
Табл. 1. Величины Тт и СКО (°С)
№ пробы 1 2 3 46 47 48 СКО
ANK_Melting 82.40 82.46 82.43 82.26 82.33 82.33 0.20
ANK_Shell 82.50 82.50 82.50 82.00 82.00 82.50 0.29
АНАЛИЗ ПОГРЕШНОСТЕЙ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ ПЛАВЛЕНИЯ ДНК Тт
Приведенные в табл. 1 значения СКО являются характеристиками погрешностей, которые содержат систематическую и случайную составляющие.
Ранее в нашей статье [13] было показано, что отклонения значений Тт множества пробирок с одинаковыми образцами от среднего значения могут быть использованы для определения неравномерности распределения температуры в лунках
Табл. 2. Величины Тт, СЗ и СКО (°С)
держателя пробирок. Эти отклонения значений Тт можно считать систематическими погрешностями, поскольку они определяются тепловыми параметрами конкретного анализатора.
Случайные погрешности можно определить путем определения отклонений значений Тт от среднего значения в каждой пробирке при многократных анализах. Такие измерения были выполнены на экспериментальном образце анализатора АНК-96 с образцами и условиями, приведенными ранее.
№ Положение пробы Номер анализа Функции
пробы А1 А2 А11 А12 СЗВ СКОВ
1 2 В1 В2 80.93 80.84 80.86 80.83 80.82 80.74 80.85 80.76 80.87 80.77 0.03 0.03
31 32 Е7 Е8 81.09 81.25 81.03 81.20 81.00 81.20 80.93 81.15 81.01 81.16 0.04 0.05
Функции СЗА СКОА 81.04 0.13 81.04 0.13 80.99 0.13 80.98 0.13 81.01 0.13 0.03
№ пробы Положение пробы Номер анализа Функции
А1 А2 А11 А12 СЗВ СКОВ
1 2 11 12 80.80 81.11 80.88 81.14 80.81 81.20 80.81 81.19 80.80 81.17 0.03 0.03
31 32 Ь7 Ь8 81.51 81.80 81.49 81.71 81.47 81.69 81.39 81.68 81.47 81.71 0.04 0.05
Функции СЗА 81.18 81.20 81.15 81.15 81.16 0.04
СКОА 0.35 0.32 0.30 0.29 0.31 —
Табл. 3. Величины Тт, СЗ и СКО (°С)
В ячейках табл. 2, расположенных в столбце А1 и строках от В1 до Е8, приведены результаты определения величины Тт от 32 проб, которые расположены в лунках держателя пробирок от В1 до Е8. В столбцах от А2 до А12 находятся результаты еще 11 повторных анализов. В столбце СЗВ приведены средние значения величин Tm, а в столбце СКОВ — значения СКО от 12 анализов каждой пробы. В строке СЗА — средние значения величин Тт при каждом анализе, а в строке СКОА — значения СКО от 32 проб при каждом анализе.
Первый основной результат (1ОР — среднее значение от значений СКО каждой из 32 проб при 12 анализах) приведен в ячейке СЗА, СКОВ: 1ОР = 0.03 °С. Этот результат определяет случайную погрешность определения величин Тт при 12 анализах 32 проб.
Второй основной результат (2ОР — среднее значение от значений СКО всех 32 проб при 12 анализах) приведен в ячейке СЗВ, СКОА: 2ОР = = 0.13 °С. Этот результат оценивает в основном систематическую погрешность определения величин Тт 32 проб при 12 анализах.
Подобные результаты приведены в табл. 3. Величины Тт получены при обработке зависимостей ФО других 32 проб, которые расположены в лунках держателя проб от 11 до L8.
Основные результаты: 1ОР = 0.04 °С и 2ОР = = 0.31 °С.
Сравнение результатов определения величин 1ОР и 2ОР позволяет сделать следующие выводы:
- величины 1ОР (0.03 и 0.04 °С) определяют случайные погрешности измерения величин Тт при 12 анализах двух кластеров из 32 проб;
- величины 2ОР (0.13 и 0.31 °С) определяют в основном систематические погрешности измерения величин Тт двух кластеров из 32 проб при 12 анализах, поскольку они отражают неравномерность распределения температуры в лунках держателя пробирок.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Предложена новая методика автоматического определения величины температуры плавления Tm, основанная на аппроксимации зависимости флуоресцентного отклика плавления ДНК. Диапазон аппроксимации определяется автоматически и используется для определения величины Тт.
За счет аппроксимации зависимости флуоресцентного отклика плавления ДНК полностью исключена составляющая погрешности, которая определяется дискретностью сигналов.
Высокая производительность методики подтверждена параметрами выполненных экспериментов: при диапазоне изменения температуры от 76 до 86 °С, при шаге 0.5 °С и длительности на-
блюдения ФО при каждом шаге, равной 30 с, общее время экспериментов составляет 10 мин.
Показано, что за счет высокой производительности методики можно выполнить повторные анализы, по результатам которых можно экспериментально определить случайную и систематическую погрешности измерения величины Tm.
На основе предложенной методики разработана экспериментальная версия программного обеспечения режима плавления ДНК высокого разрешения для анализаторов нуклеиновых кислот АНК-32, АНК-48 и экспериментального образца АНК-96.
Преимущество разработанной экспериментальной версии программного обеспечения на основе новой методики — полная автоматизация вычислений. После выбора файла данных достаточно нажать кнопку Tm в окне выбора параметров, чтобы получить таблицу значений Tm для всех анализируемых проб.
Авторы выражают заинтересованность в проверке методики и программного обеспечения на многочисленных реальных данных и приглашают пользователей анализаторов нуклеиновых кислот АНК-32, АНК-48 к сотрудничеству. Для этого файл с исходными данными, полученными при плавлении ДНК с шагом 0.5 °С, имеющий расширение .dank, необходимо прислать по электронному адресу, приведенному в конце статьи. Авторы в ответном письме приложат результаты обработки в графическом и табличном видах.
Работа выполнена в ИАП РАН в рамках НИР по государственному заказу ФАНО 0074-2014-0010, государственный регистрационный номер: АААА-А16-116041310008-3.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Веденов А.А., Дыхне А.М., Франк-Каменецкий М.Д. Переход спираль—клубок в ДНК // Успехи физических наук. 1971. Т. 105, № 11. С. 479-519. Doi: 10.3367/UFNr.0105.197111d.0479.
2. Лаврова О.И. HRM — новый молекулярный метод определения лекарственной устойчивости микобакте-рий туберкулеза / О.И. Лаврова, М.В. Альварес Фиге-роа, М.Г. Творогова // Клиническая лабораторная диагностика. 2014. № 7. С. 62-64.
3. Календарь Р.Н., Сиволап Ю.М. Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами // Биополимеры и клетка. 1996. Т. 11, № 3-4. С. 55-65. URL: http://www.biopolymers.org.Ua/pdf/ru/11/3/055/biopolym .cell-1995-11-3-055-ru.pdf.
4. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Чеботарь С.В. Генетический полиморфизм злаковых растений при помощи ПЦР с произвольными праймерами // Цитология и генетика. 1994. Т. 28, № 6. С. 54-61. URL: http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/Pdfs/ zyt.pdf.
5. Гибридизация ДНК. Вычисление температуры плав-
ления. URL:
https://m.wikipedia.org/wiki/Гибридизация_ДНК.
6. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. Семенов П.А., Савилова А.М., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР "в реальном времени". М.: БИНОМ, Лаборатория знаний, 2009. 224 с. URL:
http://nashol.com/2014072579193/pcr-v-realnom-vremenirebrikov-d-vsamatov-g-a-trofimov-d-u-2009.html.
7. Белов Д.А., Белов Ю.В., Манойлов В.В. Методика обработки данных при плавлении продуктов полимераз-ной цепной реакции в реальном времени // Научное приборостроение. 2016. Т. 26, № 3. С. 10-14. URL: http://213.170.69.26/mag/2016/full3/Art2.pdf.
8. Белов Д.А., Белов Ю.В., Манойлов В.В. Разработка методик обработки сигналов плавления ДНК // Научное приборостроение. 2017. Т. 27, № 1. С. 83-89. URL: http://213.170.69.26/mag/2017/abst1.php#abst14.
9. Белов Д.А., Корнева Н.А., Альдекеева А.С., Белов Ю.В., Киселев И.Г. Повышение разрешающей способности генетических анализаторов при определении температуры плавления ДНК // Научное приборостроение. 2016. Т. 26, № 2. С. 17-22. URL:
http://213.170.69.26/mag/2016/abst2.php#abst2.
10. Никитина Д.И., Маретина М.А, Егорова А.А., Масленников А.Б., Киселев А.В. Использование высокоразрешающего анализа кривых плавления ДНК в диагностике наследственных заболеваний // Медицинская генетика. 2017. Т. 16, № 5. С. 26-33.
11. Хименко В.И. Случайные данные: структура и анализ. М.: Техносфера, 2017. 423 с.
12. Петров А.И. Исследование и практическая реализация программно-аппаратных средств проведения полиме-разной цепной реакции с наблюдением в реальном
времени. Дис..... к-та техн. наук, Санкт-Петербург,
2016.
13. Белов Д.А., Белов Ю.В., Курочкин В.Е. Новая методика обработки флуоресцентного отклика плавления ДНК // Научное приборостроение. 2018. Т. 28, № 1. С. 3-10. URL:
http://213.170.69.26/mag/2018/abst1.php#abst1.
14. Мудрое А.Е. Численные методы для ПЭВМ на языках Бейсик, Фортран и Паскаль. Томск: МП "РАСКО", 1991. 272 с.
15. Лизуноеа Н.А., Шкроба С.П. Матрицы и системы линейных уравнений. М.: Физматлит, 2007. 171 с.
16. Бардин Б.В. Быстрый алгоритм медианной фильтрации // Научное приборостроение. 2011. Т. 21, № 3. C. 135-139. URL:
http://213.170.69.26/mag/2011/abst3.php#abst16.
Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург
Контакты: Белов Дмитрий Анатольевич, onoff_10@mail.ru
Материал поступил в редакцию 16.04.2018
ISSN 0868-5886
NAUCHNOE PRIBOROSTROENIE, 2018, Vol. 28, No. 2, pp. 11-19
DEVELOPMENT OF THE EXPERIMENTAL VERSION SOFTWARE, BASED ON THE NEW DNA MELTING TEMPERATURE DETERMINATION TECHNIQUE
D. A. Belov, Yu. V. Belov, A. L. Shirokorad
Institute for Analytical Instrumentation of RAS, Saint-Petersburg, Russia
The new technique of automatic DNA melting temperature (Tm) identification, based on approximation of DNA melting signals fluorescent was suggested. The limits of approximation area is specified automatically and is used to calculate the value of Tm. The component of error that is determined by signals discreteness is completely excluded. The possibility of reducing the analysis time is presented. The experimental version of high resolution DNA melting software for nucleic acid analyzers ANK-32, ANK-48 and experimental prototype of ANK-96 was developed on the basis of the offered technique. Random and systematic errors of Tm value measurement were determined experimentally.
Keywords: DNA, genetic analyzer, fluorescent detection
REFERENСES
1. Vedenov A.A., Dychne A.M., Frank-Kamenezkiy M.D. [Transition a spiral — a ball in DNA]. Uspechi fizi-cheskich nauk [Achievements of physical sciences], 1971, vol. 105, no. 11, pp. 479-519. (In Russ.). Doi: 10.3367/UFNr.0105.197111d.0479.
2. Lavrova O.I. Figeroa M.V.A., Tvorogova M.G. [HRM — новый молекулярный метод определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза]. Klini-cheskaya laboratornaya diagnostika [Clinical laboratory diagnostics], 2014, no. 7, pp. 62-64. (In Russ.).
3. Kalendar' R.N., Sivolap Yu.M. [Polymerase chain reaction with arbitrary primers]. Biopolimery i kletka [Biopolymers and cell], 1996, vol. 11, no. 3-4, pp. 55-65. (In Russ.). URL:
http://www.biopolymers.org.ua/pdf/ru/11/3/055/biopolym .cell-1995-11-3-055-ru.pdf.
4. Sivolap Yu.M., Kalendar' R.N., Chebotar' S.V. [Genetic polymorphism of cereals by means of PCR with arbitrary primers]. Zitologiya i genetika [Cytology and genetics], 1994, vol. 28, no. 6, pp. 54-61. (In Russ.). URL: http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/Pdfs/ zyt.pdf.
5. Gibridizaziya DNK. Vychislenie temperatury plavleniya [DNA hybridization. Computation of a melting temperature]. (In Russ.). URL:
https://ru.wikipedia.org/wiki/Гибридизация_ДНК.
6. Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. Seme-nov P.A., Savilova A.M., Kofiadi I.A., Abramov D.D. PCR "v real'nom vremeni" [PCR "in real time"],. Мoscow, BINOM, Laboratoriya znaniy Publ., 2009. 224 p. (In Russ.). URL:
http://nashol.com/2014072579193/pcr-v-realnom-vremenirebrikov-d-vsamatov-g-a-trofimov-d-u-2009.html.
7. Belov D.A., Belov Yu.V., Manoylov V.V. [Method of processing data in melting of real-time polymerase chain
reactions]. Nauchnoe Priborostroenie [Scientific Instrumentation], 2016, vol. 26, no. 3, pp. 10-14. Doi: 10.18358/np-26-3-i1014. (In Russ.).
8. Belov D.A., Belov Yu.V., Manoylov V.V. [DNA melting data processing techniques development]. Nauchnoe Priborostroenie [Scientific Instrumentation], 2017, vol. 27, no. 1, pp. 83-89. Doi: 10.18358/np-27-1-i8389. (In Russ.).
9. Belov D.A., Korneva N.A., Al'dekeeva A.C., Belov Yu.V., Kiselev I.G. [Genetic analyzer resolution increasing at DNA melting temperature determination]. Nauchnoe Priborostroenie [Scientific Instrumentation],
2016, vol. 26, no. 2, pp. 17-22. Doi: 10.18358/np-26-2-i1722. (In Russ.).
10. Nikitina D.I., Maretina M.A, Egorova A.A., Mas-lennikov A.B., Kiselev A.V. [Use of the high-allowing analysis of curves of melt of DNA in diagnosis of hereditary diseases]. Medizinskaya genetika [Medical genetics],
2017, vol. 16, no. 5, pp. 26-33. (In Russ.).
11. Chimenko V.I. Sluchaynye dannye: struktura i analiz [Accidental data: structure and analysis]. Moscow, Tech-nosfera Publ., 2017, 423 p. (In Russ.).
12. Petrov A.I. Issledovanie i prakticheskaya realizaziya programmno-apparatnych sredstv provedeniya polime-raznoy zepnoy reakzii s nablyudeniem v real'nom vremeni [Research and implementation of software and hardware tools of carrying out polymerase chain reaction with observation in real time]. Diss. kand tekhn. nauk, Saint-Petersburg, 2016. (In Russ.).
13. Belov D.A., Belov Yu.V., Kurochkin V.E. [New method of DNA melting signal treatment]. Nauchnoe Priboro-stroenie [Scientific Instrumentation], 2018, vol. 28, no. 1, pp. 3-10. Doi: 10.18358/np-28-1-i310. (In Russ.).
14. Mudrov A.E. Chislennye metody dlya PEVM na yazykach Beysik, Fortran i Paskal' [Numerical methods for PEVM in the BASIC, FORTRAN and Pascal languages]. Tomsk, MP "RASKO", 1991. 272 p. (In Russ.).
15. Lizunova N.A., Shkroba S.P. Matrizy i sistemy lineynych
uravneniy [Matrixes and linear equation systems]. Moscow, Fizmatlit Publ., 2007. 171 p. (In Russ.). 16. Bardin B.V. [Fast algorithm of median filtering]. Nauch-noe Priborostroenie [Scientific Instrumentation], 2011,
vol. 21, no. 3, pp. 135-139. (In Russ.). URL: http://213.170.69.26/en/mag/2011/abst3.php#abst16
Contacts: Belov Dmitriy Anatol'evich, onoff_10@mail.ru
Article received in edition: 16.04.2018
