CC BY
24ISSN 0868-5886
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2018, том 28, № 1, c. 3-10
МАТЕМАТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И МОДЕЛИРОВАНИЕ В ПРИБОРОСТРОЕНИИ
УДК 543.426; 543.9
© Д. А. Белов, Ю. В. Белов, В. Е. Курочкин
НОВАЯ МЕТОДИКА ОБРАБОТКИ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОТКЛИКА ПЛАВЛЕНИЯ ДНК
В статье предложена усовершенствованная модель флуоресцентного отклика плавления ДНК. Модель основывается на степенном полиноме 3-го порядка (СП). На основе модели разработана методика обработки флуоресцентного отклика плавления ДНК, основным результатом применения которой является определение температуры плавления ДНК Тт. Новая методика целенаправленно позволяет сокращать время анализа за счет увеличения дискрета измерения температуры при одновременном сужении ее диапазона. Приведены доказательства адекватности модели на основе СП. Выполнено сравнение результатов применения разработанной и известной методик на основе сигмоидальной функции (СФ) при обработке реальных данных. Показана возможность использования методики для определения неравномерности распределения температуры держателя пробирок амплификатора в режиме плавления.
Кл. сл.: ДНК, ПЦР, анализатор нуклеиновых кислот, аппроксимация, метод плавления высокого разрешения
ВВЕДЕНИЕ
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты в пробе. Метод поли-меразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) позволяет провести качественный и количественный анализы пробы.
Разработкой и производством приборов для проведения анализов на основе метода ПЦР-РВ занимаются зарубежные фирмы: Agilent's Stratagene (США), Analytik Jena AG (Германия), Applied Biosystems (США), Bioer Technology (КНР), BioGene Limited (Англия), Bio-Rad Laboratories (США), Roche (США) и др., а также отечественные фирмы: ИАП РАН / МГТУ им. Баумана / ЗАО Синтол (Санкт-Петербург, Москва), Люмекс (Санкт-Петербург) и ДНК-технология (Москва). На большинстве приборов обеспечивается выполнение анализов на основе метода плавления ДНК.
Плавление ДНК (DNA melting) — процесс перехода двойной спирали молекулы ДНК в клубкообразное состояние при повышении температуры [1]. В результате анализа методом плавления получается S-образная кривая, специфичная для конкретного фрагмента ДНК и обладающая характерной точкой перегиба, которая соответствует температуре плавления ДНК (Tm) [2].
Значение Tm зависит от длины фрагмента ДНК,
процентного содержания суммы нуклеотидов C и G и других факторов [3-6].
Известна программа, позволяющая вычислить значение Tm с учетом содержания в растворе ДНК ионов Na+, K+, Mg++ и Tris+ (буферного растворителя) [7].
Определение Tm необходимо для решения множества задач. Например, измерив температуру плавления, можно определить длину фрагмента ДНК, достоверно подтвердить специфичность ПЦР и оценить влияние примесей в пробе на амплификацию.
Фирма Kapabiosystems (США) опубликовала краткое рекламное руководство [8] по использованию метода плавления высокого разрешения (High Resolution Melting Analysis, HRM, или HRMA), позволяющего исследователям обнаруживать и классифицировать генетические мутации, например однонуклеотидные полиморфизмы (single nucleotide polymorphisms, SNPs), выявлять новые гены и определять разновидности бактерий и вирусов. В этом руководстве указано, что при проведении анализа методом плавления высокого разрешения шаг изменения температуры не должен превышать 0.2 C. Высокое разрешение необходимо для уверенного определения малых изменений температуры плавления Tm: при замене одного нуклеотида различие Tm составляет 0.2-0.5 °C [2].
Однако при уменьшении шага значительно увеличивается время анализа, поскольку до получения отсчета интенсивности флуоресценции красителя при каждом шаге необходимо добиться точного установления температуры. При этом со-
кращается только погрешность дискретизации. Дополнительная погрешность измерения, обусловленная шумами, не может быть скомпенсирована.
В руководстве рекомендуется определять значение Тт как максимальное значение производной кривой плавления по температуре. Значения производной кривой плавления пропорциональны шагу изменения температуры, поэтому при уменьшении шага значительно уменьшается отношение сигнала к шуму.
На основании изложенного можно сделать вывод о том, что разработка методики обработки флуоресцентного отклика плавления для достижения высокого разрешения при изменении температуры с шагом 0.5 или 1 °С и уменьшения времени проведения анализа является актуальной задачей.
В статье [9] нами предложена методика обработки флуоресцентного отклика плавления, в которой используется модель кривой плавления на основе нелинейной сигмоидальной функции (СФ). Такая методика не имеет описанных недостатков: позволяет достигать параметров плавления высокого разрешения без дифференцирования кривой и уменьшать влияние шумов. Величина Тт вычисляется с дискретностью 0.1 или 0.01 °С. Методика на основе СФ также позволяет использовать уменьшенный диапазон измерения температур, что сокращает время проведения анализа [10]. При этом методика на основе СФ обладает следующим недостатком — требуется предварительное определение начальных значений параметров аппроксимирующей функции. Это приводит к плохой сходимости функции с экспериментальными данными. Для устранения этого недостатка в статье предложена новая методика обработки флуоресцентного отклика плавления ДНК на основе степенного полинома 3-го порядка (СП).
АНАЛИТИЧЕСКАЯ ФОРМА МОДЕЛИ СП
Модель кривой плавления на основе степенного полинома 3-го порядка предлагается выразить в виде формулы:
Fc = / + / • Т + /2 • Т2 + fз • Т3, (1)
где FС — относительная величина интенсивности флуоресценции при температуре образца Т (°С), Я0—3 — коэффициенты при степенных слагаемых полинома.
Для демонстрации особенностей модели кривой плавления и вычисления величины Тт будут использованы выражения первой и второй производных по температуре FC' и FC":
Fc' = / + 2/2- Т + 3/3 • Т2, (2)
Fc" = 2/2 + 6/3 • Т. (3)
УСЛОВИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОТКЛИКА ПЛАВЛЕНИЯ ДНК
Исходные ("сырые") данные кривой плавления ДНК для 8 проб в пробирках одного ряда получены на экспериментальном образце анализатора АНК-96, который в настоящее время разрабатывается в ИАП РАН. При этом был использован комплекс зонд—ДНК—мишень с флуорофором ^ОХ) в комбинации с гасителем производства ЗАО "СИНТОЛ" [11]. Параметры эксперимента: температура ТИ изменялась в диапазоне 77-85 °С с шагом 0.5 °С, длительность наблюдения флуоресценции при каждом шаге — 60 с, общее время эксперимента — 18 мин.
МЕТОДИКА ОПТИМИЗАЦИИ ПАРАМЕТРОВ МОДЕЛИ СП
В столбце 1 табл. 1 приведены значения температуры ТИ в диапазоне от 77 до 85 °С.
В столбце 3 — экспериментально полученные при этих температурах значения относительной интенсивности флуоресценции F для одной из проб.
ти, °С тр, °С F Fc Dc 5
1 2 3 4 5 6
77 0 518 527.30 86.42 16838.2
77.5 0.5 517 521.77 22.75
85 8 937 923.54 181.24
Табл. 1. Результаты минимизации величины для одной из проб
В столбце 2 табл. 1 приведены расчетные значения температуры ТР, вычисленные по формуле
Тр = ТИ - ТН, (4)
где ТН — начальная температура эксперимента, в приведенном примере ТН = 77 °С.
Основой предложенной методики построения и оптимизации параметров СП кривой плавления является смещение начала оси температур путем использования расчетного значения температуры Т = ТР в формулах (1)-(3). Смещение оси позволяет уменьшить количество параметров СП, а также улучшить сходимость аппроксимирующей функции с экспериментальными данными.
Наиболее часто в качестве критерия оптимальности описания экспериментальных данных используется критерий наименьших квадратов [12], при этом определяется такая функциональная зависимость, при которой сумма квадратов отклонений экспериментальных от соответствующих им функциональных значений должна быть минимальной.
В четвертом столбце табл. 1 приведены значения флуоресценции FС, вычисленные по формуле (1). В следующем столбце — квадраты отклонений DС = ^ - FC)2, а в последней, целевой ячейке, — сумма квадратов отклонений 5".
Нахождение параметров СП выполнено в программе Excel средством анализа Поиск решения из меню Данные, при этом оптимизированные параметры f0—з соответствуют минимальному значению величины S. Определены следующие значения оптимизированных параметров:
fo = 527.29; f = -25.324; f = 29.82; f =2.55.
На рис. 1 приведен график экспериментальных значений кривой плавления ДНК, а также график модели на основе СП с оптимизированными параметрами. Эти графики отражают зависимости интенсивности флуоресценции F и Fc от температуры ТИ, приведенные в табл. 1. Можно отметить хорошее совпадение этих графиков.
При аппроксимации степенным полиномом 3-го порядка не требуется предварительный подбор начальных значений параметров, что является явным преимуществом новой методики перед методикой на основе СФ.
АДЕКВАТНОСТЬ МОДЕЛИ СП
Для проверки адекватности модели используется коэффициент детерминации R2 (R-квадрат), который оценивает соответствие модели экспериментальным данным [13]. Чем ближе значение R2 к 1, тем выше адекватность модели.
F (Fo) 1000
77
79
81
83
85
Ти, °C
Рис. 1. Графики кривой плавления.
1 — экспериментальная кривая, имеющая вид ступенек; 2 — графическое отображение модели СП с оптимизированными параметрами, гладкая кривая у = -2.5583 х3 + 29.824 х2 - 25.33 х + 527.3. Вертикальная ось — относительная величина интенсивности флуоресценции F и Fс; горизонтальная ось — измеренные значения температуры образцов ТИ (°С)
С помощью программы Excel построен график полиномиальной зависимости, определены ее параметры и значение коэффициента детерминации (рис. 1):
y = -2.5583 х3 + 29.824 х2 - 25.33 x + 527.3;
R2 = 0.9956.
На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:
- коэффициенты полиномиальной зависимости полностью совпадают с ранее оптимизированными параметрами;
- доказана адекватность модели на основе СП: величина R2 весьма близка к 1.
ОСОБЕННОСТИ МОДЕЛИ КРИВОЙ ПЛАВЛЕНИЯ НА ОСНОВЕ СП
Особенности модели плавления на основе СП демонстрируются графиками первой и второй производных этой модели на рис. 2 и 3, которые получены в результате вычислений соответственно по формулам (2) и (3) при определенных значениях оптимизированных параметров.
Ранее нами в статье [14] для аппроксимации производной кривой плавления без смещения шкалы температур применялся полином 7-й степени. Новая методика за счет использования расчетных значений температуры ТР вместо измерен-
F"
1 с
ных значений температуры ТИ позволяет использовать полином 3-й степени, при этом сходимость аппроксимирующей функции с экспериментальными данными увеличивается, а количество параметров уменьшается.
На рис. 3 изображен график второй производной модели СП. Точка пересечения графика с горизонтальной осью соответствует максимуму первой производной и значению точки перегиба модели СП, а также является значением температуры плавления Тт в шкале расчетных значений температур. На основании этого предлагается для вычисления Тт использовать формулу (3) при расчетных значениях температур Т = ТР (°С), вычисленных по формуле (4). При FC" = 0 решение уравнения (3) находится по формуле
Ттр = - /2 / 3/3. (5)
В приведенном примере найденное значение Ттр = 3.89 °С.
Переход в шкалу измерительных значений температур для вычисления величины Тт (°С) можно выполнить по формуле
Тт = (Тн + Ттр). (6)
При ТН = 77 °С получается значение Тт = = 80.89 °С.
Рис. 2. График первой производной модели СП. Вертикальная ось — относительная величина ; горизонтальная ось — расчетные значения температуры ТР (°С)
Рис. 3. График второй производной модели СП. Вертикальная ось — относительная величина FC"; горизонтальная ось — расчетные значения температуры ТР (°С)
Для выполнения расчетов можно объединить формулы (5) и (6):
Тт = Тн -f2 / 3fз. (7)
Такое определение Тт является преимуществом новой методики, т. к. при применении методики на основе СФ для нахождения величины Тт требуются дополнительные операции: интерполяция, дифференцирование и поиск максимума.
СРАВНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫЧИСЛЕНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ ПЛАВЛЕНИЯ ДНК
Вычисленные с помощью методики на основе СП значения Тт 8 проб в соседних пробирках одного ряда приведены во второй строке табл. 2.
В третьей строке приведены значения Тт этих же проб, вычисленные с помощью методики на основе СФ.
На рис. 4 демонстрируются графики, соответствующие значениям Тт в табл. 2.
Значения Тт соответствуют обычной шкале температур в °С. Отличие значений Тт двух графиков находится в пределах 0.04-0.09 °С. Макси-
мальная разность значений Тт крайних проб составляет 0.25 и 0.30 °С. Различие значений Тт проб соседних в одном ряду пробирок обусловлено неравномерностью распределения температуры держателя пробирок.
В результате сравнения 2 методик не было выявлено недостатков методики на основе СП перед методикой на основе СФ.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ ПЛАВЛЕНИЯ ДНК НА ОСНОВЕ МОДЕЛИ СП
Для определения температуры плавления ДНК можно рекомендовать следующую последовательность вычислений:
1) определение расчетных значений температуры ТР по формуле (4);
2) определение значений оптимизированных параметров f0-f3 по формуле (1) при расчетных значениях температуры ТР;
3) вычисление температуры плавления ДНК Тт по формуле (7).
Табл. 2. Сравнение результатов вычисления Тт
Методика вычисления Т 1 т № пробы
1 2 3 4 5 6 7 8
Тт, °С СП 80.89 80.90 81.03 81.09 81.05 80.99 81.05 81.14
Т 0С А т? ^ СФ 80.93 80.94 81.10 81.17 81.12 81.06 81.12 81.23
Т °С
1 т? ^
-♦-Ряд! "•"Ряд2
-г-5
6
-Г"
7
8
№ пробы
Рис. 4. Сравнение результатов измерения величин Тт. Ряд 1 — СП 7т; ряд 2 — СФ Тт. Вертикальная ось — величина Тт, °С; горизонтальная ось — номер пробы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Основная новизна предложенной методики состоит в использовании смещенной и укороченной шкалы температур, содержащей расчетные значения температуры ТР, вычисленные по формуле (4). Такая шкала температур использована в качестве горизонтальной оси на рис. 2 и 3. После определения значений оптимизированных параметров /0-/3 по формуле (1) выполнен обратный переход по формуле (6) в обычную шкалу измерительных значений температур ТИ = 77-85 °С, которая приведена на рис. 1.
Предложенная методика, как и методика на основе СФ, имеет ряд преимуществ по сравнению с известными. Она позволяет использовать непосредственно исходные данные, полученные в результате эксперимента плавления при ступенчатом изменении температуры. При этом отсутствуют операции суммирования отсчетов флуоресцентного отклика при выдержке температуры на каждой ступени, операции дифференцирования и фильтрации.
При использовании предлагаемой методики можно использовать шаг изменения температуры 0.5 °С, при этом значительно экономится время анализа, а температура плавления может быть вычислена с дискретностью 0.01 °С, что соответсвует условиям метода плавления высокого разрешения.
Методика на основе СП позволяет значительно сократить диапазон изменения температуры: в приведенном примере использован диапазон 7785 °С, время анализа составило 18 мин. Методика на основе СФ также позволяет использовать сокращенный диапазон, но при использовании методики на основе СП не требуется предварительное определение начальных значений параметров аппроксимирующей функции, что увеличивает сходимость функции с экспериментальными данными.
После автоматического определения значений оптимизированных параметров /0-/3, параметры / и /3 используются для вычисления температуры плавления ДНК Тт по формуле (7). Это также является преимуществом, т. к. при использовании методики на основе СФ требуются дополнительные операции для нахождения величины Тт: интерполяции, дифференцирования и поиска максимума.
Показано, что зависимость температуры плавления ДНК Тт от номера пробы определена в основном неравномерностью распределения температуры лунок держателя пробирок: макси-
мальная разность температур равна 0.25 °С. На основании полученных результатов можно предложить использовать методику на основе СП для калибровки неравномерности распределения температуры держателя пробирок в абсолютной шкале температур.
Работа выполнена в ИАП РАН в рамках НИР «Научно-методическое обеспечение разработок аналитических систем для нанобиотехнологии и диагностики социально значимых заболеваний и особо опасных инфекций на основе генетических, иммунных и физико-химических методов».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Веденов А.А., Дыхне А.М., Франк-Каменецкий М.Д. Переход спираль—клубок в ДНК // Успехи физических наук. 1971. Т. 105, № 11. С. 479-519. Doi: 10.3367/UFNr.0105.197111d.0479.
2. Лаврова О.И., Альварес Фигероа М.В., Творогова М.Г. HRM — новый молекулярный метод определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза // Клиническая лабораторная диагностика. 2014. № 7. С. 62-64.
3. Календарь Р.Н., Сиволап Ю.М. Полимеразная цепная реакция с произвольными праймерами // Биополимеры и клетка. 1996. Т. 11, № 3-4. С. 55-65. URL: http://www.biopolymers.org.Ua/pdf/ru/11/3/055/biopolym .cell-1995-11-3-055-ru.pdf.
4. Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Чеботарь С.В. Генетический полиморфизм злаковых растений при помощи ПЦР с произвольными праймерами // Цитология и генетика. 1994. Т. 28, № 6. С. 54-61. URL: http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/Pdfs/ zyt.pdf.
5. Вычисление температуры плавления. URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Гибридизация_ДНК.
6. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю. и др. ПЦР в "реальном времени". М.: БИОМ. Лаборатория знаний, 2009. 223 с.
URL: http://nashol.com/2014072579193/pcr-v-realnom-vremeni-rebrikov-d-vsamatov-g-a-trofimov-d-u-2009.html.
7. Melting Temperature Calculation Tm ToolSM. University of Utah, Wittwer Lab (USA). URL: http://www.dna .utah.edu/tm/tool .html.
8. Introduction to High Resolution Melt Analysis. Application Guide. URL: http://www.kapabiosystems.com.
9. Белов Д.А., Корнева Н.А., Альдекеева А.С., Белов Ю.В., Киселев И.Г. Повышение разрешающей способности генетических анализаторов при определении температуры плавления ДНК // Научное приборостроение. 2016. Т. 26, № 2. С. 17-22.
URL: http://213.170.69.26/mag/2016/abst2.php#abst2.
ISSN 0868-5886
NAUCHNOE PRIBOROSTROENIE, 2018, Vol. 28, No. 1, pp. 3-10
10. Белов Д.А., Альдекеева A.C., Белов Ю.В., Киселев И.Г. Методики определения рабочих температур термоста-тирования анализаторов нуклеиновых кислот // Научное приборостроение. 2017. Т. 27, № 4. С. 34-39. URL: http://213.170.69.26/mag/2017/abst4.php#abst5.
11. Эйдельштейн М.В., Алексеев Я.И., Никулин А.А, Романов A.B., Козлов Р.С. Способ детекции специфических нуклеотидных последовательностей и нуклеотидных замен с помощью ПЦР в режиме реального времени с эффектом гашения флуоресценции зонда праймером. Патент на изобретение РФ № 2451086, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.05.2012. Бюл. № 14.
12. Земляков В.В. Обработка результатов измерений в Matlab: учебно-методическое пособие. Ростов-на-Дону, 2008. 40 с.
13. Сирота А.А. Методы и алгоритмы анализа данных и их моделирование в MATLAB: учеб. пособие. СПб.: БХВ-Петербург, 2016. 384 с.
14. Белов Д.А., Белов Ю.В., Манойлов В.В. Разработка методик обработки сигналов плавления ДНК // Научное приборостроение. 2017. Т. 27, № 1. С. 83-89. URL: http://213.170.69.26/mag/2017/abst1.php#abst14.
Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург
Контакты: Белов Дмитрий Анатольевич, onoff_ 10@mail. ru
Материал поступил в редакцию 31.01.2018
NEW METHOD OF DNA MELTING SIGNAL TREATMENT
D. A. Belov, Yu. V. Belov, V. E. Kurochkin
Institute for Analytical Instrumentation of RAS, Saint-Petersburg, Russia
The improved model of DNA melting signal is proposed in the article. The model is based on power polynomials of degree 3 (SP). Based on the model, a technique for processing the DNA melting signal has been developed, the main result of which is the determination of the DNA melting temperature Tm. The new technique allows to decrease the analysis time by increasing the temperature measurement pitch while simultaneously narrowing temperature range. Adequacy proofs of the model based on the SP are given. The application results of developed technique and of the known technique based on the sigmoid function (SF) are compared. The possibility of the technique using for determining the thermocycler tubes holder temperature distribution nonunifor-mity during melting mode is shown.
Keywords: DNA, PCR, nucleic acid analyzer, approximation, High Resolution Melt analysis
REFERENСES
1. Vedenov A.A., Dychne A.M., Frank-Kamenezkiy M.D. [Transition a spiral—a ball in DNA]. Uspechi fizi-cheskich nauk [Achievements of physical sciences], 1971, vol. 105, no. 11, pp. 479-519.
Doi: 10.3367/UFNr.0105.197111d.0479. (In Russ.).
2. Lavrova O.I., Al'vares Figeroa M.V., Tvorogova M.G. [The HRM — new molecular technique of detection of pharmaceutical resistance of micobacteria of tuberculosis]. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika [Russian Clinical Laboratory Diagnostics], 2014, no. 7, pp. 62-64. (In Russ.).
3. Kalendar R.N., Sivolap Yu.M. [Polymerase chain reaction with arbitrary oligonucleotide primers]. Biopolimery i kletka [Biopolymers and cell], 1996, vol. 11, no. 3-4, pp. 55-65. Doi: 10.7124/bc.0003ED.
4. Sivolap Yu.M., Kalendar' R.N., Chebotar' S.V. [Genetic polymorphism of cereals by means of PCR with arbitrary primers]. Zitologiya i genetika [Cytology and genetics], 1994, vol. 28, no. 6, pp. 54-61. URL: http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/genomedynamics/Pdfs/ zyt.pdf. (In Russ.).
5. Vychislenie temperatury plavleniya [Computation of a melting temperature]. (In Russ.). URL: https://ru.wikipedia.org/wiki/Гн6рнднзацнfl_ЦНК.
6. Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. et al. PCR v "real'nom vremeni" [PCR in "real time"]. Moscow, BI-OM. Laboratoriya znaniy Publ., 2009. 223 p. (In Russ.). URL: http://nashol.com/2014072579193/pcr-v-realnom-vremeni-rebrikov-d-vsamatov-g-a-trofimov-d-u-2009.html.
7. Melting Temperature Calculation Tm ToofM. University of Utah, Wittwer Lab (USA).
URL: http://www.dna .utah.edu/tm/tool .html.
8. Introduction to High Resolution Melt Analysis. Application Guide. URL: http://www.kapabiosystems.com.
9. Belov D.A., Komeva N.A., Aldekeeva A.C., Belov Yu.V., Kiselev I.G. [Genetic analyzer resolution increasing at DNA melting temperature determination]. Nauchnoe Pri-borostroenie [Scientific Instrumentation], 2016, vol. 26, no. 2, pp. 17-22. (In Russ.). Doi: 10.18358/np-26-2-i1722.
10. Belov D.A., Aldekeeva A.C., Belov Yu.V., Kiselev I.G. [Nucleic acids analyzer holes temperature spread determining method]. Nauchnoe Priborostroenie [Scientific Instrumentation], 2017, vol. 27, no. 4, pp. 34-39. Doi: 10.18358/np-27-4-i3439. (In Russ.).
11. Eydel'shteyn M.V., Alekseev Ya.I., Nikulin A.A, Romanov A.V., Kozlov R.S. Sposob detekzii spezificheskich nukleotidnych posledovatel'nostey i nukleotidnych zamen spomosch'yu PCR v rezhime real'nogo vremeni s effektom gasheniya fluoreszenzii zonda praymerom [Way of detection of the specific nucleotide sequences and nucleotide replacements by means of PCR in real time with effect of
Contacts: Belov Dmitriy Anatolyevich, onoff_ 10@mail. ru
clearing of fluorescence of the probe with a primer]. Patent RF no. 2451086, MPK C12Q 1/68, is published 20.05.2012. Bulletin No. 14. (In Russ.).
12. Zemlyakov V.V. Obrabotka rezul'tatov izmereniy v Mat-lab: uchebno-metodicheskoe posobie [[Processing of results of measurements in Matlab: educational and methodical manual]]. Rostov-na-Donu, 2008. 40 p. (In Russ.).
13. Sirota A.A. Metody i algoritmy analiza dannych i ich modelirovanie v MATLAB: ucheb. posobie [Methods and analysis algorithms of data and their simulation in MAT-LAB: studies manual]. Saint-Petersburg, BHV-Petersburg Publ., 2016. 384 p. (In Russ.).
14. Belov D.A., Belov Yu.V., Manoylov V.V. [DNA melting data processing techniques development]. Nauchnoe Priborostroenie [Scientific Instrumentation], 2017, vol. 27, no. 1, pp. 83-89. (In Russ.).
Doi: 10.18358/np-27-1-i8389.
Article received in edition 31.01.2018
HAyHHOE nPHBOPOCTPOEHHE, 2018, tom 28, № 1
