CC BY
38ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧНИЙ РОЗД1Л
УДК 614.314-008.1:616-021.6:001.891.57
В. Н. Горохивский, д. мед. н., С. А. Шнайдер, д. мед. н., Е. К. Ткаченко, к. биол. н.
Государственное учреждение «Институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Национальной академии медицинских наук Украины»
РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ ПАРОДОНТИТА
Цель исследования. Создание экспериментальной модели пародонтита, воспроизводящей основные звенья его патогенеза в относительно короткие сроки.
Материалы и методы. В опыт были взяты 44 крысы-самца линии Вистар. Крысы I и III групп - интакт-ные (по 10 особей в каждой). Крысам II группы (10 особей) воспроизводили состояние кальциевой недостаточности заменой питьевой воды 2 % раствором ЭДТА. Крысам IV группы (14 особей) модель пародонтита воспроизводили сочетанным введением прооксиданта делагила в дозе 0,03 г/кг массы тела крыс через день и 2% раствора ЭДТА ad libitum в продолжении 60 дней.
Результаты и заключения. Комбинированное пероральное введение делагила и ЭДТА значительно усиливало резорбцию костной ткани пародонта крыс; снижало прочность коллагеновых волокон на разрыв. Делагил, как индуктор ПОЛ, способствовал срыву ФАС тканей пародонта.
Предлагаемая перекисная кальций-дефицитная модель воспроизводит основные проявления пародонтита человека и ведущие звенья его патогенеза.
Ключевые слова: модель пародонтита, делагил, ЭДТА, кальциевая недостаточность, перекисное окисление липидов, физиологическая антиоксидантная система, крысы.
В. Н. Горох1вський, С. А. Шнайдер, €. К. Ткаченко
Державна установа «1нститут стоматологи i щелепно-лицьово! хiрурril Нащонально! академи медичних наук Украши»
РОЗРОБКА ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО1 МОДЕЛ1 ПАРОДОНТИТА
Мета дослгдження. Створення експериментальног модел1 пародонтита, в1дтворюючо1 основнг ланки йо-го патогенезу у вгдносно коротк термгни.
Матер1али i методи. У досвгд були взято 44 щура-самця лтИ Вгстар. Щури I i III груп - ттактн1(по 10 особин в кожнш). Щурам II групи (10 особин) вiдтворювали стан кальщево1 недостатностi замiною питног води розчином ЕДТА. Щурам IV групи (14 особин) модель пародонтита вiдтворювали поеднаним введенням прооксиданта делагша в дозi 0,03 г/кг маси тша щурiв через день i розчину ЕДТА ad libitum в продовжент 60 дтв.
Результати i заключення. Комбтоване пероральне введення делагила i ЕДТА значно посилювало резорбцт юстковог тканини пародонту щурiв; знижувало мщтсть колагенових волокон на розрив. Делагш, як тдуктор ПОЛ, сприяв зриву ФАС тканин пародонту.
Запропонована перекисна кальцш-дефщитна модель вiдтворюе основш прояви пародонтита людини i про-вiднi ланки його патогенезу.
Ключовi слова: модель пародонтита, делагш, ЕДТА, кальщева недостаттсть, переюсне окислення лiпiдiв, фiзiологiчна антиоксидантна система.
V. N. Gorokhivsky, S. A. Schrnider, E. K. Tkachenko
State Establishment "The Institute of Stomatology and Maxillo-Facial Surgery National Academy of Medical Science of Ukraine"
DEVELOPMENT OF AN EXPERIMENTAL MODEL OF PERIODONTITIS
Purpose of the study. Creation of an experimental model of periodontitis, reproducing the main links of its pathogenesis in a relatively short time.
Materials and methods. In the experiment, 44 male rats from the Wistar line were taken. Rats I and III groups - intact (10 animals each). Rats of group II (10 individuals) reproduced the condition of calcium deficiency by replacing
© Горохивский В.Н., Шнайдер С.А., Ткаченко Е.К., 2018.
«iHHoeauu e cmo.namo. uviT», № 1, 2018
drinking water with 2% EDTA solution. Fourth group rats (14 individuals) had a periodontitis model that was combined with the addition of a proagendant delagil at a dose of 0.03 g / kg body weight of rats every other day and a 2% EDTA ad libitum solution over a period of 60 days.
Results and conclusions. The combined oral administration of delagil and EDTA significantly enhanced the resorption of periodontal bone tissue in rats; reduced the strength of collagen fibers to break. Delagil, as an inducer of LPO, contributed to the detachment of FAS periodontal tissues.
The proposed peroxide calcium-deficient model reproduces the main manifestations of human periodontitis and the leading links of its pathogenesis.
Key words: parodontitis model, deligil, EDTA, calcium deficiency, lipid peroxidation, physiological antioxidant system, rats.
В настоящее время уже не вызывает сомнений концепция молекулярных механизмов повреждений пародонта процессами перекисного окисления липидов (ПОЛ) при недостаточном функционировании физиологической антиокси-дантной системы (ФАС).
Различные виды стрессорных воздействий и их интенсивность приводят к развитию экспериментального пародонтита или усугубляют его спонтанное развитие [1]. В длительных токсикологических исследованиях продолжительностью 100-150 дней введением лекарственных ксенобиотиков - клофибрайта, делагила, дифенила оказывали патогенное влияние на пародонт -срыв системы его антиоксидантной защиты, активацию воспалительных явлений, усиление резорбции кости альвеолярного отростка [2]. В то же время, токсикологические модели пародонти-та не в полной мере отражали роль нарушений фосфорно-кальциевого обмена при деструктивных изменениях в пародонте животных.
Цель исследования. Создание экспериментальной модели пародонтита, воспроизводящие основные звенья его патогенеза в относительно короткие сроки.
Материалы и методы. В эксперимент были взяты 44 крысы-самца линии Вистар, содержащихся на стандартном рационе вивария. Крысы I и III групп - интактные (по 10 особей в каждой). Крысам II группы ( 10 особей) воспроизводили состояние кальциевой недостаточности заменой питьевой воды 2 % раствором этилендиаминтет-раацетата (ЭДТА) ad libitum в продолжении 60 дней. Как известно, ЭДТА относится к группе комплексонов, способствующих образованию комплексных соединений с различными катионами, в т.ч. и с ионами кальция. Крысам IV группы (14 особей) модель пародонтита воспроизводили сочетанным введением делагила (хло-роквина фосфат, производства «Алкалоида», Венгрия) в дозе 0,03 г/кг массы тела крыс через день и 2 % раствора ЭДТА ad libitum в продолжении 60 дней.
По завершении эксперимента животных забивали тотальным кровопусканием из сердца под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг), выделяли
челюсти и подвергали их морфометрическому исследованию с целью определения резорбции костной ткани пародонта [3].
Объектами исследований служили сыворотка крови, печень, десна, кость альвеолярного отростка. Уровень ПОЛ оценивали по содержанию диеновых конъюгатов [4] и малонового диальде-гида (МДА) [5]. Состояние ФАС оценивали по активности антиоксидантных ферментов - ката-лазы [6], глутатион-редуктазы (ГР) [7], глутати-он-пероксидазы (ГПО) [8]. В сыворотке крови крыс определяли содержание кальция (сер.16/200) и фосфора (сер. 14/2^100) унифицированными методами с использованием коммерческих наборов реактивов.
Гравиметрический метод определения механической прочности коллагена сухожилий хвоста крыс в основном соответствовал рекомендациям [9]. Для этого у крыс после умерщвления отделяли хвост, обнажали хвостовой отдел позвоночника, и выделяли левое нижнее сухожилие из середины хвоста - брали участок 4 см, свободный от травматических повреждений при препаровке. Свежевыделенное сухожилие легко разделялось на отдельные волокна продольным смещением. После высушивания в течении 5 минут волокна разделяли на индивидуальные кол-лагеновые нити. Контроль разделения волокон осуществляли визуально при 16-кратном увеличении. Концы нити фиксировали в держателях с помощью пологих резиновых прокладок с тем, чтобы не возникали локусы резкого прижимания волокна. Один концевой фиксатор закрепляли в штативе так, чтобы коллагеновая нить свободно свисала вертикально, а к другому фиксатору (нижнему) подвешивали сосуд емкостью 1 л. Заполняя сосуд, можно плавно увеличивать нагрузку от 150 г (вес нижнего фиксатора с сосудом) до 1150 г. В момент разрыва нити (упругое растяжение волокна перед разрывом сменяется пластичным - при нагрузке на 20-40 г меньше максимальной) измеряли вес нагрузки в граммах и по нему судили о прочности волокна. Из каждого хвоста брали по 3 волокнистых нити для определения разрушающей продольной нагрузки. Результаты этих определений усредняли и
полученный показатель использовали в качестве единичного варианта для статистических определений.
Результаты экспериментов обрабатывали общепринятыми методами с определением ^ критериев достоверности различий по Стьюден-ту.
Результаты исследований. На первом этапе разработки модели пародонтита нами было воспроизведено состояние кальциевой недостаточности заменой питьевой воды 2 % раствором ЭДТА. Животные переносили это состояние
удовлетворительно, лишь у части крыс наблюдалась преходящая диарея.
Введение ЭДТА в течении 50 дней вызвало достоверное увеличение резорбтивных процессов в костной ткани пародонта экспериментальных животных. Так, усиление резорбции кости альвеолярного отростка нижней челюсти составило 52 % (от 100 % в интактной группе; р<0,001); верхней челюсти - 36 % (р=0,03). Средние значения увеличения резорбции для двух челюстей при кальций-дефицитном состоянии составили 45 % (р<0,001; табл. 1).
Таблица 1
Показатели резорбции кости альвеолярного отростка крыс в условиях моделирования пародонтита (М±т;р)
Группы животных Показатели резорбции (%)
нижняя челюсть верхняя челюсть средние значения
Интактная 37,4±2,6 30,5±3,3 34,0±3,0
Кальций-дефицитное состояние 56,9±3,7 р<0,001 41,4±2,7 р=0,03 49,2±3,2 р<0,001
Интактная 36,5±2,6 27,3±2,8 31,9±2,7
Модель пародонтита 61,7±1,5 р<0,001 43,1±2,5 р<0,001 52,4±2,0 р<0,001
Примечание : в табл. 1 -3 показатель достоверности р рассчитан по сравнению с данными интактных групп.
Полученные данные указывают на возможность хронического введения ЭДТА как компонента кальций-дефицитной модели пародонтита. Удобство и нетравматичность введения ЭДТА и относительно короткие сроки воспроизведения патологии пародонтита составили преимущества потенциальной модели. Для разработки перекис-ной кальций-дефицитной модели пародонтита в дальнейшем целесообразно было сочетание введения ЭДТА с делагилом - индуктором ПОЛ -признанным фактором патогенеза пародонтита.
Сочетанное введение токсиканта делагила в дозе 0,03 г/кг и 2 % раствора ЭДТА, вместо питьевой воды крысы переносили удовлетворительно. Из 10 крыс погибло 2. Содержание животных в этих условиях в течение 60 дней вызвало проявления пародонтита - у крыс наблюдались отслоение десны, образование зубо-десневых карманов.
Суммарное воздействие делагила и ЭДТА способствовало значительному достоверному усилению резорбции костной ткани пародонта по сравнению с интактной группой, причем указанный эффект в большей степени проявился на нижней челюсти крыс. Так, усиление резорбции составило 69 % (р<0,001); на верхней - на 58 % (р<0,001). Средние значения усиления резорбции кости альвеолярного отростка крыс для двух челюстей составили 64 % (р<0,001; табл. 1).
Результаты биохимических исследований представлены в табл. 2. Проведенные исследования показали, что в печени крыс содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюга-тов увеличивалось в 2,3 раза (р=0,02); в кости альвеолярного отростка - в 4,3 раза (р=0,04;табл.2). Содержание вторичных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида в десне крыс при моделировании пародонтита увеличивалось вдвое (р=0,05); в костной ткани пародонта - на 5,6 % (табл. 2).
Таким образом, как на уровне организма, так и локально, в тканях пародонта наблюдались проявления синдрома пероксидации, выразившиеся в увеличении уровня первичных и вторичных продуктов ПОЛ.
Под влиянием комбинированного воздействия делагила и комплексона ЭДТА в печени экспериментальных животных достоверно снижалась активность ферментов обмена внутриклеточного антиоксиданта глутатиона - глутатион-редуктазы и глутатион-пероксидазы: на 16 % (р=0,05) и на 48 % (р=0,04), соответственно. Активность каталазы в данном объекте исследования снижалась на 8 % (р=0,05) по сравнению с интактной группой (табл. 2). Существенное увеличение активности ГПО в мягких тканях паро-донта при моделировании пародонтита, носило, по-видимому, индуктивный характер в связи со значительным усилением в данном объекте ис-
следования содержания МДА (р=0,05; табл. 2). В кости альвеолярного отростка активность ГР снижалась на 36% (р=0,01); ГПО - на 37 % (р=0,04; табл. 2). Выявленное существенное снижение активности ряда антиоксидантных ферментов при моделировании пародонтита свидетельствовало об истощении системы антиок-сидантной защиты в исследованных тканях при
токсическом воздействии делагила. Введение комплексона ЭДТА, связывающего ионы кальция, моделировало кальциевую недостаточность как одно из патогенетических звеньев заболевания. Об этом свидетельствовало достоверное снижение содержания кальция и тенденция снижения содержания фосфора в сыворотке крови крыс (табл. 3).
Таблица 2
Содержание продуктов ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов в тканях крыс
при моделировании пародонтита (М±т;р)
Изучаемые показатели Группы животных
интактная | модель пародонтита
печень
Содержание ДК (ед.экст.) 0,30±0,074 0,68±0,13 р=0,02
Активность: каталазы (мкат/г) 1073±15,4 987±34,6 р=0,05
ГР (нмоль/ст) 0,57±0,027 0,48±0,028 р=0,05
ГПО (ммоль/сг) 16,4±1,43 8,48±2,95 р=0,04
десна
Содержание: МДА (нмоль/г) 126±44,4 246±30,2 р=0,05
Активность: ГПО (ммоль/сг) 3,31±0,32 20,5±2,82 р<0,001
кость альвеолярного отростка
Содержание ДК (ед.экст.) 0,088±0,026 0,38±0,12 р=0,04
Активность: каталазы (мкат/г) 91,6±27,3 96,7±11,7
ГР (нмоль/ст) 1,98±0,13 1,26±0,17 р=0,01
ПО (ммоль/сг) 8,28±0,92 5,20±0,90 р=0,04
Таблица 3
Содержание кальция и фосфора в сыворотке крови крыс при моделировании пародонтита
(М±т;р)
Группы животных Содержание
кальция (ммоль/л) фосфора (ммоль/л)
Интактная 1,68±0,20 1,26±0,13
Модель пародонтита 1,18±0,010 0,87±0,16
р=0,03 р=0,09
Известно, что коллагеновые волокна сухожилий, пародонта и межпозвоночных дисков состоят преимущественно из коллагена I типа и, в меньшей степени (менее 5 %) из коллагена III типа [9]. Исходя из относительной общности строения коллагеновых структур этих тканей, нами было изучено влияние сочетанного воздействия делагила и ЭДТА на прочность коллагено-
вых волокон сухожилий хвоста крыс. В результате исследований было установлено, что при моделировании пародонтита происходило начи-тельное снижение прочности коллагеновых волокон - нагрузка, вызывающая их разрыв, уменьшалась до 428±42 г против 600±58 г у ин-тактных крыс (р=0,04).
Заключение. Одновременное использование
делагила и ЭДТА усиливало резорбцию кости альвеолярного отростка крыс в среднем на 20 % по сравнению с состоянием кальциевой недостаточности, вызванной потреблением комплексона ЭДТА; значительно снижало прочность волокон коллагена. Делагил, в качестве индуктора ПОЛ способствовал срыву ФАС печени и тканей па-родонта. Кальциевая недостаточность составила фон, способствующий высокому темпу развития патологии.
В целом, выявленная динамика биохимических и морфометрических показателей позволяет считать, что предлагаемая перекисная кальций-дефицитная модель воспроизводит основные проявления пародонтита человека и ведущие звенья его патогенеза.
Список литературы
1. Тарасенко Л. М. Патогенез повреждения па-родонта при стрессе: автореф. дис. на соискание учен. степени д-ра. мед. наук : спец. 14.00.16 «Патологическая физиология» Л. М. Тарасенко; Полтавский мед. стом. ин-т. - М., 1985. - 41 с.
2. Нидзельский М. Я. Влияние биоантиоксидан-тов на развитие экспериментального пародонтоза: автореф. дис. на соискание учен. степени канд. мед. наук. / М.Я. Нидзельский. - Киев, 1985. - 23 с.
3. Николаева А. В. Влияние некоторых нейро-тропных средств на состояние тканей при раздражении верхнего шейного симпатического узла: автореф. дис. на соискание учен. степени канд. мед. наук. / А.
B. Николаева. - Харьков. - 1967. - 29 с.
4. Стальная И. Д. Метод определения диеновых конъюгаций ненасыщенных высших жирных кислот / И. Стальная, Т. Гаришвили // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М. - 1977. -
C.63-64.
5. Владимиров Ю. А. Перекисное окисление ли-пидов в биологических мембранах./ Ю. А. Владимиров, А.И. Арчаков. - М.: Наука. - 1972. - 230 с.
6. Королюк М. А. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк, Д.И. Иванова, И.Г. Майорова // Лабораторное дело. - 1988. - №1. - С. 16-18.
7. Путилина Ф. Е. Определение активности глу-татион-редуктазы / Ф. Е. Путилина // Методы биохимических исследований (липидый и энергетический обмен). - М.: Ин.лит. - 1982. - С.181-183.
8. Пахомова В.А. А.С.922637 СССР. МКИ 01 33/48. Способ определения активности глутатион-пероксидазы в биологических тканях / Пахомова В.А., Козлянина Н.П., Крюкова Г.Н. (СССР). - Опубл. 25.04.82, Бюл. №15. - 2 с.
9. Никитин В.Н. Возрастная и эволюционная биохимия коллагеновых структур. / Никитин В.Н., Перский Е.Э., Утевская Л.А. - К.: Наукова думка -1977. - 279 с.
REFERENCES
1. Tarasenko L. M. Patogenez povrezhdenija parodonta pri stresse [Pathogenesis of periodontal injury during stress]. Abstract of a doctoral thesis of medical sciences. Moscwa; 1985:41.
2. Nidzelsky M.Ya. Vlijanie bioantioksidantov na razvitie jeksperimental'nogo parodontoza [Influence of bioantioxidants on the development of experimental periodontal disease]. Abstract of a doctoral thesis of medical sciences. Kyiv; 1985:23.
3. Nikolaeva A.V. Vlijanie nekotoryh nejrotropnyh sredstv na so-stojanie tkanej pri razdrazhenii verhnego shejnogo simpaticheskogo uzla [Influence of some neurotropic agents on the state of tissues when irritation of the upper cervical sympathetic node]. Abstract of a doctoral thesis of medical sciences. Kharkiv;1967:29.
4. Stalnaya L, Garishvili T. Method of determination of diene conjugations of unsaturated higher fatty acids. Modern methods in biochemistry. Ed. V.N. Orekhovicha. M.;1977: 61-64.
5. Vladimirov Yu.A., Archakov A.I. Perekisnoe okislenie lipidov v biologicheskih membranah [Peroxide oxidation of lipids in biological membranes]. M.: Nauka; 1972:230.
6. Korolyuk M.A., Ivanova D.I., Mayorova I.G.
Method for determination of catalase activity. Laboratornoe delo. 1988;1:16-18.
7. Putilina F.E. Opredelenie aktivnosti glutation-reduktazy. Metody biohimicheskih issledovanij (lipidyj i jenergeticheskij obmen). [Determination of the activity of glutathione reductase. Methods of biochemical studies (lipid and energy metabolism)]. M: In., 1982: 181-183 р.
8. Pakhomova V.A., Kozlyanina N.P., Kryukova G.N. A method for determining the activity of glutathione peroxidase in biological tissues. А.С.922637 USSR. ICC 01 33(48). Opubl. 25.04.82, Bul. 15:2.
9. Nikitin V.N., Persky Ye.E., Utevskaya L.A. Age and evolutionary biochemistry of collagen structures. К .: Naukova dumka; 1977:279.
Надшшла 13.02.18
