CC BY
111
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА И КЛИНИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА
УДК 615.21/.26
РАЗРАБОТКА БИОЛОГИЧЕСКОЙ МОДЕЛИ ИММУНОСУПРЕССИИ ПРИ ПОМОЩИ ДЕКСАМЕТАЗОНА
Богачева Н.В., Тунева Н.А., Смирнов А.А., Галямова Д.А., Попеску Л.И.
ФГБОУ ВО Кировский государственный медицинский университет Минздрава России, Киров, Россия (610998, г. Киров, ул. К. Маркса, 112), e-mail: [email protected]
Доказанный эффект дексаметазона вызывать снижение показателей клеточного иммунитета с успехом можно использовать для разработки модели иммуносупрессии. Наиболее обосновано использование данной модели для воспроизведения антропонозных инфекций на животных, что позволит проанализировать характер течения, патоморфологическую и гистологическую картину заболевания, отработать схемы лечения заболевания на животных. Кроме этого, модель иммуносупрессии на животных с успехом можно использовать для оценки иммуномодулирующего действия новых иммунобиологических препаратов.
Цель работы - разработать биологическую модель иммуносупрессии при помощи дексаметазона. В работе было использовано 20 нелинейных мышей обоего пола весом 15-20 г. Для создания иммуносупрессии применялся дексаметазон, трехкратно, по 0,1 мл, в дозировке 40 мкг на животное. Оценку влияния дексаметазона на клетки крови животных проводили путем выделения спленоцитов с последующим подсчетом лимфоцитов селезенки в камере Горяева. Параллельно на фоне введения дексаме-тазона анализировали динамику содержания лимфоцитов в периферической крови методом проточной цитофлуориметрии с использованием моноклональных антител, меченных флуорохромами. По результатам исследования было установлено, что доза дексаметатазона 40 мкг на животное в сутки при трехкратном введении не вызывает достоверного снижения лимфоцитов селезенки, однако приводит к абсолютному и относительному снижению всех популяций и субпопуляций лимфоцитов в периферической крови.
Разработанную при помощи дексаметазона модель биологической иммуносупрессии можно считать оптимальной для проведения экспериментальных исследований по изучению антропонозных инфекций и исследованию фармакокинетики новых иммуномодулирующих препаратов.
Ключевые слова: биологическая модель, иммуносупрессии, дексаметазон, иммуномодуляторы, антропоноз-ные инфекции.
DEVELOPMENT OF A BIOLOGICAL MODEL OF IMMUNOSUPPRESSION USING DEXAMETHASONE
Bogacheva N.V., Tuneva N.A., Smirnov A.A., Galyamova D.A., Popesky L. I.
Kirov State Medical University, Kirov, Russia (610998, Kirov, K. Marx St., 112), e-mail: [email protected]
The proven effect of dexamethasone to cause a decrease in cellular immunity can be successfully used to develop an immunosuppression model. The use of this model for reproducing anthroponotic infections is the most useful. The ability to reproduce anthroponotic infections in animals will make it possible to analyze the progress of the disease, its pathological and histological picture, to practice different treatment regimens for the disease in animals. In addition, the immunosuppressive animal model can be successfully used to evaluate an immunomodulating effect of the new immunobiological drugs.
The aim of the study is to develop an immunosuppression biological model using dexamethasone. The experiments were carried out on 20 non-inbred mice of both sexes 15-20 gr each. To develop immunosuppression the mice were injected 0,1 ml of dexamethasone three times a day (40 ^g per animal). To evaluate the effect of dexamethasone on blood cells of the animals splenic lymphocytes were isolated and counted using a hemocytometer. At the same time, dynamics of lymphocytes in the peripheral blood was analyzed using monoclonal antibodies labeled with fluorochromes by flow cytometry.
The results of the study show that injections of dexamethasone, 40 ^g per animal three times a day, don't decrease the number of splenic lymphocytes, but do decrease all populations and subpopulations of lymphocytes in the peripheral blood. Thus, the model of biological immunosuppression which was developed using dexamethasone, can be considered the most suitable for carrying out experimental studies with anthroponosis and studying pharmacokinetic properties of new immunomodulating drugs.
Key words: biological model, immunosuppression, dexamethasone, immunomodulators, anthroponous infections.
Введение
Дексаметазон включен Всемирной организацией здравоохранения в перечень жизненно необходимых лекарственных средств для медицинского применения. Основным эффектом, вызываемым дексаметазоном в организме человека, является им-муносупрессия [1]. Дексаметазон применяется как лекарственный препарат при заболеваниях, связанных с дисбалансом гормонального фона организма (болезнь Аддисона, тиреоидит, гипотиреоз), при аллергических заболеваниях (поллиноз, бронхиальная астма, отек Квинке, крапивница и т.д.), при заболеваниях нервной системы (черепно-мозговые травмы, невриты), при заболеваниях крови (болезнь Ходжки-на, лейкоз, лейкопения), при нефротическом синдроме, тяжелых инфекционных заболеваниях и др. [2]
Доказанный эффект дексаметазона вызывать снижение показателей клеточного иммунитета с успехом можно использовать для разработки модели иммуносупрессии. Целесообразность разработки данной модели на лабораторных животных для проведения экспериментальных исследований показана в работах [3-5]. Наиболее обосновано использование ее для воспроизведения антропонозных инфекций на животных, что позволит проанализировать характер течения, патоморфологическую и гистологическую картину заболевания, отработать схемы лечения заболевания на животных. Кроме этого, модель иммуносупрессии на животных с успехом можно использовать для оценки иммуномодулирующего действия новых иммунобиологических препаратов.
Все вышесказанное определяет актуальность и цель исследования: разработать биологическую модель иммуносупрессии, основанную на применении дексаметазона.
Материал и методы
В работе было использовано 20 нелинейных мышей обоего пола весом 15-20 г.
Для создания иммуносупрессии применяли раствор дексаметазона в ампулах 4 мг/мл (ОАО «Даль-химфарм», Хабаровск).
Для выделения селезенки у мышей использовали препаровальный столик, фиксирующие иглы, остроконечные и тупые ножницы, пинцеты, корнцанги, чашки Петри, пробирки типа «Эппендорф» («Eppendorf», Германия), металлические ситечки, пластиковые пробирки емкостью 15 мл («Gongdong», Китай), раствор Хэнкса («Thermo Fisher Scientific», США), весы («ТехноГарант», Россия), 96% этиловый спирт (ГОСТ 18300-87).
Для выделения лимфоцитов селезенки лабораторных животных использовали раствор фиколл-урографина р = 1,083 г/мл («ПанЭко», Россия), фос-фатно-солевой буфер с рН 7,2-7,4 («Росмедбио», Россия), одноканальные автоматические пипетки объемом 2,5-10 мкл, 200 мкл, 1000 мкл («Eppendorf» Германия), центрифужные пробирки («Gongdong», Китай), настольную центрифугу («Beckman Coulter», США).
Микроскопию и подсчет выделенных из селезенки клеток проводили в камере Горяева («Росмед-био», Россия), используя микроскоп («Микмед-2», Россия).
Определение уровня содержания лимфоцитов в периферической крови животных проводили на проточном цитофлуориметре «Navios» («Beckman
Coulter», США) с использованием моноклональ-ных антител CD45PE-Cy5, CD3-PE-Cy7, CD4-APC, CD19-FITC («Beckman Coulter», США). Для подсчета абсолютного количества лимфоцитов использовали референсные частицы Flow-Count Fluorospheres («Beckman Coulter», США).
Расчет средних значений и доверительных интервалов проводили с помощью программы «Statistica 6.0». Перед расчетом достоверности различий между средними арифметическими величинами при уровне значимости 95% проведена проверка того, что полученные экспериментальные данные подчиняются нормальному закону распределения и дисперсии выборок незначительно отличаются одна от другой.
Результаты и их обсуждение
В работе использовали 20 нелинейных мышей обоего пола, полученных из медико-биологического центра биомоделирования Кировского ГМУ: 10 контрольных и 10 опытных. Все работы с животными проводили в соответствии с морально-этическими принципами проведения биомедицинских экспериментов на животных, сформулированными Международным советом медицинских научных обществ (CIOMS) и Хельсинкской декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (2000 г.).
Дозу дексаметазона, необходимую для проведения исследования, рассчитывали, отталкиваясь от максимальной терапевтической дозы для человека (0,1 мг/кг в сутки), пересчитывая ее на мышь на основе данных [6, 7]. При этом использовали формулу (1): D = d-K, (1)
где
D - доза, вводимая мыши; d - доза, вводимая человеку; k - отношение коэффициентов (кч/км) соотношения поверхности тела и массы тела для человека и изучаемого животного (мыши);
Вычисление значения коэффициента k проводили, используя формулы (2, 3, 4):
K = к /к (2);
мч
кч = S /m , (3)
ч ч' v 7
где
тч -масса тела человека, равная 70 000 г; S - площадь тела человека, равная, при весе 7000 г,ч18 000 см2;
к = S /т , (4)
м м м v '
где
m - масса тела мыши, равная 20 г;
м А
Sh - поверхность тела мыши, равная 78 см2. Таким образом, используя вышеуказанные формулы и значения, рассчитали коэффициент К (равен 15). Для надежности воссоздания состояния имму-носупрессии данный коэффициент был увеличен до 20. По данным авторов [6, 7], интенсивность обмена веществ и скорость метаболизма введенного препарата у мыши массой 15-20 г приблизительно в 15-20 раз выше, чем у человека массой 70-75 кг. Таким образом, 15-20-кратное превышение дозы препаратов при введении мышам относительно доз тех же препаратов при введении человеку адекватно для харак-теризации и сравнения эффектов, вызываемых определенными препаратами у мышей и человека [6, 7].
Доза дексаметазона, рассчитанная по формуле 1, составила 2 мг/кг в сутки или 40 мкг на 20 г в сутки, с учетом общестатистического веса мыши.
На втором этапе проводили введение дексаме-
тазона опытной группе животных. Препарат вводили в дозе 40 мкг 1 раз в сутки в течении 3-х дней, вну-трибрюшинно.
На четвертый день опытную и контрольную группу животных подвергали эвтаназии, используя для ингаляционной анестезии диэтиловый эфир.
Дальнейшие исследования проводили в соответствии с алгоритмом, представленным на рисунке 1.
После наступления смерти у животных с соблюдением правил асептики выделяли селезенку. Селезенку стерильным пинцетом помещали в пробирку типа «Эппендорф» с 2 мл охлажденного раствора Хэнкса и взвешивали на аналитических весах. После взвешивания селезенку помещали в металлическое сито из нержавеющей стали и измельчали стерильным пинцетами, стараясь перевести в суспензию возможно большее число клеток.
Полученную от каждой мыши клеточную суспензию собирали в пробирку стерильным шприцем через иголку и выпускали в центрифужную пробирку. Содержимое всех пробирок доводили раствором Хенкса до одинакового уровня и центрифугировали при режиме 1500 об/мин 10 мин.
По окончании центрифугирования надосадоч-ную жидкость удаляли. Дальнейшее разделение клеток проводили, используя градиент плотности р = 1,083 г/мл.
С этой целью в отдельную пробирку добавляли 1 мл градиента плотности и аккуратно 1:1 наслаивали на него суспензию клеток. Содержимое пробирок центрифугировали, используя тот же режим. По окончании центрифугирования белую суспензию клеток собирали в отдельную пробирку и доводили содержимое до 1 мл (рис. 1).
Рис. 1. Алгоритм методики выделения мононуклеаров из селезенки мышей
Учитывая высокую концентрацию клеток в 1 мл и сложность их подсчета в камере Горяева, проводили ряд последовательных разведений, после чего заполняли камеру Горяева и проводили подсчет клеток в 50 больших квадрантах камеры Горяева. При расчете концентрации клеток использовали следующую формулу (5).
А = В-10 000-К, (5)
где
А - концентрация клеток, выделенных из селезенки мышей в 1 мл;
В - 10 000 - стандартный коэффициент при подсчете клеток в 50 квадрантах камеры Горяева;
К - коэффициент разведения клеток перед подсчетом.
Результаты исследования по оценке влияния дексаметазона на состояние селезенки и количественный уровень лимфоцитов в опытной и контрольной группах мышей представлены в таблице 1.
Из данных, представленных в таблице, следует, что масса селезенки и количество лимфоцитов на фоне введения дексаметазона статистически значимо не изменились.
Параллельно определяли содержание лимфоцитов в периферической крови животных, используя моноклональные антитела, меченные флюорохро-мами, методом проточной цитофлуориметрии. Для этого до введения дексаметазона и перед процедурой эвтаназии у каждого животного забирали 50 мкл крови из периорбитальной области в пробирку типа «Эппендорф», куда заранее добавляли 2 мкл 0,01 М раствор этилендиаминтетраацетата. Процедуру подготовки крови к исследованию проводили в соответствии с инструкцией по применению монокло-нальных антител. Результаты определения уровня содержания лимфоцитов в периферической крови животных на фоне введения дексаметазона на четвертый день относительно начала введения препарата представлены в таблице 2.
Из данных, представленных в таблице 2, следует, что на фоне введения дексаметазона достоверно снижается общее количество всех популяций и субпопуляций лимфоцитов. Снижение абсолютного количества лимфоцитов происходит преимущественно за счет Т-лимфоцитов, среди последних - за счет Т-хелперов. Динамика относительных показателей
Таблица 1
Результаты оценки влияния дексаметазона на состояние селезенки и количественный уровень лимфоцитов в опытной и контрольной группах мышей
№ мыши ^^^^^ Показатель 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Х ± I95
Контрольная группа (n = 10)
Масса селезенки, г 0,1 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,3 0,2 0,1 0,18 ± 0,04
Количество лимфоцитов в селезенке, кл 108 Н 4,1 25,0 6,2 3,1 3,6 14,0 7,4 5,8 30,5 11,1 ± 6,59
Опытная группа (n = 10)
Масса селезенки, г 0,2 0,1 0,3 0,4 0,2 0,1 0,2 0,1 0,7 0,1 0,24 ± 0,12
Количество лимфоцитов в селезенке, кл 108 6,8 5,4 6,3 6,7 13,8 15,7 17,2 8,8 4,0 6,0 9,07 ± 3,1
Примечание: «Н» - выделение клеток не проводилось.
Таблица 2
Динамика содержания лимфоцитов в периферической крови у контрольной и опытной группы
мышей на фоне введения дексаметазона
Клетки крови/СБ-маркер Абсолютное количество клеток (X ± 195) в контрольной (1) и опытной (2) группах мышей, кл.-103/мкл Относительное количество клеток (Х ± 195) в контрольной (3) и опытной (4) группах мышей, %
1 2 3 4
Гранулоциты/СБ45 12,8 ± 1,0 11,2 ± 2,4 96,5 ± 1,2 97,3 ± 1,6
Лимфоциты/СБ3+СБ19+ 8,4 ± 0,8 4,7 ± 1,4 65,4 ± 3,5 49,5 ± 2,4
Т-лимфоциты/СБ3+- 5,2 ± 0,7 3,3 ± 1,1 61,93 ± 3,4 52,9 ± 2,8
В -лимфоциты/СБ19+ 2,4 ± 0,3 1,5 ± 0,3 29,3 ± 3,8 46,5 ± 1,7
Т-лимфоциты хелперы/СБ4+ 3,3 ± 0,2 2,5 ± 0,2 52,8 ± 1,2 49,7 ± 1,3
Т-лимфоциты цитотоксические/СБ8+ 2,1 ± 0,2 0,8 ± 0,1 44,7 ± 1,6 48,1 ± 0,9
клеток соответствует абсолютным значениям и свидетельствует о сформировавшемся состоянии иммунодефицита в организме животных на фоне введения дексаметазона по выбранной схеме.
Отсутствие значимого изменения количества клеток в селезенке на фоне введения дексамета-зона в противовес достоверному снижению Т- и В-лимфоцитов в периферической крови мышей может быть связано с кинетикой клеточного цикла спле-ноцитов и процессами рециркуляции лимфоцитов в организме животных [8].
Выраженное снижение всех популяций и субпопуляций лимфоцитов является подтверждением достижения цели работы - разработки биологической модели иммуносупрессии, в то же время отсутствие подавления количественного состава клеток в селезенке (сохраненый иммунный ответ в морфологически неповрежденном периферическом иммунном органе) обеспечивает возможность использования разработанной модели иммуносупрессии для проведения экспериментальных исследований, например, для обеспечения наилучшей приживаемости бактериального или вирусного антигена при создании модели антропонозной инфекции в организме лабораторного животного.
Заключение
Таким образом, по результатам работы установлено, что трехкратное введение дексаметазона в дозировке 40 мкг позволяет разработать биологическую модель иммуносупрессии, оптимальную для воспро-
изведения и отработки на животных схем лечения ан-тропонозных инфекций, а также для оценки эффекта действия иммуномодуляторов нового поколения перед внедрением их в практическую медицину.
Литература/References
1. Распоряжение Правительства РФ № 2323-р от 23 октября 2017 г. «Об утверждении перечня жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов на 2018 год». Приложение № 1. [Resolutions of the Government of the Russian Federation №2323-r of 23 October 2017. «On approval of the list of essential and essential drugs for 2018». Prilozhenie №1. (In Russ.)]
2. Комердус И.В., Будул Н.А., Чеканова А.В. Системное действие глюкокортикоидных препаратов: в помощь врачу общей практики (Обзор литературы) // Русский медицинский журнал. 2017. T. 25. № 1. С. 45-48. [Komerdus I.V., Budul N.A., Chekanova A.V. Systemic effect of glucocorticoid drugs: to help the general practitioner (review). Russkii meditsinskii zhurnal. 2017; 25 (1): 45-48. (In Russ.)]
3. Ковшик И.Г., Мельникова Е.В., Пантелеева Н.Г., Тендитник М.В., Шурлыгина А.В., Труфакин В. А. Влияние различных суточных режимов введения ИЛ-2 на иммунный статус мышей СВА в модели циклофосфановой имму-носупрессии // Аллергология и иммунология. 2007. Т. 8. № 1. С. 5. [Kovshik I.G., Mel'nikova E.V., Panteleeva N.G., Tenditnik M.V., Shurlygina A.V., Trufakin V.A. The effect of different daily regimens for the administration of IL-2 on the immune status of CBA mice in a model of cyclophosphane immunosuppression. Allergologiya i immunologiya. 2007; 8 (1): 5. (In Russ.)]
4. Жамсаранова С.Д., Гонгаева А.Г. Оценка имму-нобиологчиеской эффективности аутолизатов селезенки яков на модели азатиоприновой иммуносупрессии // Acta Biomedica Scientifica. 2012; 4-1 (86): 190-192. [ Zhamsaranova S.D., Gongaeva A.G. Evaluation of immunobiological efficacy of autolysates of yak spleen on a model of azathioprine immunosuppression. Acta Biomedica Scientifica. 2012; 4-1 (86): 190-192. (In Russ.)]
5. Мальдов Д.Г., Ильичев А.В., Лебединская Е.А., Фадеева Е.В., Лебединская О.В., Ахматова Н.К., Четвертных В. А., Годовалов А.П., Мелехин С.В., Киселевский М.В. Действие стимфорте на мононуклеарные лейкоциты и лим-фоидные органы мышей на фоне введения циклофосфана. // Медицинская иммунология. 2011. №13 (2, 3). С. 133-138. [Mal'dov D.G., Il'ichev A.V., Lebedinskaya E.A., Fadeeva E.V., Lebedinskaya O.V., Akhmatova N.K., Chetvertnykh V.A., Godovalov A.P., Melekhin S.V., Kiselevskii M.V. The effect of stimforte on mononuclear leukocytes and lymphoid organs of mice on the background of the introduction of cyclophosphamide. Meditsinskaya immunologiya. 2011;13(2-3):133-138. (In Russ.)]
6. Трахтенберг И.М., Сова Р.Е., Шефтель В.О., Оникиенко Ф.А. Проблема нормы в токсикологии (Со-
временные представления и методические подходы, основные параметры и константы). М.: Медицина, 1991. 208 с. [Trakhtenberg I.M., Sova R.E., Sheftel' V.O., Onikienko F.A. The problem of the norm in toxicology (Sovremennye predstavleniya i metodicheskie podkhody, osnovnye parametry i konstanty). Moscow: Meditsina; 1991. 208 p. (In Russ.)]
7. Патент РФ на изобретение № 2 398 596 C2/ 10.09.10. Скарнович М.О., Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н., Кабанов А.С., Мазуркова Н.А., Даниленко Е.Д., Масычева В.И., Дроздов И.Г. Способы профилактики и лечения заболеваний, вызванных вирусом гриппа птиц A/H5N1, с использованием индуктора интерферона и ингибитора нейро-минидазы [Patent RF № 2 398 596 C2/ 10.09.10. Skarnovich M.O., Shishkina L.N., Sergeev A.N., Kabanov A.S., Mazurkova N.A., Danilenko E.D., Masycheva V.I., Drozdov I.G. Sposoby profilaktiki i lecheniya zabolevanii, vyzvannykh virusom grippa ptits A/H5N1, s ispol'zovaniem induktora interferona i ingibitora neirominidazy. (In Russ.)]
8. Ярилин А.А. Иммунология. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. 748 с. [Yarilin A.A. Immunologiya. Moscow: GEOTAR-Media; 2010. 748 p. (In Russ).]
Внешние источники финансирования отсутствовали.
УДК [612.886+612.67] - 055.2
ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ СЕНСОРНОГО ОРГАНИЗАЦИОННОГО ТЕСТА У ЖЕНЩИН ПОЖИЛОГО ВОЗРАСТА С ПОСТУРАЛЬНОЙ СТАБИЛЬНОСТЬЮ
'Дёмин А.В., 1,2Гудков А.Б., 2Попова О.Н., 3Торшин В.И.
1ФГАОУ ВО Северного (Арктического) федерального университета имени М.В. Ломоносова, Архангельск, Россия (163002, г. Архангельск, Набережная Северной Двины, 17), e-mail: [email protected] 2ФГБОУ ВО Северный государственный медицинский университет, Архангельск, Россия (163000, г. Архангельск, Троицкий проспект, 51), e-mail: [email protected]
3ФГАОУ ВО Российский университет дружбы народов, Москва, Россия (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 8), e-mail: [email protected]
Цель работы: установить возрастные особенности компонентов постурального баланса по данным сенсорного организационного теста у женщин 55-64 лет с постуральной стабильностью.
Было обследовано 412 женщин, которых разделили на две возрастные группы: первая группа 55-59 лет (n = 175), вторая - 60-64 года (n = 237). Проводили Sensory Organization Test (SOT) компьютерного постуро-графического (стабилометрического) комплекса «Smart Equitest Balance Manager».
Установлено, что у женщин после 59 лет наблюдается снижение качества функции равновесия в пробах 1-3; постуральной стратегии в пробах 1, 2, 4-6 и результирующей оценки постуральной стратегии всего SOT. Кроме того, у женщин 60 лет и старше повышается степень предпочтения зрительной информации в контроле над балансом под воздействием факторов окружающей среды.
Возрастные изменения компонентов постурального баланса у женщин после 59 лет происходят независимо от функции постуральной стабильности. Показатели качества функции равновесия в пробе 6, результирующей оценки качества функции равновесия всего SOT, а также степени участия зрительной и вестибулярной информации в контроле над балансом становятся одними из важных параметров оценки преждевременного изменения компонентов постурального баланса у пожилых людей.
Ключевые слова: компьютерная постурография (стабилометрия), Sensory Organization Test, постуральный баланс, женщины 55-64 лет, постуральная стабильность.
AGE-RELATED PECULIARITIES OF INDICATORS IN SENSORY ORGANIZATIONAL TEST FOR OLDER WOMEN HAVING POSTURAL STABILITY
'Dyomin A.V., ',2GudkovA.B., 2Popova O.N., 3Torshin V.I.
'Northern (Arctic) Federal University named after M.V. Lomonosov, Arkhangelsk, Russia (163002, Arkhangelsk, Embankment of the Northern Dvina, 17), e-mail: [email protected]
