CC BY
55
УДК 615.277.3+[615.371]:612.112 Е.А. Лебединская1, Л.Ф. Лосева2, Д.Н. Гусин1, Н.К. Ахматова2, И.Б. Семёнова2, О.В. Лебединская1 ВЛИЯНИЕ ВАКЦИНЫ ВП-4 НА ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ
И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ИНДУЦИРОВАННОЙ ИММУНОСУПРЕССИИ
:ГОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера МЗ РФ», кафедра гистологии, Пермь;
2Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва Контактная информация:
Лосева Любовь Федоровна, младший научный сотрудник лаборатории терапевтических вакцин адрес: 121552, г. Москва, Рублевское шоссе, 109-5-98; тел. +7(499)-149-76-85; моб. +7(916)-812-72-88 e-mail: L [email protected]
Статья поступила 07.06.2009, принята к печати 23.10.2009.
Резюме
В работе исследовалось иммуносупрессивное действие циклофосфана, введение которого в определенных дозах мышам линии СВА приводило к значительному уменьшению абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови и селезенке, изменению субпопуляционного состава лимфоцитов и снижению их функциональной активности. Показана возможность коррекции вызванных циклофосфаном изменений с помощью отечественного иммуномодулятора бактериального происхождения Иммуновак ВП-4, дающего быстрый нормализующий эффект. Это может иметь большое значение для предупреждения инфекционных осложнений у онкологических больных с проявлениями индуцированной химиопрепаратами иммуносупрессии. Учитывая вышеизложенное, а также полученные ранее данные о способности Иммуновак ВП-4 стимулировать противоинфекционный и противоопухолевый иммунитет, представляется целесообразным проведение клинических испытаний этого препарата для профилактики нарушений иммунного статуса у онкологических больных после проведения курсов химиотерапии.
Ключевые слова: циклофосфан, цитостатики, индуцированная иммуносупрессия, Иммуновак ВП-4, лимфоциты, иммунофенотип, цитотоксическая активность.
E.A. Lebedinskaya1, L.F. Loseva2, N.K. Ahmatova1, I.B. Semenova2, O.V. Lebedinskaya2, M.V. Kiselevskiy1 THE INFLUENCE OF VACCINE VP-4 ON PHENOTYPIC AND FUNCTIONAL CHARACTERISTICS
OF MONONUCLEAR LEUCOCYTES DURING INDUCED IMMUNOSUPPRESSION
'E.A. Vagner State Medical Academy, Perm
2I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera of RAMS, Moscow
Abstract
Immunosupressive activity of cyclophosphan was evaluated at Wistar CBA mice. Injection of cyclophosphan induced a significant decrease of lymphocytes in peripherial blood samples and in spleen; subpopulations of lymphocytes were changed and its functional activity was reduced. Immunovak VP-4, bacterial immunomodulator, rapidly corrects cyclophosphan-induced changes. The observed effect may play a significant role at prevention of infectious complications after chemotherapy-induced immunosuppression. Based on the above mentioned data that Immunovak is capable to stimulate antiinfectious and antitumour immune response we conclude that it is important to perform clinical trial to investigate Immunovak VP-4 capability to prevent immune response failure after chemotherapy.
Key words: cyclofosfan, cytostatics, induced immunosuppression, Immunovak VP-4, lymphocytes.
Введение
При лечении злокачественных новообразований на иммунную систему больных супрессивное действие оказывают множество факторов, включая сам опухолевый процесс, химиотерапевтические препараты и кортикостероиды. Оценивая влияние ХТ на иммунную систему, важно дифференцировать иммунодепрессию и миелосупрессию [7]. Многие химиотерапевтические агенты обладают миелосупрессив-ным действием, ингибируя продукцию форменных элементов крови в костном мозге.
Иммунодепрессия проявляется ослаблением иммунного ответа из-за уменьшения количества В- и Т-лимфоцитов, а также снижением содержания отдельных субпопуляций лимфоцитов даже при нормальном абсолютном количестве лимфоидных клеток. На фоне индуцированной химиопрепаратами
иммуносупрессии происходит истощение Т-лимфоцитов. Е. А^иша et а1. [4] показали, что снижение содержания ЄБ4+.
Т-клеток отмечается в течение пяти лет после проведения химиотерапии. При действии цитостати-ков ЄБ8+ Т-лимфоциты приходят в исходное состояние значительно быстрее, чем ЄБ4+ Т-клетки [9]. Однако установлено, что после химиотерапии относительно быстрое увеличение в периферической крови ЄБ8+ Т-клеток не сопровождается восстановлением нормальной функции данного подтипа лимфоцитов. Значительная часть таких клеток характеризуется сниженной экспрессией ко-стимулирующих молекул ЄБ28 [10]. Экспрессия антигенов ЄБ28 на ЄБ8+ Т-клетках не восстанавливается в течение года после окончания химиотерапии. Несмотря на снижение числа Т-лимфоцитов, оставшиеся клетки, могут активизироваться и продуцировать цитокины [5; 6].
Вследствие химиотерапии снижается и количество НК, и их цитостатическая активность, причем процесс восстановления у них идет быстрее, чем у других подтипов лимфоцитов [3; В; 11; 13; 15]. Эксперименты показали, что химиопрепараты подавляют пролиферативную активность селезеночных лимфоцитов, и этот эффект дозозависим. Учитывая вышесказанное, представляется целесообразным провести исследования иммунологических параметров при использовании цитостатиков для поиска адекватных методов коррекции вызываемых ими изменений.
В существующих подходах применяются различные цитокины, чаще всего - колониестимулирующие факторы GM-CSF и G-CSF, сокращающие длительность нейтропении, но при этом, как было показано авторами, не влияющие на состояние здоровья и продолжительность жизни больных [12].
Некоторые исследования продемонстрировали положительное действие потенциала цитокинов, которые обычно используются для коррекции иммунной системы. Например, ИЛ-2 в сочетании с G-CSF не только нормализовали число нейтрофилов, но и повышали количество и активность эффекторов противоопухолевого иммунитета - НК и Т-лимфоцитов [14].
Данные клетки могут содействовать устранению остаточных явлений при лечении отдельных видов злокачественных новообразований. Проведенные ранее экспериментальные исследования выявили, что отечественный препарат, поликомпонентная вакцина бактериального происхождения Иммуновак ВП-4, оказывает стимулирующее действие на клеточное звено иммунитета и обладает противоинфекционной и противоопухолевой активностью [1; 2].
На основании вышеизложенного была определена цель данной работы - изучение влияния вакцины Иммуновак ВП-4 на иммунофенотип и функциональную активность лимфоцитов селезенки мышей на фоне индуцированной ЦФ иммуносупрессии.
Материалы и методы
Объекты исследования
Исследования проведены на 240 мышах линий СВА и Balb/с в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Препараты и способы их введения
В исследованиях использованы препараты: ЦФ Лэнс (Россия) и поликомпонентная вакцина Иммуновак вП-4 (НИИ ВС им. И.И. Мечникова РАМН, г. Москва), состоящая из антигенных компонентов St. aureus, Kl. pneumoniae, Pr. vulgaris и Esch. coli.
Иммуносупрессию индуцировали внутрибрю-шинным введением циклофосфана в дозе 100 мг/кг веса в 0,2 мл физ. р-ра, трехкратно, ежедневно. Имму-новак ВП-4 вводили в/б в дозе 200 мкг/мышь в 0,2 мл физ. р-ра однократно через 24 ч после завершения курса инъекций ЦФ, или в качестве контроля (без ЦФ) однократно внутрибрюшинно в той же дозировке в 0,2 мл физ. р-ра. Контрольной группой являлись интакт-ные мыши. Селезенки мышей контрольной и трех экспериментальных групп исследовались через 4В; 96 и 16В ч после введения иммуномодулятора.
Выделение мононуклеарных лейкоцитов
Селезенки мышей гомогенизировали, добавляли среду 199. Полученную взвесь центрифугировали при 400 g в течение 30 мин, в градиенте плотности фиколл-урогафин («Pharmacia», США, p=1,077 г/см3). МЛ, образовавшие интерфазное кольцо, собирали
пипеткой и трехкратно отмывали в среде 199. После каждой отмывки в 10-кратном объеме среды клетки осаждали центрифугированием при 200 g. Концентрацию клеток доводили до 1х106 кл/мл.
Проточная цитометрия (FACS-анализ) и характеристика антител
Оценку субпопуляционной структуры лимфоцитов осуществляли методом проточной цитометрии с применением МКА против клеточных антигенов (Caltag Laboratories, США). Клетки отмывали холодным ФСБ с 1 %-ной ФТС и окрашивали FITC- и PE-мечеными МКА согласно инструкции. Окрашенные клетки отмывали 2 раза холодным ФСБ. Результаты учитывали на проточном цитометре FacsCalibur (Becton Dickinson, США). На МЛ селезенок мышей исследовали уровни экспрессии молекул субпопуляций Т-клеток ^D3, CD4, CD8, СD4/CD25/Foxp3), В-лимфоцитов (CD19), NK, NKT (CD3/NK) и белков MHC I и II классов. Гейт (окно) популяции клеток устанавливали на основе комбинации прямого и бокового светорассеяния и размера клеток. При учете результатов подсчитывали 5 000 клеток в гейте. Статистическую обработку данных проводили при помощи программного пакета WINMDI 2.8.
Цитотоксический тест
Для выявления цитотоксической активности МЛ селезенок использовали тест восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия ро-мида (МТТ-тест). Цитотоксическую активность МЛ определяли на линии клеток К-562.
Опухолевые клетки (3х104 в 1 мл) инкубировали в культуральной среде с МЛ в соотношении 1:5; 1:2,; 1:1 в плоскодонных 96-луночных микропланшетах (Costar, Франция) 18 ч при 37 °С, в атмосфере 4,5 %-ного СО2. Затем в лунки добавляли 5%-ный витальный краситель МТТ (Sigma, США) и по оптической плотности при X 540 нм, измеряемой на мультискане МS (Labsystem, Финляндия), рассчитывали процент лизиса опухолевых клеток (% цитотоксичности).
Культивирование клеток К-562
Клетки-мишени NK-чувствительной опухолевой линии К-562 (эритробластный лейкоз человека) культивировали в среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия) с добавлением 5%-ной ФТС и 50 мкг/мл гентамицина при 37 °С, в атмосфере 4,5 %-ного СО 2.
Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стъюдента, критерия Вилкоксона при помощи стандартного пакета статистических программ Windows 2003 (StatSoft 6.0).
Результаты и обсуждение
Поведенные исследования показали, что введение мышам ЦФ приводит к резкому снижению содержания МЛ в селезенках мышей с максимумом на 2-3 сут после последней инъекции. Из табл. 1 видно, что в селезенке интактой мыши содержится 7203070±32503 МЛ, в то время как после введения ЦФ из органа выделяется всего 1325000±2569 МЛ. Введение мышам вакцины ВП-4 нивелирует данные изменения, поскольку в этом случае вызванная ЦФ лимфодеплеция имеет менее выраженный характер (из селезенки выделяется 3288000±5560 МЛ). Аналогичная тенденция наблюдается в отношении клеточного состава периферической крови животных. У мышей, получавших ЦФ, отмечается выраженная нейтро- и лимфопения, а применение на этом фоне ВП-4 приводит к появлений значимого количества лейкоцитов в периферической крови.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ ВЛИЯНИЕ ВАКЦИНЫ ВП-4 НА... 71
Таблица 1
Количество МЛ, выделенных из селезенки мышей в группах 1-3________________________________________
Группа мышей Количество выделенных МЛ
Контроль 7200000±32503
Группа ЦФ 1325000±2569
Группа ЦФ+ВП-4 3288000±5560
Таблица 2
Влияние ВП-4 на НК-активность МЛ селезенки мышей с индуцированной ЦФ иммуносупрессией, %_________
1 после введения, ч Группа/препараты НК-активность при соотношении клетка мишень/эффектор
1:5 1:2 1:1
0 1/- 73,4±5,6 39,3±1,2 27,9±0,8
48 2/ЦФ 34,1±3,7* 20,1±2,2* 14,5±0,6*
3/ЦФ+ВП-4 63,2±2,9** 40,8±2,7** 22,3±1,2**
96 4/ЦФ 39,6±1,2* 27,1±3,1* 9,3±0,1*
5/ЦФ+ВП-4 57,3±2,4** 35,4±1,8 12,9±0,1*
168 6/ЦФ 52,7±3,1* 43,6±0,9 35,4±1,5
7/ЦФ+ВП-4 49,5±1,9* 41,4±2,0 33,9±2,7
* Статистически значимые различия по сравнению с контролем (группой 1), р<0,05 ** Статистически значимые различия между группами 2 и 3, 4 и 5, р<0,05
10*
10й 10' 102 10э С04-РІТС
10*
ГО О
Ш гч □_ О і , ко -X Сі _ о ■■.'дар; _ ■ V <■ . її
т_- б&ь,-.-...
10° і . ... ЯР;
10й
С03-РІТС
Контроль
ЦФ
10' 102 10э 10* СОЗ-РІТС
ЦФ+ВП-4
Рисунок Экспрессия поверхностных молекул СБ19/СБ8, СБ25/СБ4, БХ5/СБ3 мононуклеарных лейкоцитов селезенки мышей линии СВА:
в контроле, под влиянием ЦФ и при комбинированном введении ЦФ+ ВП-4.
Двойное прижизненное окрашивание МКА, меченными ПТС и РЕ.
На вторые сутки после последнего введения ЦФ регистрируется заметное снижение количества основных субпопуляций лимфоцитов по сравнению с контрольной группой (рисунок). В частности, доля В-клеток (СБ19+) снижается с 22±2 до 7±1,5% (р<0,05). Среди Т-клеток в наибольшей степени подвержены супрессивному действию ЦФ СБ4+-лимфоциты, содержание которых снижается с 37±4 до 17±3 % (р<0,05). Введение ЦФ приводит также к достоверному уменьшению НК (0X5+) - с І2±2 до 3±0,1% (р<0,0і). Наряду с изменением количества перечисленных клеток, отмечается также очевидная тенденция к снижению уровня НКТ (СБ3+/0Х5+) и Т-регуляторных клеток (СВ4+/СБ25+). СБ8+-лимфоцигы были в меньшей степени подвержены действию ЦФ. Восстановление исходных показателей иммунофенотипа в данных условиях регистрировалось на 5-7 сутки после последнего введения цитостатика. Воздействие Иммуновак ВП-4 приводило к нормализации основных изменений иммунного статуса, вызванных цитостатиком. Действительно, в группе мышей, получавших ВП-4 после введения ЦФ, уже на 2 сут. содержание СБ19+-клеток составило 19±5%, а СВ4+-лимфоцитов поднялось до 28±9%. Эти показатели достоверно не отличались от таковых в контрольной серии опытов. Иммуносупрессив-ное действие ЦФ проявлялось не только лимфопенией и изменением субпопуляционного состава лимфоцитов, но и в снижении функциональной активности НК. Уровень НК-активности МЛ селезенок мышей значительно уменьшался уже через сут. после введения ЦФ и полностью не восстанавливался даже к 5 сут. (табл. 2). Применение ВП-4 на фоне ЦФ приводило к достоверному увеличению киллерной активности МЛ, которая, однако, не достигала исходных значений. Таким образом, ЦФ (цитостатик, облычно используемый в экспериментальном моделировании индуцированной иммуносупрессии) наряду с характерной для его действия нейтропенией вызывает выраженную иммуносупрессию, которая проявляется значительным снижением абсолютного количества лимфоцитов в периферической крови и селезенке мышей.
Лимфопения выражается, прежде всего, уменьшением лимфоцитов хелперной группы (СБ4+), В-клеток и натуральных киллеров. Подобные изменения могут приводить к недостаточности врожденного и адаптивного звеньев иммунитета. Как показано в настоящем исследовании, также наблюдается снижение цитотоксической активности НК, что может в значительной степени ослаблять резистентность организма к бактериальным и вирусным патогенам. Уменьшение количества НК и угнетение их функциональной активности, кроме того, повышает вероятность опухолевой прогрессии, особенно на фоне остаточной болезни после радикального лечения. Для профилактики и лечения вызванной цитостаками ней-тропении успешно применяются колониестимулирующие факторы - Г-КСФ и ГМ-КСФ. Однако лишь отдельные исследования посвящены поиску эффективных средств коррекции иммуносупрессии. В частности выявлено, что комбинация Г-КСФ и итерлейкина-2 позволяет нормализовать показатели иммунного статуса у онкологических больных после проведения высо-кодозной ХТ [14]. В настоящей работе показана эффективность применения отечественного иммуномо-дулятра Иммуновак ВП-4, который нивелирует вызываемую ЦФ лимфопению, а также изменения субпопу-ляционного состава лимфоцитов и их функционального состояния. Преимуществом комбинированного применения ЦФ и данного иммуномодулирующего препарата является более быстрое, чем после действия цитостатика, наступление нормализующего эффекта. Этот факт имеет значение для предупреждения инфекционных осложнений, возникающих у онкологических больных с индуцированной химиопрепаратами иммуносупрессией. Учитывая полученные ранее данные о способности Иммуновак ВП-4 стимулировать проти-воинфекционный и противоопухолевый иммунитет, представляется целесообразным проведение клинических испытаний данного препарата для профилактики нарушений иммунного статуса у онкологических больных после прохождения курсов ХТ.
Литература
1. Ахматова Н.К., Лебединская О.В., Киселевский М.В. и др. Влияние дендритных клеток, генерированных при помощи иммуномодуляторов... // ЖМЭИ. - 2005. - № 6. - С. 58-62.
2. Ахматова Н.К., Лебединская Е.А., Лебединская О.В. и др. Усиление цитотоксической активности мононук-леаров периферической крови. // Сибирский онкологический журнал. - 2007. - № 3. - С. 52-3.
3. Alanko S., Salmi T.T., Pelliniemi T.T. Recovery of natural killer cells after chemotherapy for childhood acute lymphoblastic leukemia and solid tumors // Med. Pediatr. Oncol. - 1995. - Vol. 24. - P. 373.
4. Azuma E., Nagai M., Qi J. et al. CD4+ T-lymphocytopenia in long-term survivors following intensive chemother-
apy in childhood cancers // Med. Pediatr. Oncol. - 1998. - Vol. 30. - P. 40.
5. Bruserud O. Cellular immune responses in acute leukemia patients with severe chemotherapy-induced leucopenia characterization. // Cancer Immunol. Immunother. - 1998. - Vol. 46(4). - P. 221-8.
6. Bruserud O., Ulvestad E. Cytokine responsiveness of mitogen-activated T-cells derived from acute leukemia patients with chemotherapy-induced leukopenia // J. Interferon Cytokine Res. - 2000. - Vol. 20. - P. 947.
7. Goldman D. Chronic lymphocytic leukemia. // Clin. J. Oncol. Nurs. - 2000. - Vol. 4. - P. 233.
8. Kamani N., Kattamis A., Carroll A. et al. Immune reconstitution after autologous purged bone marrow transplanta-
tion in children // J. Pediatr. Hematol. Oncol. - 2000. - Vol. 22. - P. 13.
9. Mackall C.L. T-cell immunodeficiency following cytotoxic... // Stem Cells. - 2000. - Vol. 18. - P. 10.
10. Mackall C.L., Fleisher T.A., Brown M.R. et al. Distinctions between CD8+ and CD4+ T-cell regenerative pathways result in prolonged T-cell subset imbalance after intensive chemotherapy // Blood. - 1997. - Vol. 89. - P. 3700.
11. Ohnishi K., Yamanishi H., Naito K. et al. Reconstitution of peripheral blood lymphocyte subsets in the long-term disease-free survivors of patients with acute myeloblastic leukemia // Leukemia. - 1998. - Vol. 12. - P.52.
12. Ozer H., Armitage J.O., Bennett C.L. et al. Update of recommendations for the use of hematopoietic colony-stimulating factors: evidence-based, clinical practice guidelines // J. Clin. Oncol. - 2000. - Vol. 18. - P.3558.
13. Schirmer M., Hilbe W., Geisen F. et al. T-cells and natural killer cells after treatment of hairy cell leukemia with 2-chlorodeoxyadenosine // Acta Haematol. - 1997. - Vol. 97. - P. 180.
14. Sosman J.A., Stiff P., Moss S.M. et al. Pilot trial of interleukin-2 with granulocyte colony-stimulating factor for the mobilization. // J Clin Oncol. - 2001. - Vol. 19. - P. 634.
15. Yuk-Wah Tsang, Kwan-Hwa Chi, Che-Jeh Hu et al. Chemotherapy-induced immunosuppression is restored by a fermented soybean extract: a proof of concept clinical trial // Nutrition Research. - 2007. - Vol. 27. - P. 679-84.
