CC BY
95
© НАСОНОВА М.В., ГЛУШКОВА Т.В., БОРИСОВ В.В., МАТВЕЕВА В.Г., ДОРОНИНА Н.В., ЕЖОВ В.А., КУДРЯВЦЕВА Ю.А. — 2012 УДК: 615.462-036.5
РАЗРАБОТКА БИОДЕГРАДИРУЕМЫХ МЕМБРАН НА ОСНОВЕ ПОЛИОКСИАЛКАНОАТОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ СПАЙКООБРАЗОВАНИЯ В СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ХИРУРГИИ
Марина Владимировна Насонова1, Татьяна Владимировна Глушкова1, Вадим Владимирович Борисов1, Вера Геннадьевна Матвеева,1 Нина Васильевна Доронина2, Владимир Александрович Ежов2,
Юлия Александровна Кудрявцева1 ('НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН, г. Кемерово, директор — д.м.н., проф. О.Л. Барбараш; 2Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино, директор — чл.-корр. РАН А.М. Боронин,_лаборатория метилотрофии, зав. — д.б.н., проф. Ю.А. Троценко)
Резюме. Спайки в кардиохирургии являются серьезным послеоперационным осложнением, который увеличивает риск повторных операций. Для предотвращения спаечного процесса необходимо использовать мембраны, разобщающие раневые поверхности. С целью создания противоспаечных мембран исследованы полимеры класса полиоксиалканоатов. Проведена оценка физико-механических и гемосовместимых свойств мембран на основе по-лигидроксибутирата и сополимера полигидроксибутирата с оксивалератом. Показано, что исследуемые мембраны обладают удовлетворительной прочностью и эластичностью, не оказывают негативного влияния на компоненты крови. При культивировании на поверхности образцов мезенхимальных стволовых клеток крысы жизнеспособность последних составила 66-73%, что свидетельствует о высокой биосовместимости исследуемых полимеров. Мембраны на основе сополимера полигидрокси-бутирата с оксивалератом наиболее перспективны для дальнейших исследований.
Ключевые слова: рестернотомия, спаечная болезнь, противоспаечные мембраны, биодеградируемые полимеры, полигидроксибутират.
BIODEGRADABLE POLYHYDROXYALKANOATE MEMBRANE DEVELOPMENT FOR ADHESION PREVENTION IN CARDIOVASCULAR SURGERY
M.V. Nasonova1, T.V. Glushkova1, V.V. Borisov1, V.G.Matveeva1, N.V. Doronina2, V.A. Ezhov2, Y.A.Kudryavtseva1 ('Federal State Budgetary Institution Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases under the Siberian
Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Kemerovo; 2Biochemistry and Microbial Physiology Research Institute n.a. G.K. Skryabin, Russian Academy of Sciences, Puschino, Moscow region, Russia)
Summary. Adhesions are a serious postoperative complication in cardiac surgery, which increases the risk of reoperations. Anti-adhesive membranes are a necessary component which should be used to prevent the development of adhesive process. To create anti-adhesive membranes polyhydroxyalkanoate polymers were evaluated. Physical, mechanical and hemocompatible properties of polyhydroxybutyrate-hydroxyvalerate membranes were tested. It was demonstrated that the membranes under study were strong and elastic and did not negatively affect blood components. When rat mesenchymal stem cells were cultivated on the surface, the cells survival was 66-73%, which showed high biocompatibility of the polymers under study. Polyhydroxybutyrate-hydroxyvalerate membranes are the most promising and require further studies.
Key words: resternotomy, cardiac adhesions, anti-adhesive membranes, biodegradable polymers, polyhydroxybutirate.
Повторные операции на открытом сердце занимают значительную часть операций в кардиохирургии [1,9]. Рестернотомия — технически сложная процедура и сопровождается более высоким риском, чем первичная операция [9,12]. Вследствие выраженного спаечного процесса удлиняется время операции, увеличивается частота послеоперационных осложнений и летальность. Важным аспектом при проведении повторного хирургического вмешательства является снижение риска реоперации [2,10]. Предотвращение образования послеоперационных спаек является одним из необходимых условий для решения этой проблемы. В настоящее время с целью предотвращения спаечного процесса применяют мембраны, разобщающие раневые поверхности [8,10,11,14]. Наиболее известны мембраны, изготовленные из политетрафторэтилена — Preclude (Pericardial Membrane Gore & Associates Inc., USA) [14]. В тоже время, использование барьерных мембран из синтетического материала, являющихся чужеродным для организма человека и не способных к биодеградации не оптимально, так как может потребовать повторной хирургической операции для удаления или репозиции барьерной мембраны из-за нежелательных реакций воспалительного типа.
В последнее время для предотвращения спаечного процесса за рубежом широко применяют био-деградируемые мембраны Repel-CV (SynteMed, Inc., USA) и Seprafilm (Genzym Corporation, USA) [8, 11, 15]. Литературных данных об использовании этих мембран в Российской Федерации нет. Однако, как показывает опыт, эффективность мембран далека от желаемой и
не превышает 80% [11]. Помимо этого, используемые мембраны имеют еще один серьезный недостаток — сложный цикл изготовления и как следствие высокую стоимость. Эти обстоятельства диктуют необходимость поиска и разработки новых эффективных и биодегра-дируемых противоспаечных мембран. Мы остановили свой выбор на полимере природного происхождения — полигидроксибутирате. Полигидроксибутират (ПГБ) — представитель класса биодеградируемых полимеров — полиоксиалканоатов. Высокая биосовместимость полиоксиалканоатов базируется на том, что 3-гидрокси-масляная кислота — естественный метаболит клеток и тканей животных и человека [13]. Благодаря высокой биосовместимости ПГБ апробирован в качестве сырья для производства рассасывающихся нитей, остеопроте-зов, хирургических пластин, матриц для получения лекарственных форм пролонгирована действия [3].
Цель настоящего исследования: оценить возможность создания биодеградируемых противоспаечных мембран на основе полиоксиалканоатов.
Материалы и методы
В качестве пленкообразующих полимеров использовали полигидроксибутират с молекулярной массой 309 кДа и 541 кДа и сополимер полигидроксибутирата с оксивалератом (ПГБВ) с молекулярной массой 2307 кДа, синтезированные в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (г. Пущино, Московская область). Для растворения биополимеров использовали хлороформ. Пленочные образцы получа-
ли в лабораторных условиях методом полива раствора ПГБ и ПГБВ различной концентрации (от 1 до 5%) на обезжиренную поверхность стекла. Испарение растворителя проводили в различных условиях — при комнатной температуре в беспылевом боксе, в вытяжном шкафу в потоке воздуха, лиофильное высушивание (Labconco, FreeZone 2.5 Plus)
Оценку физико-механических свойств проводили при помощи универсальной испытательной машины Zwiсk/Roell (Германия) путем продольного растяжения образов в соответствии с ГОСТ 270-75. Прочность оценивали по максимальному напряжению при растяжении, эластичность по относительному удлинению. В качестве контроля использовали мембрану Repel-CV (SynteMed, Inc., USA).
Для оценки био- и гемосовместимости применяли комплекс стандартизированных методов [4]. Было изучено влияние мембран на основные компоненты крови — тромбоциты и эритроциты. Агрегационную активность тромбоцитов после контакта с образцами мембран изучали на агрегометре «APACT-4004» (LABITec., Германия). Агрегацию тромбоцитов индуцировали АДФ (2,5 мкг/мл) и коллагеном (20 мкг/мл). Кровь для исследования брали от здоровых добровольцев посредством пункции локтевой вены (самотеком) в пластиковые пробирки (Costar, США) с 3,8% цитратом натрия, в соотношении кровь:цитрат — 9:1. Время контакта образов со свежей кровью составило 10 минут при температуре 37°С. Количество адгезированных тромбоцитов на поверхности образцов и их морфологию оценивали методом сканирующей электронной микроскопии (Hitachi-S3400N, Япония).
Степень гемолиза эритроцитов после контакта с пленочными образцами оценивали по стандартизированной методике, широко используемой при тестировании гемосовместимости материалов in vitro [4].
О цитотоксичности мембран судили по количеству жизнеспособных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) инкубированных с образцами в течение 7 суток. Детекцию жизнеспособных МСК, различной степени
Таблица 1
Влияние молекулярной массы полимера на биосовместимость мембран
Разновидности полимерных плёнок
3% ПГБВ 2307 кДа 3% ПГБ 309 кДа 3% ПГБ 541 кДа
% жизнеспособных МСК 73,1 66,7 67,3
% МСК в раннем апоптозе 25,1 29,1 28,9
% МСК в позднем апоптозе 1,7 3,9 3,7
% некротизированных МСК 0,1 0,3 0,1
Рис. 1. Физико-механические свойства мембран: а) прочность; б) относительное удлинение. * — р<0,05 относительно Кере1-СУ.
Рис. 2. Скорость агрегации тромбоцитов после контакта с образцами мембран.
апопотоза и некроза проводили методом проточной цитофлуориметрии (FACS Calibure, Becton Dickinson, США) с предварительным окрашиванием красителем Annexin V, меченным PE, в комбинации с 7-AAD (BD Biosciences, США).
Обработку полученных результатов проводили общепринятыми методами статистики при помощи программы «STATISTICA 6.0» (StatSoft, Inc., USA). Все данные представлены как средние значения (М) и стандартная ошибка среднего (±m). Для определения различий между двумя независимыми группами использовали непараметрический критерий Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при уровне значимости р<0,05.
Результаты и обсуждение
На первом этапе настоящего исследования были отработаны технологии получения образцов мембран на основе ПГБ. Испарение растворителя в условиях вакуума (с использованием лиофильной сушки) вызывает вспенивание образцов. Высушивание образцов в вытяжном шкафу приводит к неравномерности толщины пленки. Таким образом, приготовление равномерных по толщине образцов мембран из ПГБ наиболее технологично производить путем высушивания в беспылевом боксе при комнатной температуре.
Для разобщающих мембран одним из важных качеств являются прочностные и упруго-деформативные свойства. При оценке прочностных характеристик образцы расположились в следующем порядке по возрастанию: Repel-CV<nreB 2307кДа<ПГБ 309 кДа<ПГБ 541 кДа (рис. 1а). Необходимо отметить, что прочность на-тивной перикардиальной ткани, к которой подшивается мембрана во время операции, составляет 4-5 МПа, таким образом, все образцы обладают достаточной прочностью. Пленки из ПГБ продемонстрировали наибольшую прочность (р<0,05). Использование сополимера ПГБВ на 40% снизило прочность образцов, тем не менее, она значительно выше, чем у образцов Repel-CV (р<0,05).
В тоже время эластичность образцов ПГБВ более чем в 100 раз больше, чем у ПГБ (р<0,01) (рис.1б). Повышение эластичности пленок позволит мембранам лучше адаптироваться в операционной ране, повторять геометрию сердца. По физико-механическим характеристикам пленки из сополимера ПГБВ наиболее близки к Repel-CV. Для получения эластичных мембран оптимальным является использование 3% раствора ПГБ и ПГБВ в хлороформе. Мембраны, приготовленные на основе 1 и 2% раствора хрупкие, а использование более 3% нерационально, поскольку образцы получаются излишне плотные и не эластичные.
Для всех изделий медицинского назначения, и в особенности имеющих контакт с кровью, важно такое качество как гемосовместимость как один из параметров биосовместимости. Это особенно актуально для разобщающих мембран, функционирующих в присутствии крови в грудной полости при операциях в условиях искусственного кровообращения.
Гемосовместимость подразумевает, что материал не должен вызывать изменений функций крови и трансформации её основных компонентов — эритроцитов и тромбоцитов. Известно, что тромбоциты являются пусковым фактором в инициации процесса тромбооб-разования — адгезия и морфологические изменения
Рис. 3. Поверхность образцов после контакта с кровью (сканирующая электронная микроскопия): а) ПГБ 541 кДа (ув. х1000); б) ПГБВ 2307 кДа (ув. х1000); в) ПГБ 309 кДа (на поверхности образца адгезированы одиночные тромбоциты, ув. х1900).
тромбоцитов активируют систему свертывания крови [5]. Таким образом, контактная активация тромбоцитов — изменение их морфологии, агрегация и адгезия на поверхности материала, контактирующего с кровью — служат важными показателями гемосовмести-мости изучаемого биоматериала [4, 6, 7]. Результаты проведенных исследований показали, что после инкубации всех образцов в богатой тромбоцитами плазме, показатели агрегации тромбоцитов не имели статистически значимых различий с контрольными значениями (р>0,05) (рис. 2).
При изучении поверхности образцов после контакта с кровью методом сканирующей электронной микроскопии отмечено, поверхность образцов ПГБ 541 кДа и ПГБВ 2307 кДа оставалась интактной (рис. 3а, 3б) Незначительное количество адгезированных тромбоцитов наблюдали на образцах ПГБ 309 кДа, распластанных форм не отмечено (рис. 3в).
Величина гемолиза, индуцированного водным экстрактом из экспериментального образца, позволяет оценить способность биоматериала вызывать лизис эритроцитов. Принято считать, что допустимая величина гемолиза не должна превышать 2% [6]. Полученные результаты свидетельствуют, что величина гемолиза эритроцитов после контакта с Яере1-СУ составила 0,2%. В тоже время, пленки на основе ПГБ и сополимера
ПГБВ не оказывают негативного воздействия на эритроциты — гемолиз полностью отсутствовал. В целом, как Яере1-СУ, так и изучаемые мембраны из ПГБ и ПГБВ, обладают удовлетворительными гемосовместимыми свойствами.
Определение степени апоптоза и развития некроза МСК, снятых с мембран, напрямую отражает биосовместимость биополимерных конструкций в целом и их токсическое влияние на клетки во время проводимой культивации в частности. К 7 суткам культивирования МСК на образцах ПГБ и сополимера ПГБВ клетки продолжали деление. Процентное соотношение жизнеспособных клеток, в раннем, позднем апоптозе и некрозе, снятых с поверхности полученных мембран выглядело следующим образом (табл. 1): инкубация на образцах из ПГБ привело к уменьшению количества жизнеспособных МСК до 67,3% (ПГБ 541 кДа) и 66,7% (ПГБ 309 кДа).
Инкубация МСК на мембранах на основе сополимера ПГБВ 2037 кДа не приводила к развитию значительного апоптоза клеток, а жизнеспособные МСК составили в среднем 73,1%. Необходимо отметить, что пленки Яере1-СУ обладают небольшим сроком биодеградации, в связи с чем, в процессе культивации образцы мембраны разрушались, и произвести подсчет клеток оказалось затруднительно.
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать предварительное заключение: полиоксиалканоаты являются перспективными биополимерами для дальнейшей разработки биодегради-руемых противоспаечных мембран. Мембраны из по-лигидроксибутирата обладают удовлетворительными физико-механическими свойствами, хорошей био- и гемосовместимостью. Применение сополимера поли-гидроксибутирата с оксивалератом позволяет получать мембраны с улучшенными эластическими свойствами.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бокерия Л.А., И. Беришвилли И.В., Солнышков Л.Э/ и др. Повторные операции у больных ишемической болезнью сердца. Современное состояние проблемы (метаанализ) // Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. — 2009. — Т. 10. №3. — С.5-27.
2. Бокерия Л.А., Зеленикин М.А., Бокерия Г.Д., Шаталов К.В. Причины и результаты повторных операций после ранее выполненной радикальной коррекции врождённых пороков сердца у детей раннего возраста // Грудная и сердечно-сосудистая хирургия. — 2004. — №5. — С. 4-10.
3. Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И. Полиоксиалканоаты — биоразрушаемые полимеры для медицины — Красноярск, 2006. — С.217-239.
4. ГОСТ Р ИСО 10993-4-2009. Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 4. Исследование изделий, взаимодействующих с кровью. — C. 16.
5. Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. — Казань, 2000. — 364 с.
6. Севастьянов В.И. Биосовместимость. — М., 1999. — 369 с.
7. Штильман М.И. Полимеры медико-биологического назначения. — М., 2006. — 399 с.
8. Haensig M., Rastan A. Bioresorbable adhesion barrier for redusing the severity of postoperative cardiac adhesions: focus on Repel-CV // Medical Devices: Evidence and Research. — 2011. — №4. — P.17-25.
9. HolstK.A., Dearani J.A., BurkhartH.M., etal. Risk factors and early outcomes of multiple reoperations in adults with congenital heart disease // Ann. Thorac. Surg. — 2011. — Vol. 92. — P. 122130.
10. Kaneko Y., Hirata Y., Achiwa I., et al. Adhesion barrier reduces postoperative adhesions after cardiac surgery // Asian Cardiovasc. Thorac. Ann. — 2012. — Vol. 20. — P. 257-262.
11. Lodge A., Wells W., Backer C., et al. A novel bioresorbable film reduces postoperative adhesions after infant cardiac surgery // The Annals Thorac Surgery. — 2008. — Vol. 86. Issue 2. — P. 614- 621.
12. Prapas S., Panagiotopoulos J., Abdelsalam A., et al. Predictors of prolonged mechanical ventilation following aorta no-touch offpump coronary artery bypass surgery // Eur. J. Cardiovasc. Surg. — 2007. — Vol.32, №3. — P. 488-492.
13. Reusch R. Biological complexes of poly-p-hydroxybutyrate // FEMS Microbiol. Rev. — 1992. — Vol. 9 (2-4). — P. 119-129.
14. Salminen J., Mattila I., Puntila J., Sairanen H. Prevention of postoperative pericardial adhesions in children with hypoplastic left heart syndrome // Interact CardioVasc. Thorac. Surg. — 2011. — Vol. 12 (2). — P.270-272.
15.Walther T., Rastan A., Dahnert I., et al. A novel adhesion barrier facilitates reoperations in complex congenital cardiac surgery // J. Thorac Cardiovasc Surg. — 2005. — Vol. 129. — P. 359-363.
Информация об авторах: Насонова Марина Владимировна — научный сотрудник, 650002 г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6, e-mail: mv-nas@mail.ru; Глушкова Татьяна Владимировна — научный сотрудник; Доронина Нина Васильевна — ведущий научный сотрудник, д.б.н.; Ежов Владимир Александрович — старший научный сотрудник, к.т.н.; Борисов Вадим Владимирович — ведущий научный сотрудник, к.б.н.; Матвеева Вера Геннадьевна — научный сотрудник; Кудрявцева Юлия Александровна — заведующая лабораторией, e-mail: yukemcard@mail.ru
