CC BY
33lena Coccagna, Alessio Branchini, Paola Antoni-oli, Pier Giorgio Balboni, Dario Di Luca, and Sante Mazzacane, Italy, (2016) PLoS One]
7. Hard Surface Biocontrol in Hospitals Using Mi-crobialBased Cleaning Products Alberta Vandini1 , Robin Temmerman2,3, Alessia Frabetti1 , Elisabetta Caselli4 , Paola Antonioli5 , Pier Giorgio Balboni4 ,
Daniela Platano6 , Alessio Branchini7 , Sante Maz-zacane1 *, Italy, 2014, PLoS One
8. Riduzione dell'incidenza di infezioni correlate all'assistenza mediante un Sistema di sanificazione a base di probiotici: risultati di uno studio di intervento prospettico multicentrico. Elisabetta Caselli & e.t.c., Italy, PLoS ONE, 2018.
РАЗНООБРАЗИЕ УЛЬТРАМИКРОФОРМ БАКТЕРИЙ В ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОДЗЕМНЫХ
ВОДАХ
Лобанова А.А.
Московский Педагогический Государственный Университет, институт биологии и химии, Москва, Россия, студент (магистр) Институт физической химии и электрохимии им А.Н. Фрумкина РАН
DIVERSITY OF ULTRAMICROFORM OF BACTERIA IN POLLUTED WATER HORISONTS
Lobanova A.A.
Moscow State Pedagogical University, Institute of Biology and Chemistry,
Moscow, Russia, student (master) A.N. Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry RAS
АННОТАЦИЯ
Работа посвящена оценке филогенетического разнообразия ультрамикробактерий в подземных водоносных горизонтах с высокой антропогенной нагрузкой вблизи радиохимических заводов и хранилищ радиоактивных отходов с использованием метода анализа генов 16 S рРНК и выделения чистых культур бактерий. Из проб подземных вод, загрязнённых нитрат-ионами и радионуклидами, было выделено 22 штамма бактерий, способных образовывать ультрамикроформы. Большая часть микроорганизмов принадлежала к семействам Pseudomonadaceae (24%) и Micrococcaceae (19%).
ABSTRACT
The work is devoted to phylogenetic diversity of ultramicrobacteria in groundwater aquifers with a high anthropogenic pollution near radiochemical plants and radioactive waste repositories using the 16S rRNA gene analysis method and isolation of pure bacterial cultures. 22 bacteria strains capable of forming ultramicro forms were isolated from the groundwater samples contaminated with nitrate ions and radionuclides. Most of the microorganisms belonged to the families of Pseudomonadaceae (24%) and Micrococcaceae (19%).
Ключевые слова: ультрамикробактерии, подземные водоносные горизонты, биоремедиация, анализ генов 16S рРНК.
Keywords: ultramicrobacteria, underground aquifers, bioremediation, analysis of 16S rRNA genes.
Введение
Попадание высокотоксичных веществ в окружающую среду вследствие развития промышленности и сельского хозяйства приводит к изменению видового разнообразия экосистем. Считается, что наиболее приспособленными к токсическому стрессу являются бактерии ультрамелких форм с низкой интенсивностью метаболизма, которые относят к несистемной группе ультрамикробактерий.
Ультрамикробактерии представляют собой виды домена Bacteria, характеризующиеся очень небольшими размерами клеток и имеющие небольшие размеры генома [1]. Принято считать, что они имеют полифилетическое происхождение. Однако их таксономическое положение, а также морфофи-зиологическое разнообразие и экологическая роль очень слабо изучены.
Большинство сведений об ультрамикробакте-риях получено на основе анализа видового состава почвенных местообитаний. Например, при помощи метода флуоресцентной гибридизации in situ без выделения чистых культур была оценена числен-
ность ульрамикробактерий, их доля и таксономический состав в торфяных почвах [2]. Ультрамелкие формы клеток были обнаружены среди представителей таксонов Actinobacteria, Cytophaga и Proteobacteria. Несмотря на то, что таксономическое положение было определено меньше чем для половины представителей ультрамикробактерий, они характеризовались высоким филогенетическим разнообразием и входили в состав представителей основных групп почвенных микроорганизмов.
Получение данных о видовом разнообразии ультрамикробактерий подземных вод с высокой антропогенной нагрузкой и изучение их метаболического потенциала является важной и актуальной задачей для микробиологии и биотехнологии, а также для разработки методов биоремедиации.
Целью работы являлся поиск ультрамикро-форм бактерий в загрязненных водоносных горизонтах в районе Томска, Красноярска, Димитров-града, Новосибирска и Ангарска и изучение их видового состава.
Для выделения ультрамикроформ пробы воды были посеяны на жидкую обогащенную питательную среду Plate Count (триптон - 5 г/л; дрожжевой экстракт - 2,5 г/л; глюкоза - 1 г/л; NaCl - 9 г/л) через фильтр-насадку на шприц с диаметром пор 0,22 мкм.
По окончании активного роста микробного сообщества был осуществлен пересев культур в чашки Петри на твёрдую агаризированную среду Plate Count Agar [3] (триптон - 5 г/л; дрожжевой экстракт - 2,5 г/л; глюкоза - 1 г/л; агар - 15 г/л; NaCl - 9 г/л). Пересев также производился с использованием фильтра.
Все среды перед посевом были простерилизо-ваны в автоклаве при температуре 110 °С и давлении 0,5 атм.
Для определения возможности существования выделенных культур в анаэробной среде с низким содержанием органики и использования бактериями в качестве окислителей нитрат-ионы, был произведен посев на среду Адкинса (NH4C1 - 1 г/л; K2HPO4 - 1,5 г/л; KH2PO4 - 0,75 г/л; NaCl - 0,8 г/л; MgSO4 x 7H2O - 0,1 г/л; KCl - 0,1 г/л; дрожжевой экстракт - 0,5 г/л; NaNO3 - 1 г/л; глюкоза - 1 г/л; CH3COOH - 0,5 г/л). Анаэробные условия создавались путем продувания флаконов со средой аргоном через газовую фазу.
Тотальную ДНК выделяли из биомассы чистых культур с использованием набора для выделения ДНК «DiatomtmDNAprep».
Выделенную ДНК использовали для полиме-разной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, универсальными для представителей доменов Bacteria [4]. ПЦР проводили на амплификаторе iCycler фирмы "BioRad" (США) с использованием 10мкл смеси, содержащей 1 х Taq-буфер [10Мм Tris-HCl;
Ph 8.3, 50Мм KCl], 2Мм MgCl2, 200Мм дезоксири-бонуклеозидтрифосфатов, по 5 пикомолей 5' и 3' концевых праймеров, 1 ед. активности Taq ДНК-полимеразы («Perkin-Elmer», США) и матричную ДНК. Амплификацию ДНК с бактериальными праймерами проводили в следующем режиме: 1 цикл 3 мин при 94°С и затем 30 циклов (0.5 мин при 94°С, 0.5 мин при 50°С, 0.5 мин при 72°С и 7 мин при 72°С). Длину полученных фрагментов проверяли в 1.0% агарозном геле с бромистым этидием. Секвенирование ПЦР-продуктов фрагментов генов 16S Ррнк проводили на автоматическом секвена-торе 3730 DNAAnalyzer с использованием набора "BigDye® Terminatorv3.1 CycleSequencingKits" («AppliedBiosystems», США) в соответствии с рекомендациями производителя.
Результаты и обсуждение
В результате работы был выделен 21 штамм бактерий, способных образовывать ультрамикро-формы. Большая часть микроорганизмов принадлежала к семействам Pseudomonadaceae (24%) и Micrococcaceae (19%). Было выявлено, что при росте на богатой питательной среде у исследуемых бактерий (Acidovorax facilis, Castellaniella defragrans, Halomonas sp. и др.) размер клеток увеличивался, однако некоторые штаммы, в том числе Arthrobacter sp. и Stenotrophomonas maltophilia в оптимальных условиях продолжали формировать ультрамелкие клетки.
Выросшие колонии (рис. 1) бактерий пересеивали в отдельные чашки Петри в ламинарном боксе при помощи петли, используя метод штриха [5]. Пересевы производили до тех пор, пока не образовались изолированные колонии потенциально чистых культур (~ 5 последовательных пересевов).
Рис 1. Бактериальные колонии, выращенные на среде РСА в чашках Петри
В ходе исследования было идентифицировано 22 чистые культуры бактерий (таблица 1). Все они, при культивировании на богатых питательных средах PC и PCA, неоднократно проходили через поры мембранного фильтра диаметром 0,22 мкм. Можно предположить, что все полученные культуры способны образовывать ультрамикроформы, однако при микроскопировании было выявлено, что
только четыре культуры устойчиво формировали ультрамикроклетки и полностью состояли из них. Одна из этих культур была идентифицирована как Stenotrophomonas maltophШa [6], еще две были отнесены к роду Arthrobacter и имели схожую нуклео-тидную последовательность (99%) с двумя видами данного рода: Arthrobacter oryzae и Arthrobacter Ы-micola [7]. Обе культуры устойчиво образовывали
микрококки схожего строения, однако формировали колонии разного цвета. Четвертая культура Arthrobacter oxydans также относится к роду
Arthrobacter; ранее у данного вида уже было отмечено наличие ультрамикроклеток в колониях, подверженных стрессовым воздействиям [8].
Таблица 1.
Описание выделенных и определенным методом секвенирования генов 16S rRNA штаммов
№ п/п Штамм Близкий вид по 16SrRNA Сходство % Описание клеток
1. 2Б(ф)-З Acidovorax facilis strain CCUG 2113 NR 024935 99 Одиночные подвижные палочки.
Acinetobacter johnsonii strain ATCC 17909 NR 117624 Одиночные и парные кокки, также обра-
2. А44-1 Acinetobacter johnsonii strain DSM 6963 NR 119114 100 зуют цепочки. Встречаются овоидные палочки.
Arthrobacter oryzae 99
strain KV-651
3. C53^ NR_041545 Arthrobacter humicola strain KV-653 NR 041546 99 Микрококки.
Arthrobacter oryzae
strain KV-651
4. С53^ NR_041545 Arthrobacter humicola strain KV-653 NR 041546 99 Микрококки.
Arthrobacter oxydans
5. 2Б(ф)-Л strain DSM 20119 NR 026236 99 Микрококки, иногда сцеплены попарно.
Castellaniella defragrans
6. 2ПР-Д strain 54Pin NR 025280 99 Бежевые колонии. Штрих «бусины».
7. ЕШ-Z Comamonas testosteroni strain KS 0043 NR 029161 99-100 Мелкие палочки, иногда парные, подвижные.
Halomonas titanicae BH1 99
8. Щ1570)-М NR_117300 Halomonas sulfidaeris 99 Растет при 2-5, 45 и 150 г/л соли. Пухлые небольшие овоидные палочки, одиноч-
strain Esulfide1 NR 027185 ные, подвижные.
Janthinobacterium lividum
9. 2Б(ф)-Ф strain DSM 1522 NR 026365 99 Нитевидные палочки, тонкие.
Janthinobacterium sva- 99
lbardensis
strain JA-1
10. 2Б(ф)-Ц NR_132608 Janthinobacterium lividum strain DSM 1522 NR 026365 99 Длинные палочки, подвижные.
Kocuria rosea 99
strain DSM 20447
11. C53-R NR_044871 Kocuria polaris strain CMS 76or NR 028924 99 Кокки.
12. Щ1570)-N Pseudomonas chloritid-ismutans 100 Растет при 2-5, 45 и 150 г/л соли. Палочки.
strain AW-1
NR 115115
13. A44-G Pseudomonas donghuensis strain HYS 16S NR_136501 Pseudomonas alkylphenol-ica strain KL28 NR 145644 99 99 Овоидные клетки.
14. A44-H Pseudomonas donghuensis strain HYS NR 136501 99 Овоидные клетки.
15. Б2/38^ Pseudomonas mandelii strain CIP 105273 NR 024902 99-100 Подвижные палочки.
16. A44-I Pseudomonas mandelii strain CIP 105273 NR 024902 100 Подвижные палочки.
17. 15-Ж Rhodococcus cercidiphylli strain YIM 65003 NR_116275 Rhodococcus fascians strain CF17 NR 037021 99 99 Коккопалочки.
18. 2ПР-Е Rhodococcus jialingiae strain djl-6-2 NR 115708 99-100 Палочко-кокковидные. Встречаются одиночные и парные клетки, а также цепочки. Различные по плотности.
19. 12-X Sphingobium hydrophobi-cum strain C1 NR_152071 Sphingobium xenophagum strain BN6 NR 026304 99 99 Небольшие палочки.
20. 15-Г Sphingobium yanoikuyae strain GIFU 9882 NR 115524 99 Желтые колонии после 3 дней при комнатной Т оС. Тонкие палочки.
21. 2ПР-С Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus strain GTC 1228 NR 041323 99-100 Кокки.
22. 12-V Stenotrophomonas malto-philia strain ATCC 13637 NR 112030 99 Микропалочки.
Выводы
Из загрязненных радионуклидами и нитрат-ионами водоносных горизонтов, находящихся вблизи радиохимических заводов и хранилищ радиоактивных отходов, было выделено 34 чистых культуры, с размером клеток менее 220нм. 22 из них идентифицированы методом секвенирования 16S рРНК. Большая часть исследуемых микроорганизмов принадлежала к семействам Pseudomonadaceae (24%) и Micrococcaceae (19%). Выявлена способность всех выделенных культур даже в условиях нормального питания, образовывать ультрамикроклетки; среди идентифицированных культур Stenotrophomonas maltophШa, Arthrobacter sp. и Arthrobacter oxydans можно отнести к истинным ультрамикробактериям.
Литература
1. Duda V., Suzina N., Polivtseva V., Boronin A. Ultramicrobacteria: Formation of the Concept and Contribution of Ultramicrobacteria to Biology // Microbiology. 2012. № 81(4): p. 379-390.
2. Lysak L.V., Lapygina E.V., Konova I.A. and Zvyagintsev D.G. Quantity and Taxonomic Composition of Ultramicrobacteria in Soils // Microbiology. 2010. Vol. 79 № 3: p. 408-412.
3. Atlas R.M. Handbook of Microbiological Media. London: CRC Press. 2004. p. 1390
4. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylo-genetic study // J Bacteriol. 1991. № 173(2): р. 697703.
5. Нестерова Н.И, Кулагина Г.И. - Методическое пособие к практическим занятиям по микробиологии. 1996. 15 с.
6. Palleroni N.J. and Bradbury J.F. Stenotropho-monas, a new bacterial genus for Xanthomonas malto-philia (Hugh 1980) Swings et al. 1983. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 1993. № 43: p. 606-609.
7. Akiko K., Kurimi M., Satoshi O. and Yoko T. Arthrobacter oryzae sp. nov. and Arthrobacter humi-cola sp. nov. // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2008. № 58: p. 53-56.
8. N.A. Kryazhevskikh et al. Comparison of the adaptive potential of the Arthrobacter oxydans and Aci-netobacter lwoffii isolates from permafrost sedimentary rock and the analogous collection strains // Microbiology January. 2013. Vol. 82 № 1: p. 29-42.
УСТОЙЧИВОСТЬ УЛЬТРАМИКРОБАКТЕРИЙ К ТЯЖЕЛЫМ МЕТАЛЛАМ
Лобанова А.А.
Московский Педагогический Государственный Университет, институт биологии и химии, Москва, Россия, студент (магистр) Институт физической химии и электрохимии им А.Н. Фрумкина РАН
RESISTANCE OF ULTRAMICROBACTERIA TO HEAVY METALS
Lobanova A.A.
Moscow State Pedagogical University, Institute of Biology and Chemistry, Moscow, Russia, student (master) A.N. Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry RAS
АННОТАЦИЯ
Работа посвящена изучению устойчивости ультрамикробактерий к воздействию тяжелых металлов. Получение данных о приспособленности ультрамикробактерий к токсическим факторам и изучение их метаболического потенциала является важной и актуальной задачей для микробиологии и биотехнологии, поскольку позволяет оценить их роль в экосистемах, подвергшихся антропогенному воздействию и определить возможность их использования в процессах биоремедиации. В работе было использовано два штамма бактерий, выделенных нами ранее и устойчиво образующие ультрамикроклетки: Arthrobacter sp. и Stenotrophomonas maltophilia. Методами электронной микроскопии и абсорбционной спектрофотомерии, а также с использованием дыхательного теста было показано, что обе культуры обладали повышенной устойчивостью к урану, хрому и цинку, кадмию и меди.
ABSTRACT
The work is devoted to the study of the resistance of ultramicrobacteria to the effects of heavy metals. Obtaining data on the adaptability of ultramicrobacteria to toxic factors and the study of their metabolic potential is an important and urgent task for microbiology and biotechnology, since it allows evaluating their role in ecosystems subjected to anthropogenic impact and determining the possibility of their use in bioremediation processes. In this work, we used two strains of bacteria that we isolated earlier and stably form ultramicrocells: Arthrobacter sp. and Stenotrophomonas maltophilia. Using electron microscopy and absorption spectrophotometry, as well as using the breath test, resistance to uranium, chromium and zinc, cadmium and copper for both cultures was shown.
Ключевые слова: ультрамикробактерии, уран, хром и цинк, кадмий, медь, резистентность.
Keywords: ultramicrobacteria, uranium, chromium and zinc, cadmium, copper, resistance.
Введение
Попадание высокотоксичных веществ в окружающую среду вследствие развития промышленности и сельского хозяйства приводит к изменению видового разнообразия экосистем. При этом, виды, обладающие механизмами устойчивости к экоток-сикантам, имеют преимущества и способны к интенсивному развитию в зонах интенсивного загрязнения за счет снижения конкуренции с другими видами. К наиболее токсичным веществам в окружающей среде относятся радионуклиды и тяжелые металлы, что обусловлено одновременно химическим и физическим механизмом их воздействия на организм. Наиболее устойчивыми к различным химическим и физическим факторам являются прокариотические микроорганизмы, при этом многие бактерии, обитающие в анаэробных
условиях при литотрофном росте способны проводить детоксификацию соединений за счет трансформации молекул или ионов до мало- или менее токсичных форм в процессе метаболизма. Считается, что наиболее приспособленными к токсическому стрессу являются бактерии ультрамелких форм с низкой интенсивностью метаболизма, которые относят к несистемной группе ультрамикробактерий.
Ультрамикробактерии (УМБ) представляют собой виды домена Bacteria, характеризующиеся очень небольшими размерами клеток и имеющие небольшие размеры генома [1]. Впервые термин «ультрамикробактерии» был применен в 1981 г. Франциско Торелла и Ричардом Морита и относился к выделенным из морской воды бактериям с клетками диаметром <0,3 мкм. Иногда к ультра-
