CC BY
0УДК 635.9; 57.085.2
Размножение дикорастущих и сортовых сенполий в культуре in vitro.
Вопросы сохранения коллекций и использования в интерьерном дизайне
Володина С.О.1'2, Некрасова Е.В.2, Паутова И.А.3, Володин В.В.1* 1 Санкт-Петербургский государственный лесотехнический университет имени С.М. Кирова,
Санкт-Петербург, Россия 2Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет, Санкт-
Петербург, Россия
3Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, Санкт-Петербург, Россия
Аннотация. Разработаны методы микроклонального размножения редких и исчезающих дикорастущих видов сенполий для сохранения в научных коллекциях и химерных сортов для использования в интерьерном дизайне. Для дикорастущего подвида Saintpaulia ionantha subsp. rupicola (B. L. Burtt) I. Darbysh. реализованы методы непрямого и прямого органогенеза на среде Мурасиге-Скуга с добавлением фитогормонов в различном сочетании и концентрации. Для сохранения химерной окраски у химерного сорта Saintpaulia Lyon's Crown Jewel' разработан метод индукции побегообразования из пазушных почек цветоносов. Во всех трех случаях получены здоровые растения-регенеранты, адаптированные к условиям контейнерной культуры. Использованные методы позволяют решить проблему сохранения редких и исчезающих дикорастущих видов сенполий в научных коллекциях. Применение методов массового микроклонального размножения фантазийных и химерных сортов сенполий позволяют шире рекомендовать эти декоративные растения для использования в интерьерном дизайне.
Ключевые слова: биотехнология растений, микроклональное размножение, род Saintpaulia
Reproduction of wild and varietal Senpolias in culture in vitro.
Issues of preservation in collections and use in interior design
Volodina SO.12, Nekrasova E.V.2, Pautova I.A.3, Volodin V.V.1* 1Saint-Petersburg State Forest Technical University named after S.M. Kirov, St. Petersburg, Russia 2Saint-Petersburg State Chemical and Pharmaceutical University, St. Petersburg, Russia 3Botanical Institute named after V.L. Komarov of Russian Academy of Sciences, St. Petersburg,
Russia
Summary. Methods for the microclonal propagation of rare and endangered wild species of senpolias and their chimeric varieties have been developed. Methods of indirect and direct organogenesis of the wild subspecies of Saintpaulia ionantha subsp. rupicola (B. L. Burtt) I. Darbysh., on the Murashige-Skuga medium with the addition of phytohormones in various combinations and concentrations have been implemented. To preserve the chimeric coloration of the chimeric Saintpaulia variety Lyon's Crown Jewel', a method for inducing shoot formation from axillary buds of peduncles has been developed. In all three cases, healthy plants-regenerants adapted to the conditions of container culture were obtained. These methods make it possible to solve the problem of preserving rare and endangered wild species of senpolia in scientific collections. The use of methods of mass microclonal reproduction of fantasy and chimeric varieties of saintpaulias makes it possible to widely recommend these ornamental plants for use in interior design.
Key words: plant biotechnology, microclonal reproduction, Saintpaulia
Введение. В настоящее время сенполии являются одними из самых распространённых в декоративном цветоводстве растений. Впервые растение было обнаружено в 1892 г. в горном регионе Усамбара в Танзании, откуда происходит одно из утвердившихся названий - узамбарская фиалка. Как вид Saintpaulia ionantha H. Wendl. была описана Венландом в 1893 г. В России сенполии появились в начале XX века. Сначала их выращивали в оранжереях ботанических садов, а в конце 1940-х - начале 1950-х гг. сенполии стали одними из излюбленных комнатных растений цветоводов-любителей. Всего в мире насчитывается около 5000 сортов и гибридных форм сенполий [1, 2].
Благодаря современным данным молекулярно-филогенетических исследований, род Saintpaulia перенесен в подрод Streptocarpella рода Streptocarpus семейства Gesneriaceae, где выделяется в секцию Saintpaulia, состоящую по состоянию на март 2020 г. из десяти видов [3]. Ареал сенполий ограничен горными регионами Танзании и Кении. В природе сенполии растут около водопадов, на террасах рек,
в условиях водяной пыли и тумана, избегая действия прямых солнечных лучей. В настоящее время некоторым дикорастущим видам сенполий грозит исчезновение из-за разрушения их естественной среды обитания.
Статус сохранения подвида Saintpaulia ionantha subsp. rupicola (B. L. Burtt) I. Darbysh. классифицирован как находящийся под критической угрозой исчезновения. Подвид является литофитом, а также эндемиком Прибрежной провинции на юго-востоке Кении. В природных популяциях насчитывается не более 100 особей. Сокращение численности популяций этого подвида обусловлено сельскохозяйственным освоением территорий, а именно вырубкой лесов, в результате чего уменьшается количество доступной влаги и нарушается оптимальный для растений уровень освещенности [4]. Кроме того, как правило, в дикой природе семена не образуются из-за массового опадания опыленных цветков и довольно малой численности опылителей [5].
Цель настоящего исследования заключается в разработке методов размножения in vitro редких исчезающих видов и химерных сортов сенполий.
Задачи работы:
1. Подобрать составы питательных сред и исследовать процессы морфо- и органогенеза в каллусной культуре S. rupicola;
2. Оптимизировать процесс прямого органогенеза в культуре S. rupicola в условиях in vitro;
3. Оптимизировать процесс микроклонального размножения химерного сорта Saintpaulia Lyon's Crown Jewel' путем индукции побегообразования из пазушных почек цветоносов;
4. Подобрать состав питательной среды для укоренения растений-регенерантов в условиях in vitro и ex vitro;
Материалы и методы. Для микроклонального размножения использовали растение-донор S. rupicola из коллекции Ботанического сада Петра Великого БИН РАН им. В. Л. Комарова. Для образования первичного каллуса в качестве эксплантов использовали части листа размером 5^5 мм. Экспланты промывали в проточной воде, погружали на 10 минут в 5%-ный раствор хлорамина Б, после чего трижды промывали стерильной дистиллированной водой в стерильной посуде в ламинарном боксе. Для получения каллусных культур использовали модифицированную среду Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением сахарозы (30 г/л), инозитола (100 г/л) и витаминов (мг/л): инозитол - 10; тиамин HCl - 10; никотиновая кислота - 0,5; пиридоксин HCl -0,5. Агар 8 г/л. рН до автоклавирования 5,8. Экспланты помещались в чашки Петри на среду с добавлением фитогормонов НУК (нафтилуксусная кислота) 1 мг/л + БАП (бензиламинопурин) 0,1 мг/л (среда 2) и 2,4Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) 1,5 мг/л + БАП 0,2 мг/л (среда 3). Инкубировали каллус в темноте при температуре +25-26°С. Для микроклонального размножения химерного сорта Saintpaulia Lyon's Crown Jewel' использовали цветоносы после завершения фазы цветения.
Результаты исследований и их обсуждение. Непрямой органогенез (регенерация из каллуса). Образование первичного каллуса наблюдали через три недели после начала культивирования. Каллусогенезу способствовало введение в среду повышенных количеств ауксинов и пониженное содержание цитокининов. Участки первичного каллуса отделяли от экспланта и переносили на питательную среду того же состава. Наращивание каллусной культуры проводили в течение следующих трех недель, после чего каллусы были фрагментированы и перенесены на безгормональную среду (среда 5) и на среду с добавлением БАП 0,5 мг/мл (среда 4) при 16-часовом фотопериоде. На среде с добавлением БАП (среда 4) через 15-20 дней наблюдалось формирование меристематических очагов, развитие побегов и образование розеток (3-7 штук на 1 каллус). На безгормональной среде формирование и развитие побегов было более медленным, в связи с чем для регенерации растений в дальнейшем использовали питательную среду 4. Для доращивания растений микророзетки были отделены от каллусной ткани и перенесены на свежую среду того же состава. Через 20-30 дней культивирования на питательной среде наблюдалось увеличение числа микророзеток в среднем до 6-8 шт. на каждое растение, что можно объяснить наличием в среде цитокининов. Для стимуляции образования корней микророзетки были перенесены на модифицированную среду МС с добавлением ауксинов ИУК (индолилуксусная кислота) в различных концентрациях (0,5; 0,7 и 1,0 мг/л) и НУК в концентрации (0,5 мг/л и 1,0 мг/л). На всех средах с ИУК через 30-35 дней наблюдалось образование корней. Оптимальной для индукции корнеообразования и роста растений оказалась среда с концентрацией ИУК 0,5 мг/л. Использование более высоких концентраций ИУК также приводило к образованию корней, однако угнетало рост растений. Перевод растений-регенерантов в условия контейнерной культуры осуществляли в апреле - наиболее благоприятный для этих целей период. Растения высаживали в посадочные горшочки диаметром 5 см, заполненные специально рекомендованным для сенполий почвенным субстратом и предварительно обработанным сухим жаром
при 85-90 °С в течение 1-2 часов. Для создания микроклимата и оптимальной влажности растения сверху накрывали стеклянными сосудами. Растения поливали раствором препарата «Корневин».
Прямой органогенез. Метод прямого органогенеза или регенерации растений непосредственно из культивируемых эксплантов пригоден для некоторых видов травянистых растений при использовании листьев, луковиц, корневищ и клубней в качестве эксплантов. Листья сенполий разрезали на фрагменты размеров 5*5 мм и после холодной стерилизации и промывки помещали в чашки Петри на модифицированную питательную среду МС с добавлением фитогормонов БАП 1,0 мг/л + НУК 0,5 мг/л (среда 1). Экспланты культивировали в световой комнате при температуре +25°С, 16-часовом фотопериоде и интенсивности света 1000 лк. Через четыре недели прямо на экспланте наблюдали образование побегов и формирование микророзеток, минуя образование каллуса. Микророзетки делили и переносили на свежую питательную среду 4 с добавлением БАП 0,5 мг/л. Для получения необходимого количества растений-регенерантов через четыре недели процедуру повторяли. Укоренение розеток проводили на среде с ИУК 0,5 мг/л. Укоренившиеся розетки переносили в посадочные горшочки диаметром 5 см, используя описанный ранее способ.
Среди сортов узумбарских фиалок особое место занимают химеры, которые могут спонтанно получаться в ходе селекции. В системе целого растения химеры содержат морфологически изменчивые по гомологичным признакам ткани, которые сосуществуют друг с другом, как клоны клеток с различным генотипом и способностью к синтезу пигментов. Проявляется это в необычной окраске цветочных лепестков, у которых по белому фону хаотично (в виде пятен) или упорядоченно (в виде секторов) распределяется другая окраска. Известно, что у таких растений химерные признаки передаются цитоплазматическими структурами наследственности - хлоропластами. При этом хлоропласты листа и частей околоцветника могут нести разные гены. Листья не имеют химерных клеток. Наиболее полно передают химерный материнский окрас зародышевые клетки цветоносов и частей околоцветника, которые располагаются в верхней части растений. Если после завершения цветения, цветонос укоренить в земле, то пазушная может развиться в микророзетку. Поскольку микророзетка появляется не из одной клетки, как при размножении листовым черенком, а из целой почки с точкой роста, то в случае химер открывается возможность сохранения сортовых признаков и повторения у потомства характерного химерного рисунка [6].
Таким образом, химерные сорта сенполий невозможно размножать листовыми черенками, и к ним не применимы методы прямого и непрямого органогенеза in vitro. Традиционные методы размножения химер с помощью пасынков и цветоносов весьма трудоемки. Для эффективного размножения химер применяется биотехнологический метод индукции побегообразования из почек, расположенных в пазухах прицветников на цветоносах in vitro.
Нами отработана методика микроклонального размножения химерного сорта Saintpaulia Lyon's Crown Jewel'. В этих целях во время цветения растения-донора были выбраны цветоносы с наиболее крупными прицветниками, которые были отделены от растения, при этом цветки и бутоны были удалены. Для микроклонального размножения оставляли фрагмент размером 3 мм выше прицветников. Нижнюю часть укорачивали так, чтобы общий размер экспланта не превышал 2,5 см.
Эксплант цветоносов стерилизовали таким же способом, как и листья, и после промывания стерильной водой помещали на питательную среду 1 с добавлением БАП 1 мг/л и НУК 0,5 мг/л. На этой среде через 30 дней в некоторых случаях наблюдалось формирование цветков в условиях in vitro (явление флорального геммогенеза). В другом варианте эксперимента экспланты цветоносов после завершения цветения были перенесены на питательную среду 4 с БАП для формирования микророзеток. Укоренение микророзеток, как и в других случаях, проводилось на среде 6 с добавлением ИУК. Укоренившиеся розетки переносили в рассадные горшочки, используя описанный выше способ.
Заключение. Для микроклонального размножения сенполий нами апробированы три метода микроклонального размножения. Для дикорастущего подвида S. rupicola реализованы методы непрямого и прямого органогенеза. При индукции морфогенеза в каллусной культуре (непрямой органогенез) использована среда MS с добавлением фитогормонов НУК 1,0 мг/л и БАП 0,1 мг/л. Образование морфогенного каллуса и регенерация побегов происходила на свету на среде MS с добавлением БАП 0,5 мг/л. Прямой органогенез в культуре in vitro протекает с использованием питательных сред, содержащих пониженное содержание НУК 0,5 мг/л и БАП 1,0 мг/л, что позволяет подавить образование каллуса. Укоренение растений-регенерантов, полученных методом непрямого и прямого органогенеза в условиях in vitro, протекает на среде с добавлением ИУК 0,5 мг/л.
Для сохранения химерной окраски и массового размножения химерных сортов сенполий разработан метод индукции побегообразования из пазушных почек цветоносов. В некоторых случаях впервые наблюдалось явление флорального геммогенеза в условиях in vitro.
Во всех трех случаях получены здоровые растения-регенеранты, адаптированные к условиям контейнерной культуры. Для укрепления корневой системы растений ex vitro оказался эффективным препарат «Корневин». Указанные методы позволяют решить проблему сохранения изучаемого подвида и других редких и исчезающих дикорастущих видов сенполий в научных коллекциях. Использование методов массового микроклонального размножения фантазийных и химерных сортов сенполий позволяют шире рекомендовать эти декоративные растения для использования в интерьерном дизайне.
Работа выполнена в рамках государственного задания БИН им. В. Л. Комарова РАН по плановой теме «История создания, состояние, потенциал развития живых коллекций растений Ботанического сада Петра Великого БИН РАН» (124020100075-2).
Список литературы:
1. Залесский Д. М. Сенполии: их дикорастущие виды и вопросы культуры. Л.: изд-во Ленинградского университета, 1983. 144 с.
2. Ширяева Н. Н. Узамбарские фиалки. М.: ЗАО «Фитон+», 2001. 128 с.
3. The Great Merger - Current Taxonomic Status. [Электронный ресурс] -https://gesneriads.info/articles/saintpaulia/saintpaulia/taxonomy/greater-merger-current-taxonomic-status/ (дата обращения 01.05.2024)
4. Eastwood A., Bytebier B., Tye H., Tye A., Robertson A., Maunder M. The conservation status of Saintpaulia // Curtis's Botanical Magazine. 1998. Vol. 21. P. 462-471.
5. Kolehmainen J. K., Mutikainen P. Reproductive ecology of three endangered African violets (Saintpaulia H. Wendl.) species in the East Usambara Mountains, Tanzania //African Journal of Ecology. 2006. Vol. 44. Iss. 2. P. 219-227.
6. Бобина Т. Размножение сенполий цветоносами [Электронный ресурс] -https://altaifialka.ru/o_sayte/stati.html782.
