CC BY
34
при разработке промышленного производства биомассы.
В целом при использовании полупроточного режима выращивания общая продуктивность процесса повышается в среднем на 15 -20% за счет отсутствия лаг-фазы и времени, необходимого на подготовку периодического культивирования.
Список литературы
1. Определение олигофуростанозидов в культуре клеток Dioscorea deltoidea Wall спектрофотометрическим методом / Васильева И.С., Воробьев А.С., Горская Н.В., Липский А.Х., Гуриелидзе К.Г., Пасешниченко В.А. // Прикладная биохимия и микробиология. - 1987. - № 5. - С. 692.
2. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective / Bourgaud F., Gravot A., Milesi S., Gontier E. // Plant Science. - 2001. - 161. - Р. 839-851.
3. Collin H.A. Secondary product formation in plant tissue cultures // Plant Growth Regulation. - 2001. - № 34. - Р. 119-134.
4. DiCosmo F., Misawa M. Plant cell and tissue culture: alternative for metabolite production // Biotechnology Advances. - 1995. - № 3. - Р. 425-453.
5. Kieran P.M., MacLoughlin P.F., Malone D.M. Plant cell suspension cultures: some engineering considerations // Journal of Biotechnology. - 1997. - 59. - Р. 39-52
6. Ramachandra Rao S., Ravishankar G.A. Plant cell cultures: chemical factories of secondary metabolites // Biotechnology Advances. - 2002. - V. 20. - Р. 101-153.
7. Verpoorte R., Contin A., Memelink J. Biotechnology for the production of plant secondary metabolites // Phytochemistry Reviews. - 2002. - № 1. - Р. 13-25.
РАЗМНОЖЕНИЕ БОРЕЦА СЕВЕРНОГО В КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЕ IN VITRO НА ОСНОВЕ ФЕНОМЕНА ЭМБРИОИДОГЕНИИ
Н.Н. КРУГЛОВА, доктор биологических наук; А.Е. КРУГЛОВА Учреждение РАН Институт биологии Уфимского НЦ РАН, Уфа, Россия
Введение
Длительный процесс адаптивной эволюции привел к возникновению у цветковых растений разнообразных репродуктивных структур, обеспечивающих семенное (гетерофазная репродукция) и вегетативное (гомофазная репродукция) размножение [1]. Особый интерес вызывают случаи формирования эмбриоида (синонимы: соматический зародыш, зародышеподобная структура, адвентивный зародыш) - зачатка растения, образующегося из соматических (неполовых) клеток. Системный эмбриологический подход позволил установить новую категорию вегетативного (бесполого) размножения цветковых растений - эмбриоидогению; показано, что растения, образующиеся из эмбриоидов, представляют собой клоны -особи, генетически идентичные между собой и исходным растением [2].
В течение ряда лет явление эмбриоидогении в каллусной культуре in vitro изучается нами на примере бореца северного Aconitum lycoctonum L. (синоним: аконит высокий Aconitum septentrionale Koelle), многолетнего растения из семейства Лютиковые (рис. 1).
Помимо теоретического значения, связанного с выявлением разнообразия способов размножения и систем репродукции цветковых растений, полученные данные имеют и прикладное значение для разработки способа стабильного получения растений-клонов этого ценного лекарственного растения.
Рис. 1. Борец северный Aconitum lycoctonum L. в природных условиях, х0.08
В корневищах и в меньшей степени в надземной части бореца северного содержится ряд фармакологически активных алкалоидов [6].
Особый интерес вызывает алкалоид лаппаконитин. Именно борец северный -единственный источник производимого из лаппаконитина высокоэффективного антиаритмического препарата
аллапинин, разрешенного к
производству Минздравом РФ (с 1992 г.), запатентованного в США, Японии и Германии [5].
В настоящее время борец северный достаточно широко распространен на Южном Урале [7]. Однако в корневищах растений, произрастающих на большей части ареала, отмечается низкое содержание лаппаконитина, что делает нерентабельной их заготовку как сырья. В то же время места сбора корневищ с высоким/супервысоким содержанием лаппаконитина приурочены к малонаселенным горным или таежным районам. Кроме того, массовый сбор корневищ большими группами, как правило, неквалифицированных сборщиков наносит существенный урон всему растительному покрову региона сбора и ведет к тому, что это ценное растение может попасть в категорию исчезающих видов. Таким образом, поиск альтернативных способов расширения сырьевой базы для производства препарата аллапинин весьма актуален.
Цель работы состояла в разработке способа стабильного получения растений бореца северного - клонов суперпродуцентов лаппаконитина, на основе использования феномена эмбриоидогении в каллусной культуре in vitro.
Объекты и методы исследования Объектом исследования послужили растения бореца северного - суперпродуценты лаппаконитина, отобранные на основании морфологических показателей во время экспедиционных выездов по Южному Уралу сотрудниками лаборатории экологии растительных ресурсов Института биологии Уфимского НЦ РАН (зав. лабораторией -д.б.н. Н.И. Федоров) и предварительно проанализированные методом ВЭЖХ на содержание лаппаконитина.
Использовали метод культуры органов, тканей и клеток растений in vitro [3], светооптические методы исследования [4].
Результаты и обсуждение На первом этапе экспериментов с помощью гистологического контроля подобрали корневищные почки, характеризующиеся развитыми апексами. Высечки апексов таких корневищных почек, содержащие меристематическую ткань, использовали в качестве эксплантов для получения каллусов. Высечки инокулировали на среду I, составленную по Мурасиге и Скуга [9], с введением кинетина в эмпирически подобранной концентрации (know how), адекватной для индукции каллусообразования in vitro, и размещали в темноте при температуре +20°С.
Через 7-9 суток культивирования формировались каллусы, которые переносили на среду II, также составленную по Мурасиге и Скуга, с введением фитогормона ИУК в эмпирически подобранной концентрации (know how), индукцирующей формирование в каллусах эмбриоидов. Каллусы культивировали в темноте при температуре +26°С.
Через каждые сутки культивирования проводили гистологический анализ части каллусов для выявления механизмов формирования и развития эмбриоидов. Так, установлено, что эмбриоиды развиваются из комплекса инициальных клеток, изолированных от остальных клеток каллуса. На 28-30 суток культивирования эмбриоид характеризуется наличием органов, типичных для зародышей двудольных растений: апекс побега, апекс корня, заложившаяся пара первых листьев. К 30-35 суткам эмбриоид представлен структурой с хорошо развитыми зародышевым корнем, парой первых листьев и заложившейся парой вторых листьев.
Такие эмбриоиды во множестве отмечены на поверхности каллусов. Тот факт, что из одного каллуса (полученного в свою очередь из одной высечки корневищной почки растения-суперпродуцента) можно получить множество эмбриоидов, хотелось бы подчеркнуть особо.
Эмбриоиды переносили на среду III, составленную по Блейдзу [8], и размещали при освещенности 18 клк в условиях имитации летнего светового дня (18 час свет/6 час темнота). На 35-38 сутки эмбриоиды давали начало проросткам (рис. 2, а).
После формирования у проростков корневой системы их переносили в вегетационные сосуды со специально подобранной почвенной смесью, размещали также при освещенности 18 клк. Вокруг проростков поддерживали высокую влажность. В таких условиях проростки активно вегетировали и формировали растения (рис. 2, б).
В дальнейшем планируется перевести регенеранты в условия открытого грунта на полевые участки научного стационара и через 3-4 года провести оценку их корневищ по содержанию лаппаконитина.
а б
Рис. 2. Формирование и развитие регенерантов бореца северного: а - проросток в условиях in vitro, х 0.8; б - регенерант в фазу вегетации, х 0.1
Выводы
Анализ полученных данных дает основание выделять у бореца северного способ размножения в каллусной культуре in vitro через этап формирования эмбриоидов. Тем самым еще одно экспериментальное подтверждение получает концепция эмбриоидогении как особой категории вегетативного размножения растений в условиях in vitro [2].
Разработан способ стабильного получения регенерантов ценного лекарственного растения бореца северного в культуре in vitro. Преимущество данного способа состоит в возможности массового получения клонов как вегетативного потомства растения -суперпродуцента лаппаконитина.
Полученные клоны могут быть использованы в фармакологии для расширения сырьевой базы при производстве препарата аллапинин. Однако особенно важно то, что вносится вклад в сохранение природных популяций этого растения.
Работа выполнена в рамках программы «Ведущие научные школы РФ» (грант НШ 2096.2008.4, лидер школы - член-кор. РАН Т.Б. Батыгина, Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН, г. Санкт-Петербург).
Список литературы
1. Батыгина Т.Б. Воспроизведение, размножение и возобновление растений // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 3: Системы репродукции. - СПб.: Мир и семья, 2000а. - С. 35-39.
2. Батыгина Т.Б. Эмбриоидогения - новый тип вегетативного размножения // Эмбриология цветковых растений. Терминология и концепции. Т. 3: Системы репродукции. - СПб.: Мир и семья, 2000б. - С. 334-349.
3. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии растений. - К.: Наукова думка, 1980. - 468 с.
4. Круглова Н.Н., Егорова О.В. Световой микроскоп как инструмент в биотехнологии растений. - М.: Лабора, 2009. - 119 с.
5. Латыпова Г.М., Плеханова Т.М., Мухаметшина B.C. Фармакогностическое изучение аконита северного как источника «Аллапинина» // III Укр. конф. по мед. ботанике. Киев, 25-27 сентября 1992 г. - К., 1992. - С. 78-79.
6. Содержание алкалоида лаппаконитина в подземной и надземной частях Aconitum septentrionale Koelle в растительных сообществах в Башкирии / Федоров Н.И., Мартьянов Н.А., Никитина B.C., Ишбирдина Л.М. // Растительные ресурсы. - 1996. - Вып. 3. - С. 96101.
7. Цицилин А.К, Шретер А.И. Прогноз природных ресурсов Aconitum septentrionale Koelle в Башкирской АССР // Растительные ресурсы. - 2000. - Вып. 4. - С. 513-539.
8. Blaydes D.F. Interaction of kinetin and various inhibitors in the growth of soybean // Physiol. Plant. - 1966. - V. 19, N 3. - P. 748-753.
9. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures // Physiol. Plant. - 1962. - V. 15, N 3. - P. 473-497.
PECULIARITIES OF SPHAEROBLAST FORMATION AND DEVELOPMENT IN
OLEA EUROPAEA L.
KONSTANTINOS ROUBO S1; ANTONIOS IFOULIS1;
IRINA MITROFANOVA2, DrSci; CHRISTOS NELLAS1, NIKOLAOS KOUTINAS1;
ATHANASSIOS RUBOS1, PhD 1Plant Production Department, ATEI Thessaloniki, Greece 2Nikitsky Botanical Gardens - National Scientific Center, Yalta, Ukraine
Introduction
Sphaeroblasts are adventitious buds consisting of a woody, more or less globular structure connected to the vascular system of the plant through a pointed end and capable of differentiating vegetative meristems giving growth to juvenile shoots (Fig. 1 C, D, E). Their life is between three to four years and if during this life period do not differentiate meristems and/or give new growth they loose their viability. The first to describe sphaeroblasts was Theophrastos (371 - 287 BC), in his surviving work «Enquiry into Plants». He named them yoyypo (singular), yoyypot (plural) after their shape, looking like the beet root (yoyyu^n). The first and perhaps the only study on sphaeroblast formation in olive trees have been made by Baldini and Mosse [1].
Sphaeroblasts are formed on various tree species under the effect of various factors and
