CC BY
54
К. П. Федорова, И. С. Шарафутдинов, Н. В. Тарасов,
Е. О.Михайлова, О. Н. Ильинская, А. Р. Каюмов
РАЗЛИЧНОЕ ВЛИЯНИЕ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ НА ДНК-СВЯЗЫВАЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ TNRA И GLNR ИЗ BACILLUS SUBTILIS
Ключевые слова: Bacillus subtilis, факторы транскрипции TnrA, GlnR, глутаминсинтетаза.
Факторы транскрипции TnrA и GlnR, представители семейства MerR регуляторов транскрипции, у бактерий Bacillus subtilis контролирует гены белков азотного метаболизма в условиях недостатка и избытка азота в среде. Одним из механизмов регуляции их ДНК-связывающей активности является взаимодействие с глутаминсинтетазой. Методом поверхностного плазмонного резонанса установлено, что глутаминсинтетаза оказывает различное действие на активность этих факторов транскрипции. В присутствии ингибированной глутаминсинетазы ДНК-связывающая активность белка TnrA снижается, тогда как аффинность GlnR к ДНК возрастает. Этот факт коррелирует с активностью факторов TnrA и GlnR в различных условиях доступности азота и характеризует глутаминсинтетазу как триггерный фермент, контролирующий азотный обмен клетки.
Key words: Bacillus subtilis, transcription factors TnrA and GlnR, glutamine synthetase.
The transcription factors TnrA and GlnR, members of the MerR family of transcription regulators, control the genes of the nitrogen metabolism in Bacillus subtilis under conditions of nitrogen deficiency and excess, respectively. Their DNA-binding activity is regulated by the interaction with the glutamine synthetase, the key enzyme of ammonium assimilation. By surface plasmon resonance it has been established that glutamine synthetase has a different effect on the activity of these transcription factors. In the presence of inhibited glutamine synthetase, the DNA-binding activity of TnrA is decreased, while GlnR affinity to DNA increases. This fact correlates with the activity of TnrA and GlnR in various conditions of nitrogen availability and characterizes the glutamine synthetase as a trigger enzyme that controls nitrogen metabolism.
Введение
Активность генов бактерий контролируется факторами транскрипции - ДНК связывающими белками. В клетках B.subШs гены азотного метаболизма регулируют факторы транскрипции ТпгА и в1пЯ, которые относятся к семейству белков МегЯ [1, 2]. При этом белок ТпгА активен в условиях недостатка восстановленного азота, а белок в1пЯ - в условиях его избытка. Белки семейства МегЯ находятся в клетках в димерной форме и имеют два функциональных домена [3, 4]. При этом N концевой домен взаимодействует с ДНК, а С-концевой участвует в трансдукции сигнала. Ранее было показано, что оба белка взаимодействуют с глутаминсинтетазой, в результате чего меняется их ДНК-связывающая способность [5,6,7]. Целью данной работы был сравнительный анализ ДНК-связывающей способности белков ТпгА и в1пЯ в присутствии глутаминсинтетазы.
Материалы и методы
Для гиперэкспрессии целевых белков использовали штамм КтН БЬ21. Вектор рЕТ15Ь («Novagen») реплицируется в клетках E.coli, несет сильный промотор фага Т7 под контролем ^-оператора и обеспечивает гиперэкспрессию рекомбинантных белков с образованием гексагистидино-вого участка на Оконце белка в клетках E.coli БЬ21. Плазмиды рЕТ15Ь-ТпгА, рЕТ15Ь-ТпгА35, рЕТ15Ъ-в1пЯ и рЕТ15Ъ-01пЯ40 получены ранее [7-9].
Культивирование штаммов E.coli проводили на среде ЬБ. При выращивании рекомбинантных штаммов E.coli в среду вносили ампициллин до конечной концентрации в среде 100 мкг/мл.
Очистку нативного и рекомбинантных белков ТпгА и в1пЯ, с 6-гистидиновой последовательностью на Оконце белка, проводили на №-ЫТА сефарозе, как описано в [7, 8].
Изучение ДНК-связывающей активности белка ТпгА проводили методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР) на приборе БІАсоге X (Біасоге АБ, Швеция) как в работе [8]. В качестве специфической последовательности ДНК использовали олигонуклеотиды с модификацией в виде биотина на 5’ конце, содержащие ТпгА-узнаваемый участок промотора гена nrgA (5’биотин-ААААС САТвТ САввА ААТСТ ТАСАТ вАААА 3’) и комплементарные олигонуклеотиды без модификации (5’ ТТТТС АТвТА АвАТТ ТССТв АСАТв в ТТТТ 3’). Контролем служили олигонуклеотидные фрагменты гена устойчивости к ампициллину на плазмиде рБТ15Ъ, в которых отсутствовала ТпгА-узнаваемая последовательность (5’биотин-САвТв АввСА ССТАТ СТСАв СвАТС ТвТСТ 3’, 5’ АвАСА вАТСв СТвАв АТАвв ТвССТ САСТв 3’). Гибридизацию олигонуклеотидов проводили как описано в [12]. Далее иммобилизовали готовые ДНК-дуплексы на сенсорной поверхности 8А чипа (БІАсоге АБ). Иммобилизацию ДНК-дуплексов и анализ ДНК-связывающей способности белков ТпгА и в1пЯ проводили при 25°С в буфере ИБ8 (10 тМ ИБРБ8, 300 тМ №С1, ББТА 0.2 тМ, 3 тМ М§С12,
0.005% Nonidet Р-40, рИ 7.4). Канал 1 (БС1) чипа
использовали в качестве контрольного и наносили на него неспецифические ДНК-дуплексы, канал 2 (БС2) использовали в качестве опытного и иммобилизовали на его поверхности специфические ДНК-дуплексы. Наносили ДНК-дуплексы со скоростью 10 мкл/мин на каждый канал 8А чипа до количества ДНК на поверхности равному 1800 резонансных единиц (РЕ). Специфическое взаимодействие анализируемых белков с молекулами ДНК определяли как разницу единиц резонанса (ДРЕ) между опытным и контрольным каналами (РС2-РС1). Анализируемые пробы объемом 75 мкл, содержащие 200 нМ исследуемых белков, наносили со скоростью 30 мкл/мин. Поверхность чипа восстанавливали нанесением 10 мкл 2М №С1 при скорости 15 мкл/мин.
Результаты исследований и обсуждение Сравнительный анализ белков ТпгД и 0!пК
Мы провели сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белков ТпгА и в1пЯ (Рис. 1).
ТпгА НТТЕОН8УКБККУ13101У8ЕЬТ0Ь8УКС1НУУЕЕ 01пН МБ—0Ы1НЕ8МРЬЕР101УМдЬТЕЬ8АЕд1НУУЕЕ ::.**** :** **.********
ТпгА ККЬ1УРСН83Н0ТККУ8ЕАОУЕНЬМО1АНКНЕО0У 01пН Н0Ь1ЕРАНЗЕ0ННКЬЕЗЕНОУОКЬЬЕ1КНЬ1ЕС0У . **:* **. . * :** : *:**
ТпгА QTAEILK0MRKKEQ—MLKN0PQVRKKMLEGQLNA 01пН NMAGIKQILAKAEAEPEQKQNEKTKKPMKH0LS00 : * * : : * * *:: :.:* * .. :
ТпгА HFR—YKNR------------------------
G1nR ELRQLLKNELMQAGRFQRGNTFRQG0MSRFFH .:* **.
Рис. 1 - Выравнивание аминокислотных
последовательностей белков ТпгА и 01пЯ. «*» -идентичные аминокислоты; «:» - гомологичные аминокислоты с одинаковым зарядом, «.» -гомологичные гидрофобные аминокислоты.
Как видно из рисунка, оба белка имеют высокую гомологию Оконца белка. При этом при помощи ранее нами разработанного алгоритма [10-11] было установлено, что гомология ДНК связывающего домена (Ю1У8ЕЬТОЬ8УКр1КУУЕЕ) составляет 90%. Однако С-концевой домен сигнальной трансдукции не имеет гомологии, хотя для обоих белков показано его взаимодействие с глутаминсинтетазой [5,6,7]. Возможно, это коррелирует с активностью факторов ТпгА и в1пЯ в различных условиях доступности азота. С другой стороны, это позволяет ожидать различное влияние глутаминсинтетазы на их ДНК-связывающую активность.
Влияние глутаминсинтетазы на ДНК-связывающую активность белков ТпгА и 01пЯ
В ряде работ была показана необходимость С-конца белков ТпгА и в1пЯ для их взаимодействия с глутаминсинтетазой и значение этого взаимодействия на активность данных факторов транскрипции [5,6,7,13]. Мы исследовали ДНК-связывающую активность этих белков методом поверхностного плазмонного резонанса. Специфическое взаимодействие белков ТпгА и в1пЯ с промотором ТпгА-зависимого гена определяли как разницу между взаимодействием ТпгА со специфичной и неспецифичной
последовательностями ДНК. В качестве специфической последовательности ДНК использовали олигонуклеотиды, содержащие ТпгА-узнаваемый участок промотора гена nrgA (TGTNAN7TNACA), в неспецифической
последовательности использовали участок гена устойчивости к ампициллину, в котором отсутствовал такой участок.
На поверхность сенсорного чипа наносили равномолярные концентрации белков (200 нМ) в пересчете на молекулярную массу каждого белка. Эксперименты показали, что в соответствии с ранее опубликованными данными [1] присутствие глутаминсинтетазы, ингибированной 20 мМ глутамином и 10 мМ АМФ, значительно подавляло взаимодействие фактора ТпгА с ДНК (рис. 2). Напротив, внесение фермента к белку G1nR повышало количество фактора транскрипции, связывающегося с ДНК (рис. 3).
Время, с
Рис. 2 - Анализ взаимодействия полноценного и мутантного белка ТпгА с промотором ТпгА-зависимого гена н^Л методом поверхностного плазмонного резонанса. Эффективность связывания мутантных белков с ДНК показана в резонансных единицах.
Время, с
Рис. 3 - Анализ взаимодействия полноценного и мутантного белка 01пЯ с промотором гена н^Л методом поверхностного плазмонного резонанса. Эффективность связывания мутантных белков с ДНК показана в резонансных единицах
Чтобы подтвердить, что именно связывание факторов транскрипции с глутаминсинтетазой оказывает влияние на их ДНК-связывающую активность, данные эксперименты были проведены с мутантными белками ТпгА35 и 01пЯ40. Ранее было показано, что удаление 35 аминокислотных остатков с С-конца белка ТпгА, а также удаление 40 аминокислотных остатков с С-конца белка в1пЯ делает невозможным их взаимодействие с глутаминсинтетазой [6,7]. Как видно из рисунков 2 и 3, характер взаимодействия с ДНК мутантных белков ТпгА35 и в1пЯ40 не зависел от присутствия глутаминсинтетазы. Следовательно, именно связывание с этим ферментом модулирует ДНК-связывающую активность данных факторов транскрипции.
Подсчет кинетических параметров взаимодействия белков с ДНК (Таблица 1) показал, что в присутствии ингибированной глутаминсинетазы ДНК-связывающая активность белка ТпгА снижается в 4 раза, поскольку равновесная константа диссоциации Кс возрастает. В то же время аффинность в1пЯ к ДНК возрастает в 2.5 раза [1,2]. Этот факт коррелирует с активностью факторов ТпгА и в1пЯ в различных условиях доступности азота. При этом ДНК-связывающая активность мутантных белков с делециями С-концевого домена не изменялась после внесения глутаминсинтетазы. Полученные данные характеризуют глутаминсинтетазу как триггерный фермент, контролирующий азотный обмен клетки.
Таблица 1 - Кинетические константы ка и ка и вычисленные равновесные константы диссоциации К для взаимодействия белков ТпгА и 01пЯ с промотором гена н^Л
Белки Константы скорости M
ka x 104, M-1 x с-1 kd x10-3, с-1 kd / ka x 10-8
TnrAwt б.7 і 0.32 2.2 і 0.17 3.2 і 0.5б
TnrAwt + GSинг. 3.8 і 0.52 4.4 і 0.31 11.б і 0.б2
TnrA35 13.0 і 0.81 4.4 і 0.01 3.4 і 0.55
TnrA35+ GS инг. 11.7 і 0.53 4.1 і 0.35 3.5 і 0.42
GlnRwt 13.1 і 0.42 1.9 і 0.17 1.4 і 0.5б
GlnR wt + GSинг. 13.0 і 0.21 0.3 і 0.2 22 і 0.13
GlnR40 98 і 0.14 2.5 і 0.09 0.3 і 0.25
GlnR40+ GSинг. 103 і 0.23 2.б і 0.18 0.3 і 0.22
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы, гранта РФФИ №12-04-01226-а и Гранта по программе «Михаил Ломоносов» А/12/75478.
Литература
1. L.V. Wray, A.E. Ferson, K. Rohrer, S.H. Fisher, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 8841-8845 (1996).
2. J.M. Zalieckas, L.V. Wray Jr, S.H. Fisher, J Bacteriol, 188, 2578-2585 (2006).
3. J.L. Hobman, Mol Microbiol, 63, 1275-1278 (2007).
4. К.П. Федорова, И.С. Шарафутдинов, Е.Ю. Турбина, М.И. Богачев, О.Н. Ильинская, А.Р. Каюмов, Молекулярная биология, 47(2), 331-337 (2013).
5. L.V. Wray Jr, S.H. Fisher, J. Bacteriol, 189, 20-27 (2007).
6. S.H. Fisher, L.V. Wray Jr, Proc Natl Acad Sci USA, 105, 1014-1019 (2008).
7. A. Kayumov, A. Heinrich, K. Fedorova, O. Ilinskaya, K. Forchhammer, FEBS J., 278, 1779-1788 (2011).
8. K. Fedorova, A. Kayumov, K. Woyda, O. Ilinskaja, K. Forchhammer, FEBS Lett, 587, 1293-1298 (2013).
9. A. Heinrich, K. Woyda, K. Brauburger, G. Meiss, C. Detsch, J. Stulke, K. Forchhammer, J. Biol. Chem., 281, 34909-34917 (2006).
10. М.И. Богачев, Е.О. Михайлова, А.Р. Каюмов, Вестник Казанского технологического университета, 15, 225227 (2012).
11. А. Р. Каюмов М. И. Богачев Е. О. Михайлова, Вестник Казанского технологического университета, 8, 175-180 (2011).
12. D.J. Hart, R.E. Speight, M.A. Cooper, J.D. Sutherland, J.M. Blackburn, Nucleic Acids Res., 27, 1063-1069 (1999).
13. А.Б. Маргулис, А.Р. Курбангалиева, Н.В. Белоногова, Л.З. Латыпова, Э.Н. Хакимуллина, Е.А. Тризна, М.И. Богачев, А.Р. Каюмов, Вестник Казанского технологического университета, 15, 220-224 (2012).
14. L. V. Wray, J. M. Zalieckas, S. H. Fisher, Cell, 107, 427435 (2001).
© К. П. Федорова - м.н.с. каф. микробиологии К(П)ФУ, kpfedorova@gmail.com; И. С. Шарафутдинов - лаб. каф. генетики К(П)ФУ, irwad@yandex.ru; Н. В. Тарасов - лаб. той же кафедры; Е. О. Михайлова - канд. биол. наук, доц. каф. химической кибернетики КНИТУ, katya_o_m@rambler.ru; О. Н. Ильинская - д-р биол. наук, проф., зав. каф. микробиологии К(П)ФУ, olga.ilinskaya@ksu.ru; А. Р. Каюмов - канд. биол. наук, доц. каф. генетики К(П)ФУ, kairatr@yandex.ru.
