CC BY
72
Медицинская Иммунология 2007, Т. 9, № 4-5, стр. 493-498 © 2007, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
РАЗЛИЧИЯ КАСКАДА ЦИТОКИНОВ у БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ
Астмой в зависимости от стадии течения заболевания
Рябова Л.В., Зурочка А.В.
НИИ иммунологии Челябинской медицинской академии, г. Челябинск
Резюме. Изучали состояния системы регуляции лейкоцитов у больных бронхиальной астмой в стадии обострения при помощи исследования спонтанной и индуцированной продукции цитокинов (IL-4, IL-1 b, IL-10 и IFNy) в супернатантах цельной крови и определяли коэффициенты соотношения их продукции в сравнении с контролем. 1 группа — больные бронхиальной астмой смешанной формы, легкой степени тяжести в стадии обострения. Контрольная группа — 12 человек условно здоровые лица. Цитокиновый каскад оценивался по спонтанной и индуцированной продукции стандартными митогенами фитогемагглютинином (PHA) и липополисахаридом (LPS) E. coli IL-4, IL-1b, IL-10 и IFNy. Полученные данные показывают, что при бронхиальной астме как модели хронического воспаления синтез и активация цитокинов зависит от фазы заболевания. В стадии обострения наблюдается дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов с преобладанием противовоспалительного IL-10, направленного на процесс затухания легочного воспаления.
Ключевые слова: бронхиальная астма, цитокины.
Ryabova L.V., ZurochkaA.V.
SPECIFIC STAGE-DEPENDENT FEATURES OF CYTOKINE CASCADE IN THE PATIENTS WITH BRONCHIAL Asthma
Abstract. A study of leukocyte regulation system in patients with exacerbated bronchial asthma (BA) was performed by means of measuring spontaneous and induced production of certain cytokines (IL-4, IL-1 b, IL-10 and IFNy) in whole blood, and drawing some specific coefficients reflecting production of the cytokines, as compared to control values. Group 1 consisted of mixed-type BA patients, with mild clinical manifestations at exacerbation stage. A control group included twelve healthy persons. The cytokine network was evaluated according to spontaneous production of cytokines (IL-4, IL-1b, IL-10 and IFNy), or their induction with standard mitogens (PHA and E. coli LPS). The results obtained have shown that in BA as a clinical model of chronic inflammation, synthesis and activation of the cytokines depend on the phase of disease. At stage of exacerbation, an imbalance occurs between pro- and anti-inflammatory cytokines, with predominance of anti-inflammatory IL-10, which is targeted to suppression of bronchial inflammation. (Med. Immunol., 2007, vol. 9, N 4-5, pp 493-498)
Введение
Хроническое воспаление — это патологический процесс, возникающий на фоне недо-
Адрес для переписки:
454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64.
Тел.: 8 (351) 260-50-05, моб. 8 (351) 270-56-35. E-mail: [email protected]
статочной интенсивности иммунного ответа, то есть хроническое воспаление всегда приводит к развитию иммунодефицитного состояния и нарушению процессов репарации [5, 6]. Следовательно, иммунные механизмы играют ключевую роль в патогенезе хронического воспаления [7]. При возникновении воспаления цитокиновая сеть регуляции иммунной систе-
493
Рябова Л.В., Зурочка А.В.
Медицинская Иммунология
мы является наиболее уязвимой точкой приложения в патологическом процессе. При любом хроническом течении воспаления основную роль играют макрофаги и лимфоциты, поэтому последнее обозначают как мононуклеарно-инфильтративное [3, 4, 7]. Цитокины, выделяемые при макрофагально-лимфоцитарной инфильтрации, взаимно активируют эти клетки, создавая порочный круг, который поддерживает возникшую воспалительную реакцию. Важнейшую роль в этом играют у-интерферон (IFNy) и интерлейкин-4 (IL-4). При этом IFNy регулирует клеточно-опосредованный иммунный ответ, а IL-4 и IL-10 — гуморальный [8]. При этом надо отметить, что цитокиновый каскад находится в организме в динамическом состоянии и в зависимости от фазы течения болезни меняет свои показатели, которые через клетки иммунной системы воздействуют на дыхательную систему и на весь организм в целом.
Бронхиальная астма (БА) — одно из наиболее распространенных хронических неспецифических заболеваний легких и может служить «моделью» формирования дефекта регуляторной сети на уровне взаимодействия IFNy и IL-4 [1, 2]. Патогенез аллергических заболеваний, в частности БА, очень сложен. В формировании иммунного ответа воспаления бронхов участвуют иммунные реакции 1, 3 и 4 типов, но чаще других ведущую роль играет механизм 1 типа реакции. Определение выработки цитокинов мононуклеарами периферической крови (МНПК) при стимуляции in vitro является более адекватным по сравнению с определением плазменного уровня цитокинов [8]. При активации in vitro такими агентами, как фитогемагглютинин (PHA) и бактериальный липополисахарид (LPS), МНПК секретируют в культурную среду целый спектр провоспалительных цитокинов. Выраженная спонтанная продукция цитокинов МНПК свидетельствует о том, что клетки уже активированы in vivo либо in vitro в результате методических манипуляций. Индуцированная продукция цитокинов позволяет оценить потенциальные возможности активации клеток.
Материалы и методы
Нами было проведено исследование спонтанной и индуцированной стандартными митогенами
(PHA и LPS E. coli) продукции IFNy, IL-4, IL-1p и IL-10 в супернатантах цельной крови. Также были рассчитаны коэффициенты соотношения их выработки у условно здоровых лиц и у больных БА легкой степени тяжести в стадии обострения и в стадии ремиссии. Группа условно здоровых лиц была сформирована врачом-терапевтом во время проведения углубленного профилактического осмотра, включающего консультацию врача аллерголога-иммунолога. В эту группу вошли 16 условно здоровых лиц, не имеющих на момент исследования острой и хронической патологии в анамнезе. В группу больных БА легкой степени тяжести смешанной формы (инфекционно-зависимой и аллергической) вошли 44 человека в возрасте от 18 до 40 лет, из которых 30 человек были в стадии обострения, а 14 человек в стадии ремиссии. Диагноз был подтвержден врачом аллергологом-иммунологом на основании клинических, лабораторных и инструментальных исследований.
Для исследования спонтанной и индуцированной митогенами продукции IFNy, IL-4, IL-1 p и IL-10 (контрольные группы) кровь брали из локтевой вены в две стерильные силиконовые пробирки с гепарином (150 ед/мл), разводили (1:5) стерильной средой RPMI 1640 («Sigma») c добавлением 2 мл L-глутамина («Sigma») и 80 мкг/мл гентамицина.
Для спонтанной продукции цитокинов в лунки 24-луночного планшета вносились по 1 мл среды RPMI 1640 с добавлением 2 мл L-глутамина («Sigma»), 80 мкг/мл гентамицина и 1 мл разведенной в 5 раз крови.
Для PHA-индуцированной продукции цитокинов в лунки планшета вносились по 1 мл рабочего раствора PHA («DIFCO») и 1 мл разведенной в 5 раз крови (конечная концентрация PHA 50 мкг/мл).
Для LPS-индуцированной продукции цитокинов в лунки планшета вносились по 1 мл рабочего раствора LPS E. coli («Sigma») и 1 мл разведенной в 5 раз крови (конечная концентрация LPS E. coli 30 мкг/мл).
Планшеты с исследуемыми образцами культивировали при 37°С и 5% СО2 в СО2-инкубаторе. По прошествии времени инкубации супернатанты отбирали для исследования на наличие цитокинов.
Для определения спонтанной и митоген-ин-дуцированной продукции цитокинов в супернатантах были использованы тест-системы для иммуноферментного анализа «ИФА—IFNy»,
494
2007, Т. 9, № 4-5
Каскад цитокинов у больных бронхиальной астмой
ТАБЛИЦА 1. СПОНТАННАЯ И ИНДУЦИРОВАННАЯ ПРОДУКЦИЯ IFNy И СООТНОШЕНИЯ УРОВНЕЙ СПОНТАННОЙ И ИНДУЦИРОВАННОЙ ПРОДУКЦИИ
in vitro в цельной крови у Больных бронхиальной астмой в стадии ремиссии и обострения
Показатели Продукция IFNy в группах обследованных
БА, фаза обострения n = 30 БА, фаза ремиссии n = 14 условно здоровые n = 16
Спонтанная продукция IFNy, пг/мл 550,7±173,85 566,8±144,1 434,38±142
PHA индуцированная продукция IFNy, пг/мл 6633,8±849 6619,55±728,2 7349,81±1003
ИС (отношение PHA индуцированной продукции IFNy к спонтанной продукции IFNy) 12±4,9* 41,91±15,63 45,65±10,3
LPS индуцированная продукция IFNy, пг/мл 899,94±734* 1726±831,94 5132,82±1102,04
ИС (соотношение LPS индуцированной продукции IFNy к спонтанной продукции IFNy) 1,63±4,24 1,93±0,58 3,42±0,47
Примечание: * - достоверность отличий показателей группы БА в стадии обострения от показателей условно здоровых (p< 0,05) (соотношение подсчитано с учетом индивидуальных показателей).
таблица 2. спонтанная И ИНдУЦИРОвАННАЯ пРОдУкЦИЯ IL-1P и соотношения уровней спонтанной и индуцированной продукции in vitro в цельной крови у Больных бронхиальной астмой в стадии ремиссии И ОБОСТРЕНИЯ
Показатели Продукция IL-1 р в группах обследованных
БА, фаза обострения n = 30 БА, фаза ремиссии n = 14 условно здоровые n = 16
Спонтанная продукция IL-1 р, пг/мл 259,78±56,6 480,58±81,22* 377,17±77,44
PHA индуцированная продукция IL-1 р, пг/мл 387,1±57,7 496,91±103,81 442,54±101
ИС (отношение PHA индуцированной продукции IL-1 р к спонтанной продукции IL-1 Р) 1,49±1,01 3,45±1,68 1,35±0,1
LPS индуцированная продукция IL-1 р, пг/мл 413±76,11 569,16±98,29 616,5±82,86
ИС (отношение LPS индуцированной продукции IL-1 р к спонтанной продукции IL-1Р) 1,59±1,34 1,29±0,09 1,59±0,08
Примечание: *- достоверность отличий показателей больных БА в стадии обострения в сравнении с показателями больных БА в стадии ремиссии (р < 0,05) (соотношение подсчитано с учетом индивидуальных показателей).
495
Рябова Л.В., Зурочка А.В.
Медицинская Иммунология
ТАБЛИЦА 3. СПОНТАННАЯ И ИНДУЦИРОВАННАЯ ПРОДУКЦИЯ IL-4 И СООТНОШЕНИЯ УРОВНЕЙ СПОНТАННОЙ И ИНДУЦИРОВАННОЙ ПРОДУКЦИИ
in vitro в цельной крови у Больных бронхиальной астмой в стадии ремиссии и обострения
Показатели Продукция IL-4 в группах обследованных
БА, фаза обострения n = 30 БА, фаза ремиссии n = 14 условно здоровые n = 16
Спонтанная продукция IL-4, пг/мл 9,56±1,4 **■* 59,16±3,96 20,12±5,65
PHA индуцированная продукция IL-4, пг/мл 9,67±1,25*** 85,52±11,03 35,58±7,5
ИС (отношение PHA индуцированной продукции IL-4 к спонтанной продукции IL-4) 1,01±0,81 1,4±0,13 5,98±2,31
LPS индуцированная продукция IL-4, пг/мл 10,44±4,91* 68,44±6,76 24,83±6,83
ИС (отношение LPS индуцированной продукции IL-4 к спонтанной продукции IL-4) 1,09±3,5 1,23±0,19 4,6±1,61
Примечания: * - достоверность отличий показателей больных БА в стадии обострения от показателей больных БА в стадии ремиссии; ** - достоверность отличий показателей группы БА в стадии обострения от показателей условно здоровых (p < 0,05) (соотношение подсчитано с учетом индивидуальных показателей).
таблица 4. спонтанная И ИНдУЦИРОвАННАЯ пРОдУкЦИЯ IL-10 и соотношения уровней спонтанной и индуцированной продукции in vitro в цельной крови у Больных бронхиальной астмой в стадии ремиссии И ОБОСТРЕНИЯ
Показатели Продукция IL-10 в группах обследованных
БА, фаза обострения n = 30 БА, фаза ремиссии n = 14 условно здоровые n = 16
Спонтанная продукция IL-10, пг/мл 183,26±22,97*** 40,18±6,89 43,97±9,86
PHA индуцированная продукция IL-10, пг/мл 568,9±0,29*** 45,83±15,27 136,1±26,09
ИС (отношение PHA индуцированной продукции IL-10 к спонтанной продукции IL-10) 3,1±0,01** 1,6±0,57 25,17±12
LPS индуцированная продукция IL-10, пг/мл 328,55±96,8**,* 112,58±20,93 83,35±11,42
ИС (отношение LPS индуцированной продукции IL-10 к спонтанной продукции IL-10) 1,79±4,2 5,98±1,91 2,65±0,53
Примечания: * - достоверность отличий показателей больных БА в стадии обострения от показателей больных БА в стадии ремиссии; ** - достоверность отличий показателей группы БА в стадии обострения от показателей условно здоровых (р < 0,05) (соотношение подсчитано с учетом индивидуальных показателей).
496
2007, Т. 9, № 4-5
Каскад цитокинов у больных бронхиальной астмой
«ИФА-^-4», «ИФА-IL-lb», «ИФА-IL-IO» (ООО «Цитокин», Санкт-Петербург), согласно прилагаемой инструкции снимали полученные оптические плотности на иммуноферментном анализаторе «Antos 2020» (Италия). Расчеты количества цитокинов проводили путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы. Количество выражали в пг/мл. После оценки концентрации спонтанных и индуцированных цитокинов рассчитывали ряд индексов. Первый индекс стимуляции митогенами (ИС) высчитывали как соотношение показателей индуцированного LPS или PHA тестов к спонтанным тестам.
При статистической обработке иммунологических данных использовались параметрические методы Стьюдента с определением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m), переменной Стьюдента t с оценкой достоверности по критерию значимости P. Различия между группами признавались достоверными при Р > 95% ( p < 0,05).
Результаты и обсуждение
Как видно из таблицы 1, продукция клетками IFNy при БА как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии практически однотипны. В группе условно здоровых лиц выработка клетками IFNy ниже, чем в группе больных БА, но результаты не достигли статистической достоверности.
Исследования продукции IFNy выявляют статистически достоверное снижение PHA-стимулированной выработки IFNy у лиц с БА в стадии обострения и тенденцию к снижению в стадии ремиссии в сравнении с условно здоровыми лицами.
При изучении LPS-стимулированной выработки IFNy определено достоверное снижение в группе БА в стадии обострения в сравнении и с группой вне обострения, и с группой условно здоровых лиц.
Как видно из таблицы 2, спонтанная продукция провоспалительного цитокина IL-1 b снижена в сравнении с условно здоровыми, но разница не достигает статистически достоверных результатов, в то время как спонтанная продукция IL-1b у больных БА в стадии ремиссии достоверно выше, чем в стадии обострения. При определении индекса соотношения PHA-индуцированной и LPS-индуцированной продукции IL-1 b индекс значительно ниже у лиц БА в стадии обострения,
чем в стадии ремиссии. Также эти результаты ниже в сравнении с условно здоровыми лицами, но достоверных результатов не получено.
Как видно из таблицы 3, при анализе спонтанной продукции IL-4 мы отмечаем достоверное снижение у лиц БА в стадии обострения в сравнении с БА в стадии ремиссии в пять раз, а в сравнении с условно здоровыми — в два раза. Также отмечается достоверное снижение PHA-индуцированной продукции IL-4 при БА в стадии обострения в сравнении с БА в стадии ремиссии и с условно здоровыми. При анализе LPS-индуцированной продукции IL-4 достоверное снижение при БА в стадии обострения отмечается только по сравнению со стадией ремиссии, в то время как различия с условно здоровыми не наблюдается. При определении индекса соотношения LPS-индуцированной и PHA-индуцированной продукции IL-4 достоверных различий не отмечается.
Как видно из таблицы 4, спонтанная продукция IL-10 достоверно выше в стадии обострения БА в сравнении с БА в стадии ремиссии и с группой условно здоровых.
Достоверное повышение уровня IL-10 у больных БА в стадии обострения получено и при PHA-индуцированной, и при LPS-индуцированной продукции IL-10 в сравнении с двумя другими группами.
При подсчете индекса соотношения PHA-индуцированной продукции IL-10 к спонтанной выявлено статистически достоверное снижение индекса при БА в обострении в сравнении с условно здоровой группой.
Полученные данные показывают, что при бронхиальной астме синтез и активация цитокинов зависит от фазы заболевания. В стадии обострения наблюдается дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов с преобладанием противовоспалительного IL-10, действие которого направлено на процесс затухания легочного воспаления.
Список литературы
1. Детская аллергология / Под ред. А.А. Баранова, И.И. Балаболкина. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 687 с.
2. Дранник Г.Н. Клиническая иммунология и аллергология. — М.: МИА, 2003. — 603 с.
3. Пальцев М.А., Иванов А.А., Северин С.Е. Межклеточные взаимодействия. — М.: Медицина,
2003. — 287 с.
497
Рябова Л.В., Зурочка А.В.
Медицинская Иммунология
4. Паттерсон Р., Грэммер Л.К., Гринбергер П. Аллергические болезни. Диагностика и лечение.: Пер. с англ. — М.: ГЭОТАР Медицина, 2000. — 734 с.
5. Федосеев Г.Б. Аллергология. — СПб.: Норд-медиздат, 2001. — Т. 1, 2. — 815 с.
6. Чучалин А.Г. Бронхиальная астма. — М.: Агар, 1997. - Т. 1, 2. - 805 с.
7. Ярилин А.А. Основы иммунологии. — М.: Медицина, 1999. - 607 с.
8. Chung F., Fabbri L.M. Asthma // Eur. Respir. Monogr. — 2003. — Vol. 8, N 1. — P. 458.
поступила в редакцию 03.08.2006 отправлена на доработку 14.11.2006 принята к печати 24.04.2007
498
