CC BY
142
УДК 615.322:582.287.237
РАЗДЕЛЕНИЕ ВОДНЫХ ИЗВЛЕЧЕНИЙ ЧАГИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТИЛАЦЕТАТА. IV. СОСТАВ ВЕЩЕСТВ ФЕНОЛЬНОЙ И ТЕРПЕНОВОЙ ПРИРОДЫ, ОТДЕЛЯЕМЫХ ИЗ ВОДНОГО ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЧАГИ ЭТИЛАЦЕТАТОМ
© М.А. Сысоева, В.Р. Хабибрахманова , В.С. Гамаюрова, Г.И. Кыямова
Казанский государственный технологический университет, ул. К. Маркса, 68, Казань, Республика Татарстан, 420015 (Россия) E-mail: ramven@rambler.ru
Проведено разделение этилацетатного экстракта, полученного из водного извлечения чаги. Применение бумажной и тонкослойной хроматографии, спектрофотомерии позволило определить в нем фенолкарбоновые кислоты, простые фенолы, флавоноиды, иридоиды и азулены.
Ключевые слова: чага, водная вытяжка, полифенолоксикарбоновый комплекс (ПФК), экстракция этилацетатом, электронная спектроскопия, хроматография.
Введение
Считается, что основным действующим веществом, обеспечивающим терапевтическую эффективность применения водных извлечений чаги, является полифенолоксикарбоновый комплекс (ПФК). Его содержание в водных извлечениях составляет в среднем 10-13%. Однако кроме этого комплекса водные извлечения чаги содержат вещества, содержание которых в незначительных количествах объясняет высокую биологическую и терапевтическую активность водных извлечений чаги. К таким веществам можно отнести вещества терпеновой и фенольной природы.
В свободном состоянии (после осаждения ПФК) в водном извлечении чаги определено содержание фенольных соединений в количестве 0,62 [1] и 0,1% [2]. С помощью ТСХ в свободном состоянии были идентифицированы вещества, принадлежащие к различным классам соединений: к фенольным - резорцин и пирокатехин, к ароматическим кислотам - кофейная кислота, к флаваноидам - апигенин и кверцетин [2]. Г.Л. Рыжовой в гидролизате ПФК были идентифицированы фенолы - и-крезол, пирокатехин, а-нафтол, гидрохинон, резорцин и флавоноиды - апигенин, нарингенин, морин, кверцетин [1]. В работах Шивриной и Ловягиной установлено, что в состав чаги входят тритерпены - четыре тритерпеновых спирта, два из которых инотодиол и ланостерол, и две тритерпеновые кислоты (обликвиновая и инонотовая) в количестве 0,04-
0,13% от сухого веса гриба [3]. Большинство этих соединений плохо растворяются в воде и переходят в состав водного извлечения чаги при длительном настаивании сырья при температуре 70 °С.
Цель работы - определение качественного состава фенольных и терпеновых соединений, экстрагируемых этилацетатом из водных извлечений чаги.
Экспериментальная часть
Для экстракции использовали сырье чаги, приобретенное в аптечной сети. Поставщик - ЗАО «Фирма Здоровье», серия 020605, 2005 г., Московская область, Красногорский район. Вытяжки получали согласно методике [4]. Экстракцию водной вытяжки чаги этилацетатом - согласно методике [5]. Последовательная
* Автор, с которым следует вести переписку.
обработка этилацетатного экстракта осуществлена по [6]. Содержание экстрактивных веществ определяли весовым методом [7]. Содержание щавелевой кислоты - титрометрическим методом [8]. Электронные спектры снимали на спектрофотометре ИМСО ИУ/У1Б 2800.
Качественный состав фенолкарбоновых кислот выясняли методом бумажной и тонкослойной хроматографии в системах растворителей: хлороформ : уксусная кислота : вода (50 : 25 : 25), пропанол-2 : аммиак : вода (8 : 1 : 1) и бензол - метанол - уксусная кислота (90 : 16 : 8) соответственно. В качестве проявителя использовали диазореактив, пары аммиака и 5% спиртовой раствор фосфорномолибденовой кислоты [9, 10].
Качественный состав фенольных веществ определяли методом бумажной хроматографии в системах растворителей: бутанол-1 - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 5) и бутанол-1 - бензол - уксусная кислота - вода (2 : 10 : 2 : 1). В качестве проявителей использовали пары аммиака (большинство фенольных соединений).
Качественный состав терпеновых веществ осуществляли методом бумажной и тонкослойной хроматографии в системах растворителей: бензол (сложные эфиры терпеновых спиртов, тритерпены и их производные, а также производные фенилпропана и фенола); бутанол-1, насыщенный аммиаком (азулены); этанол -этилацетат (1 : 1) (иридоиды).
В качестве проявителей использовали реактив Шталя и Бэкон-Эдельмана [10, 11].
Обсуждение результатов
Проведена исчерпывающая экстракция водного извлечения чаги этилацетатом. После отделения ПФК этилацетатный экстракт был подвергнут последовательной обработке по схеме, представленной на рисунке
1, для разделения веществ фенольной и терпеновой природы [6]. Были получены:
- с помощью диэтилового эфира экстракт, содержащий ароматические кислоты, - диэтиловый экстракт кислот (51,3%);
- с помощью диэтилового эфира экстракт, содержащий фенолы простого строения, - диэтиловый экстракт фенолов (28,9%);
- этилацетатный экстракт, содержащий фенолы более сложного строения, такие как моногликозиды и иногда дигликозиды флавонов, флаванонов и флаванолов, а также эфиры ароматических кислот, - этилацетатный экстракт фенолов (4,6%);
- бутанольный экстракт, содержащий фенолы, которые чаще всего представлены полигликозидными формами фенольных соединений, - бутанольный экстракт фенолов (5,3%);
- остаток (после проведенного разделения) этилацетатного экстракта, который может содержать альдегиды, кетоны и терпеновые вещества (7,2%).
В скобках указано содержание сухих остатков экстрактов и остатка по отношению к сухим веществам этилацетатного экстракта, полученного из водного извлечения чаги. Примененная схема разделения позволяет извлечь до 97,3% содержащихся в этилацетатном экстракте веществ от сухого остатка этилацетатного экстракта. Половина проэкстрагированных веществ представлена ароматическими кислотами и сопутствующими им соединениями.
Согласно литературным данным органические кислоты, например щавелевая кислота, остаются в водном остатке после обработки раствора натриевых солей кислот (рис. 1) [6]. Поскольку в работе А.Н. Шивриной [6] было показано, что в свободном состоянии в водном извлечении чаги содержится щавелевой кислоты 3,98-4,40% от сухого остатка, то часть ее может переходить в этилацетатный экстракт. В нейтрализованном экстракте после его обработки растворами МаИСО3 определено содержание щавелевой кислоты, которое составляет 0,41% от сухих веществ этилацетатного экстракта. Остальная ее часть может оставаться в эмульсионном и водном слоях, получающихся при обработке водного извлечения чаги этилацетатом.
ДЭ экстракт кислот был проанализирован с помощью электронной спектроскопии. На спектре обнаружены следующие максимумы поглощения: 245, 255, 292, 315, 408 (плечо) нм и 249, 253, 291,315, 408 (плечо) нм соответственно. Наличие этих максимумов поглощения, согласно литературным данным [12, 13], может свидетельствовать о содержании в объектах исследования оксибензойных кислот (235-270, 290-305, 300350 нм) и окискоричных кислот (230-240, 290-320 нм).
Разделение фенолкарбоновых кислот ДЭ экстракта осуществлено с помощью бумажной и тонкослойной хроматографии в трех системах растворителей. Как представлено на рисунке 2, определение фенолкарбоновых кислот, проведенное по времени удерживания, соответствует спектральной характеристике экстракта.
Анализ трех экстрактов - ДЭ, этилацетатного и бутанольного осуществлен с использованием спекрофотометрии.
Рис. 1. Схема разделения веществ фенольной и терпеновой природы
Яг
1 о.д?
0.51
I о л
1 0,12
0.014
ДЭ хстрша
кислот
Хлороформ -уксусная кислота - вода (50 : 25 : 25), диазореактив
Пропанол-2 - аммиак - вода (8 : 1 : 1), пары аммиака
Бензол - метанол - уксусная кислота (90 : 16 : 8), фосфорно-молибденовый реактив
Рис. 2. Хроматограммы ДЭ экстракта, содержащего фенолкарбоновые кислоты
Анализ электронных спектров экстрактов, содержащих фенольные соединения
Экстракты, содержащие фенольные соединения X тах, нм X тах.нм [13, 14] Отнесение
Диэтиловый 245-280 235, 280, 275-290, Метоксилированные производные фенолов.
290-330 Флаваноны
Этилацетатный 260, 283, 315, 340 250-270, 310-350 Флавоны
Бутанольный 237, 264, 234, 280, 311 Гликозиды флавоноидов, например
280 (плечо) гесперидин 3-О-глюкозид
Фенольные вещества ДЭ, этилацетатного и бутанольного экстрактов разделяли с помощью бумажной хроматографии.
Проведено отнесение полученных пятен на хроматограммах согласно литературным данным [9]. В ди-этиловом экстракте при использовании системы растворителей бутанол-1 - бензол - уксусная кислота - вода (2 : 10 : 2 : 1), применяемой для разделения простых фенолов, показано содержание пирокатехина (Яг,=0.94. КГлит=0.93) и резорцина (КГнайд.=0,84, КГлит=0.82). Использование системы растворителей бута-нол-1 - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 5). применяемой для разделения фенольных веществ с различной структурной организацией, позволило определить в этом экстракте мирицетин или робинетин (КГнайд = 0.64. ЯГлит= 0.64-0.65). гиперин или нортангеретин или кверцетин (ЯГнайд =0.74,. КГлит= 0.70; 0.76). диоксифлавонол или рамнетин (КГнайд =0.87.. КГлит= 0.84; 0.87) и кемпферол. апигенин. морин. а также нарингенин (КГнайд =
0.94.. КГлит= 0.90 и 0.92). В бутанольном экстракте при использовании последней системы растворителей показано наличие одного соединения с КГнайд =0.96. отнесенного нами по спектральной характеристике и специфической окраске к гликозидированной форме флавоноида.
Проведенный анализ методом хроматографии согласно временам удерживания содержания в анализируемых экстрактах определенных веществ фенольной природы соответствует отнесениям, произведенным на основе электронных спектров экстрактов.
В экстракты, обозначенные нами как ДЭ экстракт фенолов. этилацетатный экстракт фенолов и бутаноль-ный экстракт фенолов. могут частично перейти терпеновые вещества. Эти экстракты разделяли с помощью тонкослойной хроматографии с применением системы растворителей этанол-этилацетат (1 : 1). Для обнаружения циклопентаноидных монотерпенов - иридоидов хроматограмму обрабатывали реактивом Бэкон-Эдельмана. Этот реактив в зависимости от строения иридоидов окрашивает пятна на хроматограмме в различные цвета - от лимонно-желтого до коричневого [11].
На хроматограммах всех трех экстрактов было обнаружено по одному пятну с Яг = 0.77 с характерной желтой окраской, это пятно можно идентифицировать, согласно литературным данным [11]. как агнузид (Яг литер= 0.73).
Пятно с Яг = 0.77 проэльюировано этанолом, и снят электронный спектр полученного этанольного раствора (рис. 3).
На электронном спектре присутствуют следующие максимумы поглощения (Хтах): 202. 221. 273 нм. что позволяет подтвердить наличие иридоидных соединений. Большинство иридоидов имеют максимум при 204-210 нм. обу- агну3ид
словленный енольной группой при С3-С4 незамещенных иридоидов. Например, гентиозид имеет Хтах: 209. 219. 243. 251. 269 нм [15]. Согласно данным. полученным с помощью хроматографии можно предположить, что нами выделен агнузид.
остаток этилацетатного экстракта разделяли с помощью тонкослойной хроматографии. В качестве системы растворителей для проявления хроматограмм использован бензол. применяемый для разделения сложных эфиров терпеновых спиртов. тритерпенов и их производных, а также производных фенилпропана и фенола. Хроматограмму обработали реактивом Шталя. обнаружено пять пятен со специфичной для терпено-вых веществ окраской - желтой (Яг = 0.30; 0.58; 0.80). розовой (Яг = 0.65) и голубой (Яг = 0.61). По окраске пятен можно отнести соединения, пятна которых имеют Яг = 0.30; 0.58; 0.80 и 0.65. к иридоидам.
остаток этилацетатного экстракта проанализирован на присутствие в нем азуленов. При хроматографии использован бутанол. насыщенный аммиаком, проявление проводили реактивом Шталя. На хроматограмме обнаружены пять пятен со специфичной окраской различных оттенков - голубой (Яг = 0.10; 0.07; 0.04;) и сиреневой (Яг = 0.01; 0.78). По окраске пятен можно отнести соединения, разделенные с помощью тонкослойной хроматографии, к азуленам.
О—СО—С6Н5ОН
.О
НО~СН2 О—Ъ-01с
н2
О
с
л
о
1=
г
а
та
о
<г
ЗГ
Ї
с
О
1
О Н--------------т-------------т-------------т--------------1-
Рис. 3. Электронный спектр 1ЯП мп 4ЯП А нм 5ЯП
этанольного раствора
Проведенный анализ этилацетатного экстракта, полученного исчерпывающей экстракцией водного извлечения чаги, позволил выявить фенолкарбоновые кислоты, фенолы и терпеновые вещества, находящиеся в водном извлечении чаги в свободном или слабосвязанном состоянии. Многие из них обладают выраженной биологической активностью. Например, фенолоспирты и их гликозиды способствуют повышению работоспособности человека и сопротивляемости его организма к неблагоприятным воздействиям [16]. Гидроксикоричные кислоты (и-кумаровая, феруловая, синаповая) оказывают противовоспалительное и желчегонное действие, усиливают функцию почек, стимулируют антитоксическую функцию печени [16]. Флавоноиды применяются для профилактики и лечения наиболее распространенных болезней, таких как заболевания сердечнососудистой системы, рак, нарушение мозгового кровообращения, нейродегенеративные процессы и других [16]. Иридоидные соединения широко используются для лечения дерматомикозов, астмы, заболеваний желудочно-кишечного тракта, вегетативных расстройств. Многие из них обладают гипотензивным, жаропонижающим, болеутоляющим, противовоспалительным и желчегонным действием [11]. Широко известно, что азуле-ны обладают гипотензивным, спазмолитическим и противовоспалительным действием. Их применяют для лечения ожогов, лучевых язв, трахомы, язвенных циститов и различных заболеваний аллергического характера [17-20].
Выводы
1. Установлено, что в свободном или слабосвязанном состоянии в водном извлечении чаги преобладают оксибензойные и присутствуют оксикоричные фенолкарбоновые кислоты.
2. Определено, что в свободном или слабосвязанном состоянии в водном извлечении чаги находятся ме-токсилированные производные фенолов, флаваноны, флавоны.
3. Показано, что в свободном или слабосвязанном состоянии в водном извлечении чаги находятся такие биологически активные вещества, как иридоиды и азулены.
Список литературы
1. Рыжова Г. Л., Кравцова С.С., Матасова С.А., Грибель Н.В., Пашинский В.Г., Дычко К.А. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги // Химико-фармацевтический журнал. 1997. №10. С. 44-47.
2. Калашникова Е.А. Изучение химического состава и стандартизация сырья чаги и лекарственного препарата «Бефунгин»: Автореф. дис. ... канд. фарм. наук. Пятигорск, 2003. 23 с.
3. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В. Характеристика древоразрушающих грибов по содержанию в них стероидных соединений // Кормовые белки и физиологически активные вещества для животноводства. М.; Л., 1965. С. 59-64.
4. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова В.С., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами // Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2003. №2. С. 172-179.
5. Юмаева Л.Р., Хабибрахманова В.Р., Сысоева М.А., Гамаюрова В.С. Извлечение липидов из водной вытяжки чаги // Пищевые технологии: Мат. общерос. конф. молодых ученых с международным участием. Казань, 2006. С. 118-119.
6. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. К характеристике комплекса сложных органических соединений чаги // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л., 1959. С. 72-84.
7. Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии. М., 1989. 509 с.
8. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Смирнова-Иконникова М.И., Мурри И.К. Методы биохимического исследования растений. М., 1972. 400 с.
9. Хайс И.К., Мацек К. Хроматография на бумаге. М., 1962. 852 с.
10. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. М., 1965. 508 с.
11. Краснов Е.А., Березовская Т.П., Алексеюк Н.В. и др. Выделение и анализ природных биологически активных веществ. Томск, 1987. 184 с.
12. Блажей А., Шутый Л. Фенольные соединения растительного происхождения. М., 1977. 240 с.
13. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М., 1974. 213 с.
14. Клышев Л.К., Бандюкова В.А. Флавоноиды растений (распространение, физико-химические свойства, методы исследования). Алма-Ата, 1978. 220 с.
15. Бакуридзе А.Д., Даргаева Т.Д., Николаева Г.Г., Патудин А.В., Брутко Л.И. Иридоиды растений рода Оепйапа из семейства Оепйапаееае // Химия природных соединений. 1987. №1. С. 3-11.
16. Кочетова М.В., Семенистая Е.Н., Ларионов О.Г., Ревина А.А. Определение биологически активных фенолов и
полифенолов в различных объектах исследования методами хроматографии // Успехи химии. 2007. №76. С. 88-
100.
17. Максименко Г.Н. О противовоспалительном действии азулена мятного масла // Фармакология и токсикология. 1964. Т. 27. №5. С. 51-52.
18. Корти В., Ульдрих И. Местное лечение специфических язвенных циститов гвайазуленом // Урология. 1963. №2. С. 51-52.
19. Гордон М. Азулены // Успехи химии. 1953. №8. С. 948-1001.
20. Болдина И.Г., Назаренко М.В. Фармакологическое исследование азулена полыни Сиверса // Растительные ресурсы. 1983. Т. 19. Вып. 1. С. 54-60.
Поступило в редакцию 21 августа 2007 г.
