CC BY
147
Химия растительного сырья. 2012. №1. С. 149-152.
УДК 615.322:542.61:547.412.123 СОСТАВ ВЕЩЕСТВ БУТАНОЛЬНОГО ЭКСТРАКТА ИЗ МЕЛАНИНА ЧАГИ
© М.А. Бурмасова , М.А. Сысоева
Казанский государственный технологический университет, ул. К. Маркса,
68, Казань, 420015 (Россия), e-mail: [email protected]
Статья посвящена исследованию состава веществ меланина чаги, относящегося к природным нанообъектам. Анализ бутанольного экстракта, проведенный тонкослойной хроматографией (ТСХ), электронной спектроскопией, высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) и масс-спектроскопией, показал, что в исследуемом объекте присутствуют липиды, терпены и полисахариды.
Ключевые слова: чага, меланин - наночастица, экстракция бутанолом, тонкослойная хроматография, газожидкостная хроматография (ГЖХ), масс-спектроскопия.
Введение
В настоящее время большой интерес для исследователей представляет природное сырье как богатый источник биологически активных веществ, например гриб чага. Водные извлечения из чаги и препараты на их основе применяют для лечения язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, дерматитов, как общеукрепляющее средство для повышения общего тонуса организма.
Основным действующим компонентом водных извлечений из гриба чаги является меланин [1]. Состав меланина сложен и оценивать его приходится на основании анализа разрушенной частицы после различных физических и химических воздействий. В литературных источниках, относящихся к 60-м гг., определено, что в состав меланина входят: зола - 0,8-2,5%, азотистые вещества - 0,5-0,6% (половина этого количества приходится на белковый азот), свободные ароматические кислоты - 0,4-0,6%, свободные фенолы - 0,1-0,8%, около 98% - эфирорастворимые соединения кислотного характера (сиреневая, ванилиновая, параоксибензойная кислоты) [2]. Из более поздней работы Г.Л. Рыжовой, где состав меланина, выделенного из водного извлечения, полученного с использованием ультразвука, изучался методом кислотного гидролиза (10% раствором хлористоводородной кислоты) в автоклаве при 1,5 атм и t =126 °С известно, что в состав частицы меланина входят: фенолы свободные - 0,62%, фенолы связанные - 0,19%, карбоновые кислоты - 6,64%, флавоноиды (апигенин, кверцетин, морин, нарингенин) - 0,09%, углеводы свободные -3,88%, углеводы связанные - 14,00% и другие соединения [3]. Из литературы известно, что свежеосажден-ный меланин растворяется в воде и слабощелочных растворах, 50% растворе этилового спирта и в 80% растворе ацетона. Высушенный на воздухе и при повышенной температуре меланин теряет свою растворимость почти целиком и не растворяется в диэтиловом эфире, хлороформе, ксилоле и бензине; высушенный в вакууме сохраняет растворимость только в растворах соды и щелочей [2]. В настоящее время структура меланина чаги полностью не выяснена, поэтому исследование веществ, входящих в его состав, способных проявлять терапевтический эффект, является актуальным.
Цель настоящей работы - определение качественного состава бутанольного экстракта, полученного из меланина гриба чаги.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальная часть
Лекарственное сырье закупалось в аптечной сети. Использовался гриб чага измельченный, партии ЗАО «Здоровье», МО, Красногорский район, серия Б 12 08. Водное извлечение получали методом ремацерации [4]. Меланин выделяли 25% раствором хлористоводородной кислоты с дальнейшим центрифугированием выпадающего осадка. Влажность меланина чаги определяли согласно методике [5]. Содержание экстрактивных веществ в бутанольном экстракте - весовым методом.
Качественный состав липидов выявляли методом тонкослойной хроматографии на пластинках «8огЪШ» в системах растворителей: гептан - бензол (9 : 1); гексан - диэтиловый эфир - уксусная кислота (80 : 20 : 1); хлороформ - ацетон - метанол - уксусная кислота - вода (6 : 8 : 2 : 2 : 1). В качестве раствора сравнения для определения липидов применяли 1% раствор лауриновой кислоты в гексане и 2% раствор лецитина в петро-лейном эфире [6]. Для количественного определения липидов использовали весовой метод [7]. В качестве проявителя использовали 20% раствор сульфата аммония с последующим нагреванием до 180 °С.
Количественное определение углеводов проводили фенол-сернокислотным методом [8]. Кислотный гидролиз полисахаридов проводился 15% раствором хлористоводородной кислоты в течение 4 ч. Качественный состав углеводов определяли методом бумажной хроматографии в системе растворителей: бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 5). В качестве проявителей использовали анилин-фталевый реактив [8, 9].
Антиоксидантную активность определяли методом кулонометрического титрования электрогенери-рованным бромом [10]. Электронный спектр снимали на приборе «8РЕСОРО». Высокоэффективную жидкостную хроматографию осуществляли на приборе «ВЭЖХ ЬС-2010» с использованием колонки ЗирегсоБЙ ЬС-18-ДВ 150x4,6, 5 мм. Элюент: вода - ацетонитрил - Н3РО4 (80 : 20 : 0,05). Масс-спектры снимали на приборе «БР8-система ГХ /МС высокого разрешения».
Обсуждениерезультатов
Для изучения веществ, входящих в частицу меланина чаги, проведена экстракция меланина с влажностью 95% бутанолом при комнатной температуре. Согласно литературным данным, бутанолом можно экстрагировать из природного объекта полигликозидные формы фенольных соединений и дубильные вещества [11].
Полученный бутанольный экстракт содержит 23% сухих веществ от массы меланина, взятого для исследования. Хроматографический анализ бутанольного экстракта показал, что в нем содержатся липиды. Для их удаления экстракт обрабатывали гексаном 5 раз в соотношении 2 : 1. В полученном гексане с помощью ТСХ в небольшом количестве были определены углеводороды, триглицериды, эфиры стеринов, моно- и диглицериды.
Подготовленный таким образом бутанольный экстракт был проанализирован с помощью электронной спектроскопии и ВЭЖХ. На электронном спектре бутанольного экстракта имеются 3 максимума поглощения при длинах волн 217, 233, 245 нм. При длине волны 250 нм был проведен его анализ с помощью ВЭЖХ. Показано, что в бутанольном экстракте содержится не менее трех веществ. Разделенные вещества анализировали на газовом хроматомасс-спектрометре. На хроматограмме обнаружено 3 пика с временами удерживания 12,67 мин, 12,89 мин, 14,15 мин. Вещество, соответствующее пику на хроматограмме с временем удерживания 12,89 мин, при прямом вводе в колонку хроматомасс-спектрометра разрушалось и анализу не подлежало. Снят масс-спектр электронной ионизации вещества на хроматограмме, соответствующего времени удерживания 12,67 мин. Согласно данным масс-спектроскопии вещество можно отнести к классу терпенов. На масс-спектре имеется пик фрагмента молекулярного иона ш/7 191,1, который подтверждает наличие в образце агликонового остатка кумариновой природы, согласно [12], образующегося из соответствующего гликозида. Действительно, количественное содержание углеводов в бутанольном экстракте составляет 0,83% от сухого остатка бутанольного экстракта. Кроме гликозидов, частица меланина может содержать более сложно организованные олиго- и полисахариды. Японские ученые (Мицзуно и соавторы) показали, что в состав чаги входят водорастворимые и спирторастворимые полисахариды, обладающие биологической активностью [13]. Поэтому бутанольный экстракт был подвергнут кислотному гидролизу, после чего количество углеводов составило 1,10% от сухого остатка бутанольного экстракта.
В гидролизате с помощью хроматографического анализа удалось идентифицировать глюкозу, галактозу, арабинозу и ксилозу, что подтверждает наличие в анализируемом экстракте гетерополисахаридов.
Вещество на хроматограмме, соответствующее времени удерживания 14,15 мин, с помощью масс-спектроскопии и базы данных идентифицировано как сквален [14]. Сквален представляет собой тритерпен -2,6,10,15,19,23-гексаметил-тетракоза-2,6,10,14,18,22-гексаен. Сквален является предшественником стероидов и влияет на их метаболизм, что может объяснять регуляцию деятельности сердечно-сосудистой системы при приеме препаратов на основе чаги [15]. Экспериментально подтверждена способность сквалена выводить из организма липофильные ксенобиотики. Сквален содержится в оливковом, хлопковом и льняном маслах, в масле из зародышей пшеницы, во множестве животных и растительных тканей [16].
Известно, что сравнительно легко из растительного сырья можно экстрагировать терпены методом сверхкритической экстракции диоксидом углерода. Исследователями была показана возможность использования сверхкритической флюидной экстракции для получения экстракта из гриба чаги. Позднее этим методом был обнаружен сквален из сырья чаги в количестве 0,45% [17]. В случае меланина чаги сквален, видимо, является инициатором создания гидрофобной поверхности агрегатов и субагрегатов в наночастице меланина [18]. Поэтому при обработке бутанольного экстракта гексаном на хроматограмме сквален обна-ружить не удалось.
Сухой остаток бутанольного экстракта после удаления из него растворителя растворяли в воде и этиловом спирте. Полученные растворы обладают антиоксидантной активностью (АОА), равной АОАв = 0,51±0,02 (Sr =0,027) и АОАэс = 0,81±0,03 (Sr =0,026) соответственно. Значение АОА в спиртовом растворе выше значения АОА в водном растворе. Возможно, это связано с лучшей растворимостью в спиртовом растворе таких липофильных веществ, как терпены, сквален, которые могут обеспечивать повышение АОА анализируемого объекта.
Выводы
1. Определено, что в бутанольном экстракте из меланина чаги содержатся углеводы в количестве 0,83% от сухого остатка бутанольного экстракта; липиды и тритерпены, представленные скваленом.
2. Установлено, что углеводы, входящие в состав бутанольного экстракта, представлены гликозид-ными формами и сложно организованными олиго- и полисахаридами, которые состоят из глюкозы, галактозы, арабинозы и ксилозы.
Список литературы
1. Шиврина А.Н. Химическая характеристика действующих начал чаги // Продукты биосинтеза высших грибов и их использование. М. ; Л., 1966. С. 49-55.
2. Шиврина А.Н., Ловягина Е.В., Платонова Е.Г. К характеристике комплекса сложных органических соединений чаги // Чага и ее лечебное применение при раке IV стадии. Л., 1959. С. 72-82.
3. Рыжова Г.Л., Кравцова С.С., Матасова С.А., Грибель Н.В., Пашинский В.Г., Дычко К.А. Химические и фармакологические свойства сухого экстракта чаги // Химико-фармацевтический журнал. 1997. №10. С. 44-47.
4. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова B.C., Халитов Ф.Г., Суханов П.П. Исследование золя водных извлечений чаги. II. Изменение изучаемой системы при проведении экстракции различными способами // Вестник Казанского технологического университета (КГТУ). 2003. №2. С. 172-179.
5. Государственная фармакопея СССР: Вып. 1. Общие методы анализа. 11-е изд., доп. М., 1987. 336 с.
6. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. М., 1975. 322 с.
7. Северин С.Е., Соловьева Г.А. Практикум по биохимии. М., 1989. 509 с.
8. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов. Киев, 1982. 192 с.
9. Хроматография на бумаге / под ред. И.М. Хайса, К. Мацека. М., 1962. 851 с.
10. Сысоева М.А., Кузнецова О.Ю., Гамаюрова B.C., Суханов П.П., Зиятдинова Г.К., Будников Г.К Исследование золя водных извлечений чаги. IV. Антиоксидантная активность. Влияние способа извлечения и применение комплексонов, гидроокиси натрия // Химия растительного сырья. 2005. №1. С. 41-47.
11. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М., 1974. 214 с.
12. Лукша Е.А., Калинкина Г.И., Коломиец Н.Э. Исследование фенольных соединений урологического сбора методом ВЭЖХ-МС // Химия растительного сырья. 2009. №4. С. 139-142.
13. Mizuno T. The extraction and development of antitumoractin polysaccharides from medicinal mushrooms in Japan / T. Mizuno // Int. J. Med. Mushrooms. 1999. №1. Pp. 9-29.
14. Spectral Database for Organic Compounds SDBS.
15. Шиврина A.H. Гуминоподобные соединения, образуемые древообразующими грибами // Биологически активные вещества высших грибов. М.; Л., 1965. С. 82-108.
16. Дейнека Л.А., Дейнека В.И., Гостищев И.А., Сорокопудов В.Н., Сиротин А.А. Определение сквалена в семенах некоторых растений семейства Amaranthaceae // Химия растительного сырья. 2008. №4. С. 69-74.
17. Сверхкригическая флюидная экстракция. URL: http://www.extract.ru
18. Сысоева М.А., Харина М.В., Хуснутдинов П.Р., Гревцев В.А. Сравнительный анализ меланинов чаги с помощью электронной микроскопии // Пищевые технологии и биотехнологии : матер. XI международной конференции молодых ученых Казань, 2010. С. 285.
Поступило в редакцию 27 мая 2011 г.
