CC BY
46
УДК 579.64
А. Б. Кононенко, Д. А. Банникова, С. В. Бритова, Е. П. Савинова,
О. А. Жунина, А. В. Лобанов, С. М. Васильев, В. Н. Горшенев, Г. Е. Заиков, С. Д. Варфоломеев РАСТВОРЫ И ПЛЕНКИ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА, ПОЛУЧЕННЫЕ ФОТОХИМИЧЕСКИМ СПОСОБОМ, И ИХ БАКТЕРИЦИДНАЯ АКТИВНОСТЬ
Ключевые слова: наночастицы серебра, бактерицидная активность.
Предложен фотохимический синтез наночастиц серебра, водные препараты и пленки которых могут быть использованы для дезинфекционной обработки, предотвращения размножения опасных микроорганизмов в помещениях, оборудовании предприятий пищевой промышленности, в медицине.
Keywords: silver nanoparticles, bactericidal activity.
Photochemical synthesis of silver nanoparticles was proposed. Nanoparticle water formulations and films can be used for disinfection treatment, preventing the multiplication of dangerous microorganisms in the premises, equipment of the food industry, in medicine.
Введение
В настоящее время на отечественном рынке отсутствуют экологически безопасные, нетоксичные отечественные дезинфектанты. В промышленности и в быту используют хлорсодержащие средства (хлорная известь, хлорамин, раствор гипохлорита натрия), далеко не безупречные по показателям токсичности, экологической безопасности, стойкости во времени. Кроме того, традиционные хлорсодер-жащие дезинфицирующие средства создают определенный риск для здоровья людей, окружающей среды, вызывают коррозию контактирующего с ними оборудования, отличаются ограниченным сроком действия [1].
Длительным антимикробным действием и пониженными токсичностью, летучестью обладают препараты наночастиц серебра со стабилизаторами, способные образовывать на поверхности биоцидную пленку, сохраняющую длительное время защитный эффект, а также препараты наночастиц серебра в жидкой форме на водной основе [2]. Ввиду сказанного актуальным является разработка простых и удобных способов создания бактерицидных препаратов наночастиц серебра.
Экспериментальная часть Наночастицы серебра получали фотохимическим синтезом по модифицированной методике [3], включающей взаимодействие ионов серебра со стабилизирующим агентом в водном растворе при комнатной температуре под действием света видимого диапазона. В качестве стабилизаторов использовали поливиниловый спирт (м.в. 10000 г/моль), крахмал, поливинилпирролидон (м.в. 26400 г/моль), додецилсульфат натрия, Тритон Х-100, олеиновую кислоту или бинарную смесь этих веществ. В стандартном эксперименте в 50 мл дистиллированной воды растворяли 40 мг стабилизатора-восстановителя, после чего прибавляли 30 мг нитрата серебра и полученный прозрачный раствор облучали светом галогенной лампы мощностью 150 Вт при интенсивном перемешивании раствора на магнитной мешалке. Расстояние между раствором и источником света - 30 см, что соответствует удельной мощности светового потока - 10 мВт/см2. Время
облучения в описанных условиях составляло 30-120 мин. Размер и статистическое распределение по размеру стабилизированных наночастиц серебра определяли методом просвечивающей электронной микроскопии с использованием прибора «Hitachi-11» (Япония). Размер наночастиц серебра для всех растворов составляет 20-30 нм. Этому размеру соответствует 70% количества наночастиц. Исключение - раствор с додецилсульфатом натрия, где преобладают частицы с размером 60 нм. Остальная часть -это частицы от 2 до 200 нм.
Методом диффузии в агар была определена бактерицидная активность препаратов наночастиц серебра с различными стабилизаторами. В толще мясо-пептонного агара, содержащего суточную культуру микроорганизмов в дозе 107 м.к./мл, стерильно делали лунки диаметром 4 мм. В лунки вносили рабочие разведения препарата и помещали в термостат при 37 0С на 18-20 часов. Результаты оценивались по зоне задержки роста тест-культур вокруг лунки.
Обсуждение результатов
В качестве тест-культур были выбраны E. coli, S. aureus, S. enteritidis, S. dublin, S. cholerasuis, S. typhimurium. С целью изучения спектра действия наночастиц серебра их активность была также изучена в отношении бактерий родов Citrobacter, Providencia, Hafnia, Proteus, Morganella и Listeria. Все препараты оказывали бактерицидное действие по отношению к изученным микроорганизмам при содержании серебра 4-35 мг/л. Полученные результаты на примере действия растворов наночастиц серебра, стабилизированных поливинилпирролидо-ном, представлены в таблицах 1 и 2. Как видно из данных таблицы 1, каких-либо различий в размерах зон задержки роста в зависимости от природы микроорганизмов отмечено не было. Препараты наночастиц серебра в процессе хранения при комнатной температуре без доступа света сохраняли уровень бактерицидной активности по отношению к тест-культурам E. coli и Salmonella s.p.p. в течение 6 мес. Однако в зонах задержки роста стафилококка отмечалось очень слабое помутнение агара, что свидетельствовало о бакте-риостатическом действии. В процессе хранения рас-
творов количество наночастиц снижалось не более чем на 10%. Распределение по размеру частиц сохранялось на первоначальном уровне.
Таблица 1 - Бактерицидная активность препаратов наночастиц серебра, стабилизированных по-ливилпирролидоном
Наименование микроорганизма Зона задержки роста (мм)
Содержание серебра в препарате (мг/л)
35 17 8 4
E.coli О 1257 18 18 12 10
S. aureus 209 Р 18 16 10 10
S. enteritidis 16 14 11 8
S. dublin 17 14 11 9
S. cholerasuis 14 12 10 10
S. typhimurium 10 10 10 10
Citrobacter freundii 12 11 10 10
Providencia rettgeri 11 9 8 8
Proteus mirabilis 20 19 18 14
Proteus vulgaris 12 12 11 10
Y. enterocolitica 17 14 9 8
Y. pseudotuberculosis 15 11 8 8
Listeria monocytogenes 18 12 10 10
Была определена бактерицидная активность препаратов наночастиц серебра, содержащих в качестве стабилизаторов и пленкообразующих компонентов, таких как поливиниловый спирт (время синтеза наночастиц серебра составляло 30 мин и 2 ч), додецилсульфат натрия, Тритон Х-100, олеиновая кислота. Дезинфицирующую активность препаратов наночастиц серебра изучали на гладких поверхностях (кафельная и метлахская плитка), контамини-рованных взвесью суточной культуры тест-микроорганизма с использованием белковой защиты. Экспозиция воздействия при этом составляла 30 мин и 3 ч. Препараты наносили из расчета 500 мл/м2. Нейтрализацию действия препарата осуществляли путем десятикратного разведения смывов с обработанного объекта. Контролем служили объекты, обработанные водой. Результаты определения бактерицидной активности данных препаратов представлены в таблице 2. Из представленных данных следует, что все препараты обладают бактерицидной активностью в отношении тест-культур при содержании серебра не менее 4 мг/л. Дезинфицирующая активность в отношении E. coli и Salmonella s.p.p. установлена у препаратов с содержанием серебра не менее 17 мг/л и экспозиции воздействия 3 ч. Указанная концентрация наночастиц серебра в препаратах не позволяла достичь обеззараживающего эффекта на тест-объектах, контаминированных S. aureus. В посевах в МПБ смывов с таких объектов на 2-3 сутки появлялся рост культур. Полное обеззараживание объектов, контаминированных золотистым стафилококком, достигалось при воздействии препаратов с содержанием серебра 35 мг/л при экспозиции 3 ч.
Методом электронной микроскопии была изучена морфология популяций сальмонелл при воздействии наночастиц серебра в дозах, вызывающих бактериостатический и бактерицидный эффекты. В экспериментах была модулирована ситуация, при которой велось наблюдение за динамикой развития популяции сальмонелл на обработанных растворами серебра поверхностях. Щадящие способы фиксации и обезвоживания препаратов позволили сохранить естественную архитектонику бактериальной популяции в развитии.
Таблица 2 - Бактерицидная активность препаратов наночастиц серебра, содержащих компонент для образования пленки (1 - поливиниловый спирт (синтез 30 мин), 2 - поливиниловый спирт (синтез 2 ч), 3 - поливиниловый спирт и додецилсульфат натрия, 4 - поливиниловый спирт и Тритон Х-100, 5 - поливиниловый спирт и олеиновая кислота)
Зона задержки роста (мм)
Препарат Содержание серебра Наименование микроорганизма
(мг/л) E. Salmonella S.
coli s.p.p. aureus
35 17 17 17
1 17 16 15 14
8 13 12 10
4 10 10 8
35 18 13 12
2 17 15 10 9
8 11 7 8
4 9 7 8
35 16 14 18
3 17 15 13 16
8 14 12 12
4 11 9 9
35 17 15 17
4 17 16 14 15
8 15 13 12
4 11 10 9
35 20 17 17
5 17 19 14 14
8 16 11 10
4 11 9 8
В контрольных образцах колонии сальмонелл представляли собой популяции палочковидных клеток, объединенных межклеточным матриксом и закрытые с поверхности плотным покровом (биопленкой). В отдельных участках отмечены делящиеся палочковидные клетки.
На поверхностях, обработанных растворами наночастиц серебра с содержанием серебра 2 мг/л, в популяции клеток сальмонелл происходило частичное разрушение наружного покрова и межклеточного матрикса между отдельными бактериальными клетками, и, как следствие, нарушение пространственной ориентации клеток.
На поверхностях, обработанных растворами наночастиц серебра с содержанием серебра 4 мг/л, в популяциях сальмонелл развивались клетки гетеро-морфного типа. Отмечено образование округлых
использованных в опыте тест-культур. Контролем служили тест-объекты, обработанные водой.
В посевах смывов с поверхностей в контроле обнаруживали сплошной роста тест-культур, в то время как с поверхностей, обработанных препаратами наночастиц серебра, рост тест-культур отсутствовал. При исследовании обработанных препаратами наночастиц серебра инструментов (ножницы, пинцеты) рост микроорганизмов в посевах смывов был представлен единичными колониями, а в контроле (обработка водой) доходил до сотни колоний в отдельных пробах. После охлаждения тушек птиц водой без обработки (контроль) отмечался обильный рост тест-культур в посевах во всех пробах смывов с их поверхности. В смывах с тушек, обработанных раствором наночастиц серебра, рост энте-робактерий отмечался в количестве 20-40 колоний в отдельных пробах.
Таким образом, может быть предложен способ дезинфекции, включающий разведение препаратов наночастиц серебра до содержания 35 мг/л, нанесение препаратов из расчета 500 мл/м2 на заранее подготовленные (механически очищенные) объекты, подлежащие обеззараживанию (кафельная и метлахская плитка, поверхности оборудования и инструменты для разделки, тушки птицы), экспозицию в течение 3 ч, а при дезинфекции инструментов для разделки и тушек птицы - 30 мин, контроль дезинфекции с помощью смывов стерильными ватными тампонами в пробирки с физиологическим раствором и последующего бактериологического анализа. Средство может быть рекомендовано для применения в медицине, для антимикробной защиты продуктов питания, в качестве антимикробных добавок в лакокрасочные составы.
Работа выполнена при поддержке Ведущей научной школы (проект № НШ-5226.2014.3).
Литература
1. Дезинфекционные средства. Справочник, часть 1. Дезинфицирующие средства (под ред. А.А. Монисова, М.Г. Шандалы). ТОО "Рарогъ", Москва, 1996. 176 с.
2. Е.К. Баранова, А. Л. Мулюкин, А.Н. Козлова, А.А. Реви-на, Г.И. Эль-Регистан, Наукоемкие технологии, 6, 5, 33-37 (2005).
3. Б.М. Сергеев, М.В. Кирюхин, А.Н. Прусов, В.Г. Сергеев, Вестн. моск. ун-та. сер. 2. химия, 40, 2, 129-133 (1999).
4. M. Pitzurra, W. Szybalski, J. Bacteriol., 77, 614-620 (1959).
© А. Б. Кононенко - к..б.н., доц., зав. лаб. санитарной микробиологии, Всерос. науч.-исслед. ин-тут ветеринарной санитарии, гигиены и экологии, sanmicrobio@mail.ru; Д. А. Банникова - к.б.н., ст.н.с. той же лаборатории; С. В. Бритова к.б.н., ст.н.с. той же лаборатории; Е. П. Савинова к.б.н., ст.н.с. той же лаборатории; О. А. Жунина - ст.н.с., ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения»; А. В. Лобанов -к.х.н., ст.н.с., зам. зав. лаб. Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, avlobanov@mail.ru; С. М. Васильев - зам. директора, «Институт современных стандартов»; В. Н. Горшенев - к.х.н., ст.н.с. лаб. прикладной электродинамики и фотоники композиционных материалов и наноструктур, Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН; Г. Е. Заиков - д.х.н., проф., проф. каф. ТПМ КНИТУ; С. Д. Варфоломеев - д.х.н., проф., член-корр. РАН, дир., Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, sdvarf@sky.chph.ras.ru.
© A. B. Kononenko, PhD, Assoc., Head of Laboratory, Laboratory of sanitary microbiology, All-Russian Research Institute of Veterinary Sanitation, Hygiene and Ecology, sanmicrobio@mail.ru; D. A. Bannikova, Ph.D., Senior Researcher, Laboratory of sanitary microbiology, All-Russian Research Institute of Veterinary Sanitation, Hygiene and Ecology; S. V. Britova, Ph.D., Senior Researcher, Laboratory of sanitary microbiology, All-Russian Research Institute of Veterinary Sanitation, Hygiene and Ecology; E. P. Savinova, Ph.D., Senior Researcher, Laboratory of sanitary microbiology, All-Russian Research Institute of Veterinary Sanitation, Hygiene and Ecology; O. A. Zhunina, Senior Researcher, Russian Scientific Center of Molecular Diagnostics and Therapy; A. V. Lobanov, Ph.D., Senior Researcher, Deputy to the Head of Laboratory, Laboratory of photobionics, Department of dynamics of chemical and biological processes, Semenov Institute of Chemical Physics of RAS, avlobanov@mail.ru; S. M. Vasilev, Deputy to Director, Institute of modern standards, may200808@mail.ru; V. N. Gorshenev, Ph.D., Senior Researcher, Laboratory of applied electromagnetics and photonics of composite materials and nanostructures, Department of the electronics of organic materials and nanostructures, Emanuel Institute of Biochemical Physics of RAS; G. E. Zaikov, D.Sc., Prof., Professor, Department of "Technology of Plastics", KNRTU; S. D. Varfolomeev, D.Sc., Prof., Corresponding member of Russian Academy of Sciences, Director, Emanuel Institute of Biochemical Physics of RAS, sdvarf@sky.chph.ras.ru.
клеток - сферопластов, нередко образующих характерные тяжи [4]. Обратимость данных процессов в популяции доказана появлением типичного роста культуры сальмонелл после дополнительного подращивания на свежих питательных средах. Сканирующая электронная микроскопия таких культур выявила образование мощных скоплений реверсирующих клеток, имеющих типичное извитое строение. На отдельных участках зафиксировано начальное образование наружного покрова - биопленки, продуцируемой только клетками, имеющими полноценную клеточную стенку.
Взаимодействие растворов наночастиц серебра с содержанием серебра 40 мг/л вызывало необратимую гибель популяции сальмонелл на обработанных фильтрах. Отсутствие роста культуры при вторичном подращивании на свежих питательных средах, как агаризованных, так и бульонных, свидетельствовало о невозможности популяции к реверсии. Заслуживает внимания тот факт, что на скано-граммах при этом отчетливо видны типичные бактериальные микроколонии, представленные палочковидными клетками под покровами. Очевидно, что эти микроколонии, попав на обработанные бактерицидными растворами серебра поверхности, не могут развиваться, «замирают», сохраняя при этом натив-ную морфологию. Вероятно, высокие концентрации серебра вызывают мгновенную блокировку ферментных систем в бактериальных клетках, что делает невозможным их дальнейшее развитие.
Препараты наночастиц серебра были испытаны в модельных опытах с целью снижения уровня контаминации объектов ветеринарного надзора в птицеводческих хозяйствах (поверхности оборудования и инструментов для разделки, тушки птицы). Для этого перечисленные объекты искусственно контаминировали взвесью суточных культур E. coli и Salmonella s.p.p. Содержание серебра в препаратах составляло 35 мг/л. Поверхности обрабатывали из расчета 500 мл/м2 при экспозиции 3 ч, инструменты погружали в раствор препаратов наночастиц серебра на 30 мин, тушки птицы помещали в емкость с холодной водой, содержащей препарат наночастиц серебра для охлаждения (30 мин). По истечении экспозиции производили смывы стерильными ватными тампонами в пробирки с физиологическим раствором и проводили бактериологический анализ на наличие
