CC BY
119
УДК 579.61
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ КАРБАПЕНЕМАЗ СРЕДИ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ ENTEROBACTERIACEA В РОССИИ
М. В. Эйдельштейн1, В. С. Журавлев2, Е. А. Шек12
1Научно-исследовательский институт антимикробной химиотерапии СГМУ, Смоленск
2Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н. Г. Чернышевского E-mail: [email protected]
Рассмотрена проблема антибиотикорезистентности в России среди нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae, обусловленная продукцией карбапенемаз. В ходе проведенного исследования в 2014 году выявлено 4 типа ферментов у 6 видов энтеробактерий. Установлено, что основным возбудителем нозокомиальных инфекций и носителем генов приобретенных карбапенемаз является Klebsiella pneumoniae. Зафиксированы случаи продукции карбапенемаз среди внебольничной флоры у госпитализированных пациентов. Рост антибиотикорезистентности подтверждается анализом динамики выявления продуцентов карбапенемаз у нозокомиальных энтеробактерий в период с 2006 по 2014 годы.
Ключевые слова: карбапенемазы, антибиотикорезистент-ность, Enterobacteriaceae.
Prevalence of Nosocomial Strains Enterobacteriaceae Have Carbapenemases in Russia
M. V. Edelstein, V. S. Zhuravlev, E. A. Shek
In this article we have looked into the matter of antibiotic resistance among the group of nosocomial strains Enterobacteriaceae which has been determined by the production of carbapenemases. In 2014 there were revealed four types of enzymes and six types of enterobacterias. The main causative agent of nosocomial infections and the major host of the acquired carbapenemases gene is Klebsiella pneumonia. There were cases of carbapenemases' production about extramural flora of hospitalized patients. The hypothesis of increasing of antibiotic resistance is supported by the analysis of carbapenemases' detection dynamics on the material of nosocomial enterobacterias regarded during the period from 2006 to 2014.
Key words: carbapenemases, antibiotic resistance, Enterobacte-riaceae.
DOI: 10.18500/1816-9775-2017-17-1 -36-41 Введение
Проблема формирования и распространения антибиотикорезистентности стала очевидна уже к середине 40-х гг. прошлого века. Причиной тому явилось выявление штамма золотистого стафилококка, обладающего устойчивостью к действию пенициллина, буквально спустя несколько лет после начала его первого и широкомасштабного применения. В настоящее время
большую клиническую значимость имеют антибиотики группы карбапенемов, формирование устойчивости к которым можно рассматривать как одну из наиболее серьезных угроз системе современного здравоохранения [1].
Карбапенемы являются антибиотиками класса Р-лактамов. В клиническую практику вошли в середине 1980-х гг. как препараты «резерва» вследствие широкого распространения полирезистентности среди грамотрица-тельных бактерий, обусловленной продукцией Р-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) [1]. В настоящее время клиническую значимость имеют четыре препарата: имипенем (1986), меропенем (1996), эртапенем и дорипенем (2010) [1-4]. Как и все Р-лактамы, карбапенемы являются бактерицидными ингибиторами синтеза пептидогликана клеточной стенки бактерий. Важным отличительным свойством карбапенемов среди остальных Р-лактамов является наиболее широкий спектр антимикробной активности. Так, спектр активности имипенема, меропенема и дорипенема включает большинство грамотрицательных и грамположительных аэробных и анаэробных микроорганизмов, среди которых исключением являются ^епоХторкошопаз шакорИШа, мети-циллин-резистентные стафилококки (МЯБА) и ЕЫетососсш /авсшш. Отличием эртапенема является отсутствие активности в отношении грамотрицательных неферментирующих бактерий. Карбапенемы применяются в основном для лечения тяжелых и жизнеугрожающих инфекций, вызванных множественно резистентными бактериальными возбудителями (нозокомиальная пневмония, менингит, интраабдоминальные инфекции и др.) [3, 4].
Устойчивость микроорганизмов к различным антибактериальным препаратам может определять целый ряд механизмов. Однако в формировании устойчивости к карбапенемам наибольшее значение имеет ферментативная инактивация препарата через продукцию микроорганизмом ферментов Р-лактамаз, названных карбапенема-зами [1,5]. На сегодняшний день карбапенемазы представляют собой обширную группу фермен-
тов, неоднородную как по структуре, так и по субстратной специфичности и происхождению. Согласно классификации Р-лактамаз K. Bush и G. A. Jacoby эти ферменты относятся к трем молекулярным классам - А, В и D [6]. Ферменты классов А и D содержат серин в активном центре, что определяет их принадлежность к сериновым Р-лактамазам. В противоположность им ферменты класса B являются металлосодержащими Р-лактамазами и несут один или два атома цинка в своем активном центре. Карбапенемазной активностью обладают отдельные представители всех трех молекулярных классов: A, D и B, которые принадлежат к функциональным группам: 2f, 2df и 3 соответственно [1, 6]. Наличие карбапенемаз у микроорганизма определяет его устойчивость практически ко всем Р-лактамам. Многочисленные исследования показали, что для Европы характерен различный уровень распространенности карбапенемазопродуцирующих штаммов, однако даже для наиболее благоприятных в эпидемиологическом плане стран ЕС (Норвегия, Швеция, Финляндия) свойствен широкий спектр наличия карбапенемаз [1, 7, 8].
Во всем мире крайне серьезную проблему представляет формирование карбапенемоустой-чивых штаммов микроорганизмов в лечебно-профилактических учреждениях и стационарах. Именно в них в результате селективного прессинга происходит адаптация и дальнейшее распространение наиболее устойчивых представителей. Нахождение больного в подобной среде сопровождается риском развития у последнего вну-трибольничной, или нозокомиальной, инфекции (НИ) [9, 10]. ВОЗ определяет НИ как инфекцию, развившуюся у пациента через 48 и более часов после госпитализации, при условии, если при поступлении пациента в стационар инфекция отсутствовала и не находилась в инкубационном периоде. Также под определение НИ попадают те случаи, при которых инфекция является следствием предшествующей госпитализации. Для пациента развитие НИ грозит осложнением течения болезни и ухудшением прогноза на выздоровление, что, как правило, приводит к повышению риска летального исхода. Одними из распространенных возбудителей госпитальной инфекции являются представители семейства Enterobacteriaceae [11].
В связи с этим целью данной работы стало определение с использованием молекулярно-ге-нетических методов наличия и разнообразия основных типов карбапенемаз (металло-Р-лактамаз VIM, IMP, NDM типов; сериновых карбапенемаз групп KPC, OXA-48 и GES 2/5) у клинических штаммов энтеробактерий, выделенных в 2014 г.
Материалы и методы
Объектами исследования явились 1524 неповторяющихся (по одному от каждого пациента) клинических изолятов энтеробактерий, полученных в рамках многоцентрового проспективного эпидемиологического исследования антибиотикорезистентности МАРА-ФОН-2014 в период с 1.01.2014 по 31.12.2014 г. из 30 стационаров 19 городов РФ. В исследование включались изоляты-возбудители инфекций как нозокомиальной, так и внеболь-ничной природы, полученные от госпитализированных пациентов. Из 1524 полученных микроорганизмов 1112 были определены как нозокомиальные и 412 как внебольничные возбудители. Работа проводилась на базе НИИАХ ГБОУ ВПО СГМУ Минздрава России (г. Смоленск).
Выявление генов наиболее
распространенных карбапенемаз
Для выявления продукции карбапенемаз было отобрано 466 изолятов энтеробактерий, проявляющих в соответствии с критериями ЕИСАБТ пониженную чувствительность хотя бы к одному из карбапенемов: МПК имипенема >1 мг/л, МПК меропенема или эртапенема > 0,125 мг/л [11-13].
Наличие генов металло-Р-лактамаз (¿/ау1М, ¿/а1Мр и Ь/аКОм) и сериновых карбапенемаз (¿/аКрс и Ь/аОХл-48) определяли методом ПЦР в режиме реального времени с использованием коммерческих наборов «АмплиСенс МБЯ МБЬ-РЬ» и «АмплиСенс КРС/ОХЛ-48-РЬ» соответственно (Интерлабсервис, Россия). Амплификацию с гибридизационно-флуорес-центной детекцией в режиме реального времени проводили с применением детектирующего ам-плификатора иТрптв 5 Х1 (ДНК-Технология, Россия) согласно протоколу.
Для выявления генов ОЕБ Р-лактамаз использовали метод ПЦР в режиме реального времени с последующим анализом кривых плавления флуоресцентно-меченого зонда, ранее разработанный в НИИАХ. Состав ПЦР-смеси представлен в табл. 1. Наличие внутренних фрагментов генов, кодирующих ОЕБ Р-лактамазы «дикого типа» (ОЕ8-1-подобные ферменты) и мутантные производные, обладающие карбапенемазной активностью (ОЕБ-2- и ОЕБ-5-подобные ферменты), определяли в соответствии с температурой плавления зонда, регистрируемой по изменению флуоресценции на канале РАМ: 62,8±0,2°С -для ОЕБ-1, 56,9±0,2°С - для ОЕБ-5, 51,6±0,2°С - для ОЕБ-2.
Таблица 1
Состав ПЦР-смеси для дифференциальной детекции генов GES ß-лактамаз
Компоненты Конечная концентрация
Праймер GES-Fpm (5'-cgcaaagagcc(g-LNA)gagatg-3')* 0,2 мкМ
Праймер GES-Rpm-BHQ (5'-tgtatctctgagg(t-BHQ)cgccagg-3')* 0,8 мкМ
Зонд GES-PbC-FAM (5'-gccaggtgtgttgtcgcc-3'-FAM)* 0,2 мкМ
Смесь dNTP 0,2 мкМ
Буфер SNP Detect с Mg2+ (Евроген, Россия) 1X
Полимераза SNP Detect (Евроген, Россия) 5 ед.
Образец ДНК 3,8 мкл
Общий объем реакции 10 мкл
Примечание. * Олигонуклеотиды синтезированы ЗАО Синтол (Россия).
Результаты и их обсуждение
В результате проведенного тестирования карбапенемазы различных типов обнаружены у 96 нозокомиальных энтеробактерий, что составляет 8,6% всех случаев внутрибольничной инфекции. Всего выявлено 4 типа ферментов из 7 исследованных, относящихся к трем молекулярным классам. Среди металло^-лактамаз обнаружен фермент группы NDM (n =17). Сериновые карбапенемазы почти полностью представлены OXA-48-подобными ферментами, они найдены у 72 микроорганизмов (6,5% случаев). У одного изолята Klebsiella pneumonia, обнаруженного в стационаре Санкт-Петербурга,
Кроме того, большой интерес может представлять обнаружение продуцентов карбапене-маз среди возбудителей внебольничной инфекции. Всего зафиксировано 5 подобных случаев в 4 городах - Краснодаре, Смоленске, Тюмени и Набережных Челнах. У четырех из пяти изолятов выявлены OXA-48 подобные ферменты и у одного NDM - карбапенемаза. В четырех
выявлен фермент группы KPC. Следует отметить эндемичность распространения данного фермента - в России все случаи зарегистрированы в Санкт-Петербурге. Отдельную группу составили микроорганизмы, несущие комбинацию генов OXA-48 и NDM, всего было выявлено 6 подобных случаев, что составляет 0,5% от всех нозокомиальных микроорганизмов. Все изоляты, у которых имеет место копродуцирование двух карбапенемаз, принадлежат виду K. pneumoniae и выделены в Санкт-Петербурге. Гены, кодирующие ферменты карбапенемаз групп VIM, IMP, а также карбапенемазы и ß-лактамазы расширенного спектра группы GES, обнаружены не были (табл. 2).
случаях возбудителем являлась K. pneumoniae и в одном E. coli.
Большую часть всех энтеробактерий-проду-центов карбапенемаз составили представители вида K. pneumoniae - 88% (n=89). Остальные виды, включая E. coli, Proteus mirabilis и Serratia marcescens, в совокупности составили десятую часть всех изолятов (табл. 3).
Таблица 2
Распространенность карбапенемаз среди нозокомиальных и внебольничных изолятов
Тип карбапенемаз Среди нозокомиальных изолятов (n=1112) Среди внебольничных изолятов (n=412) Среди всех изученных изолятов (n=1524)
количество изолятов доля изолятов, % количество изолятов доля изолятов, % количество изолятов доля изолятов, %
OXA-48 72 6,5 4 0,97 76 5
NDM 17 1,5 1 0,24 18 1,2
OXA-48+NDM 6 0,5 - - 6 0,4
KPC 1 0,09 - - 1 0,07
Всего 96 8,6 5 1,21 101 6,63
Видовой состав продуцентов карбапенемаз
Таблица 3
Вид микроорганизма- Тип карбапенемаз Доля среди всех
продуцента карбапенемаз OXA-48 NDM OXA-48+NDM KPC продуцентов (n=101), %
Klebsiella pneumoniae 70 12 6 1 89 88
Escherichia coli 1 3 - - 4 3,96
Proteus mirabilis - 3 - - 3 2,97
Serratia marcescens 3 - - - 3 2,97
Enterobacter cloacae 1 - - - 1 0,99
Citrobacter freundii 1 - - - 1 0,99
Итого 76 18 6 1 101 100
Карбапенемазопродуцирующие энтеробак-териии обнаружены в 15 стационарах 10 городов России. Наиболее распространенным в географическом плане стал фермент ОХА-48, который выявлен в 9 городах России. Металлофермент группы КБМ занял второе место как по частоте выявления, так и по распространению - обнаружен в 4 городах. В целом основными очагами распространения карбапенемазопродуцирую -щих штаммов энтеробактерий можно считать
Географическая распростране
крупные центры, такие как Москва, Санкт-Петербург и Краснодар, однако единичные случаи отмечаются и в относительно небольших городах (Смоленск, Ижевск, Набережные Челны), что может служить одним из признаков роста тенденции к повсеместному распространению устойчивости к карбапенемам. Санкт-Петербург оценивается как наиболее неблагоприятный по эпидемиологической обстановке город - в нем выявлены ферменты всех 4 групп (табл. 4).
Таблица 4
сть продуцентов карбапенемаз
Город Тип карбапенемаз Всего Доля среди всех продуцентов (n=101), %
OXA-48 NDM OXA-48+NDM KPC
Москва 35 4 - - 39 38,6
Краснодар 15 3 - - 18 17,8
Санкт-Петербург 3 7 6 1 17 16,8
Ижевск 9 - - - 9 8,9
Набережные Челны 7 - - - 9 6,9
Томск 4 - - - 4 3,96
Омск 1 3 - - 4 3,96
Ростов-на-Дону 1 - - - 1 0,99
Тюмень 1 - - - 1 0,99
Смоленск - 1 - - 1 0,99
Итого 76 18 6 1 101 100
Динамика выявления карбапенемаз представлена на рисунке. Оценивая динамику выявления карбапенемаз среди энтеробактерий с 2006 г., можно судить об отчетливом росте числа подобных случаев среди внутрибольничной флоры, а также об увеличении разнообразия выявляемых групп ферментов [11].
Заключение
В ходе проведенного исследования определено наличие и разнообразие генов основных карбапенемаз среди клинических изолятов семейства Enterobacteriaceae, выделенных в 2014 году. Энтеробактерии, способные ги-дролизовать карбапенемы, обнаружены в
10 9 s
7 6
4 3 2 1 0
1997-99 n=159S)
2002 04 п=1374|
2006-07 n=1039)
2011-12 n=572)
2013 n=356|
и,1 0,5 1,5 6,5
и,J 1,1 4,2
■ш 3,3
0,1
2014 n=1112)
IKPC VIM
I NDM+OXA-48 I NDM IOXA-48
Динамика выявления карбапенемазопродуцирующих штаммов энтеробактерий в России
15 стационарах 10 городов России. Основным возбудителем нозокомиальной инфекции различной этиологии и локализации, а также продуцентом карбапенемаз является вид K. pneumoniae - типичный представитель больничной микрофлоры. В 2014 г. выявлено 96 случаев продукции карбапенемаз среди но-зокомиальных энтеробактерий, а также 5 случаев - среди внебольничных возбудителей. Основной детерминантой устойчивости к карбапенемам среди энтеробактерий является ß-лактамаза класса D - фермент OXA-48. В меньшей степени резистентность обусловливает наличие NDM металло^-лактамазы. Анализ динамики выявления штаммов семейства Entero-bacteriaceae, продуцирующих карбапененемазы, свидетельствует как о росте числа обнаружения подобных микроорганизмов, так и об увеличении разнообразия выявляемых групп ферментов. В 2014 г. зафиксирован наиболее высокий уровень продукции карбапенемаз - 8,6% всех нозокомиальных изолятов.
Таким образом, можно сделать вывод об увеличении числа случаев продукции карбапенемаз различного типа у представителей семейства En-terobacteriaceae в стационарах России. Подобная ситуация ведет к потенциальному увеличению числа случаев неэффективного применения кар-бапенемов при антимикробной терапии и росту резистентности. Одними из наиболее доступных методов сдерживания дальнейшего роста резистентности являются постоянный мониторинг устойчивости к карбапенемам и другим антибиотикам и ограничение их нерационального применения путем проведения информацион-
но-просветительской работы среди пациентов и медицинских работников, а также усиление контроля за проведением санитарно-гигиенических мероприятий в медицинских учреждениях.
Благодарности
Авторы выражают признательность директору и коллективу НИИАХГБОУВПО СГМУ Р. С. Козлову, М. В. Сухоруковой, Н. В. Иванчик за предоставленные данные, советы и помощь в выполнении практической части работы.
Список литературы
1. Агеевец В. А., Лазарева И. В., Сидоренко С. В. Проблема устойчивости к карбапенемным антибиотикам : распространение карбапенемаз в мире и России, эпидемиология, диагностика, возможности лечения // Фарматека. 2015. №14. С. 9-16.
2. Страчунский Л. С., Белоусов Ю. Б., Козлов Н. С. Практическое руководство по антимикробной химиотерапии. Смоленск : Изд-во Межрегион. ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии, 2007. 534 с.
3. Белобородов В. Б., Грувер К.П. Карбапенемы в современной клинической практике // Рус. мед. журн. 2012. Т. 18, № 17. С. 1037-1042.
4. Галкин Д. В. Карбапенемы через 20 лет после открытия : современные микробиологические и клинические аспекты // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2007. Т. 9, № 2. С. 133-152.
5. Страчунский Л. С. Р-лактамазы расширенного спектра - растущая и плохо осознаваемая угроза // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2005. Т. 7, № 1. С. 92-96.
6. Bush K., Jacoby G.A. Update functional classification of P-lactamasses // Antimicrob Agents Chemother. 2010. Vol. 54 (3). P. 969-976.
7. Агеевец В. А., Партина И. В., Лисицина Е. С., Ба-тыршин И. М., Попенко Л. Н., Шляпников С. А., Ильина Е. Н., Сидоренко С. В. Первое обнаружение металло-Р-лакгамазы NDM-типа в многопрофильном стационаре в // Мед. академ. журн. 2012. Т. 12, № 4. С. 43-45.
8. ЭйдельштейнМ. В., СклееноваЕ. Ю., Шевченко О. В., Тапальский Д. В., АзизовИ. С., Дсоуза Дж. В., Тимохо-ва А. В., Сухорукова М. В., Козырева В. К., Сафроно-ваЕ. В., АстаховаМ. В., Карпов И. А., Шамаева С. Х., Абрамова Н. В., Гординская Н. А. Распространенность и молекулярная эпидемиология грамотрицательных бактерий, продуцирующих металло-Р-лактамазы, в России, Беларуси и Казахстане // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2012. Т. 14, №2. С. 132-152.
9. Штейнберг Л. Л. Клинико-экономическая оценка применения различных карбапенемов в лечении нозокомиальной пневмонии : автореф. дис. ... канд. мед. наук. М., 2014. 24 с.
10. БелоусовЮ. Б., УшкаловаЕ. А. Нозокомиальные инфекции и принципы их лечения // Фарматека. 2001. №. 12. С. 32-36.
11. Сухорукова М. В., Эйдельштейн М. В., Склеенова Е. Ю., ИванчикН. В., Тимохова А. В., Дехнич А. В., Козлов Р. С. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России : результаты многоцентрового эпидемиологического исследования МАРАФОН в 2011-2012 гг. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2014. Т.16, № 4. С. 254-265.
12. EUCAST guidelines for detection of resistance mechanisms and specific resistances of clinical and/or epidemiological importance // European Committee on Antimicrobial Susceptibiliti Testing (valid from 11.12.2013, version 1.0). URL: http://www.eucast.org/fileadmin/src/ media/PDFs/EUCAST_files/Resistance_mechanisms/ EUCAST_detection_of_resistance_mechanisms_ v1.0_20131211.pdf (дата обращения: 5.03.2016).
13. МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. М., 2004. 91 с.
Образец для цитирования:
Эйдельштейн М. В., Журавлев В. С., Шек Е. А. Распространенность карбапенемаз среди нозокомиальных штаммов enterobacteriacea в России // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2017. Т. 17, вып. 1. С. 36-41. DOI: 10.18500/1816-9775-2017-17-1-36-41.
dte this article as:
Edelstein M. V., Zhuravlev V. S., Shek E. A. Prevalence of Nosocomial Strains Enterobacteriaceae Have Carbapenemases in Russia. Izv. Saratov Univ. (N. S.), Ser. Chemistry. Biology. Ecology, 2017, vol. 17, iss. 1, pp. 36-41 (in Russian). DOI: 10.18500/1816-9775-2017-17-1-36-41.
