CC BY
23
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2019 - V. 26, № 1 - P. 108-111
УДК: 615.22:616-092 001:10.24411/1609-2163-2019-16094
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ НИМОДИПИНА В ОРГАНИЗМЕ ТЕПЛОКРОВНЫХ ЖИВОТНЫХ Л.Л. КВАЧАХИЯ, В.К. ШОРМАНОВ, Т.В. РАКОВА ФГБОУВО «Курский государственный медицинский университет», ул. К. Маркса, д. 3, г. Курск, 305041, Россия
Аннотация. Нимодипин - лекарственное средство, широко применяющееся в медицинской практике в качестве блока-тора медленных кальциевых каналов и обладающее токсическими свойствами по отношению к теплокровным организмам. Токсичность данного вещества и наличие случаев смертельного отравления нимодипином определяет его судебно-химическое значение. Важной задачей судебно-химического исследования является выявление органов и биожидкостей, в которых отравляющее вещество присутствует в наибольших количествах. С этой целью было проведено изучение особенностей распределения нимодипина в организме всеядных теплокровных животных (крысы) после внутрижелудочного введения половинной летальной дозы отравляющего вещества. Изолирование нимодипина из органов, их содержимого и биожидкостей животных проводили ацетоном в режиме двукратного настаивания (по 30 минут на каждом этапе) при массовом соотношении изолирующей жидкости и биоматрицы 2:1. Очистку извлечённого соединения осуществляли хроматографией в колонке «Си-ласорб С-18» 30 мкм (элюент - ацетонитрил-вода (6:4 по объёму). Для идентификации и количественного определения исследуемого соединения использовали методы тонкослойной хроматографии, газовой хроматографии в сочетании с масс спектрометрией и УФ-спектрофотометрии. Присутствие наибольших количеств исследуемого вещества зафиксировано в содержимом желудка, желудке, селезенке, и печени. Полученные результаты позволяют рекомендовать данные органы в качестве основных объектов судебно-химических экспертиз при отравлении нимодипином.
Ключевые слова: нимодипин, распределение в организме, судебно-химический анализ.
Нимодипин (1-метилэтиловый эфир 2-метоксиэтил-1,4-дигидро-2,6-диметил-4-(3-нитрофенил)-3,5-пиридиндикарбоновой кислоты) является антагонистом ионов кальция 2-го поколения и оказывает нейропротективное, антиагрегаци-онное и вазодилатирующее действие [8,10].
По физическим свойствам нимодипин (молярная масса 418,44) - желтый кристаллический порошок с температурой плавления 125°С, практически нерастворимый (0,012 мг/мл) в воде. рКа равно 5,41 [11]. Вещество растворимо в ацетоне, хлороформе, этаноле [6].
Данное вещество токсично для теплокровных животных и человека. Его Ш50 при внугрижелудоч-ном введении лабораторным животным составляет 2738 мг/кг, при внутривенном - 5 мг/кг. [9]. По другим данным ПО50 для крыс при введении в желудок составляет 2,5326 моль/кг [10]. При попадании в организм человека доз, значительно превышающих максимальные терапевтические, может наблюдаться заметное снижение артериального давления, тахикардия или брадикардия, тошнота, расстройства со стороны органов желудочно-кишечного тракта. Описаны случаи отравления людей нимодипином, в том числе с летальным исходом [4, 5, 13].
Токсические свойства, широкое применение нимодипина, наличие случаев отравления делают его потенциальным объектом судебно-химического исследования.
Для изолирования нимодипина из трупного материала описано использование классических методов, которые не позволяют достичь высокой степени изолирования рассматриваемого вещества (степень извлечения 7-30 %) и относительно малочувствительны [1,2].
Для определения органов и биожидкостей -наиболее целесообразных объектов исследования при экспертизе случаев отравления - необходимо предварительное изучение на лабораторных животных особенностей распределения отравляющего вещества в организме теплокровных.
Цель исследования - изучение характера распределения нимодипина в организме всеядных теплокровных (крысы) при летальном отравлении, вызванного введением отравляющего агента в желудок.
Материалы и методы исследования. Объект исследования - субстанция нимодипина с содержанием основного вещества не менее 99,9%, соответствующая НД.
В ходе экспериментов использовались крысы породы (возраст - 4 месяца, масса - 235-250 г), из которых были сформированы 5 опытных групп и 1 контрольная, в каждую из которых входило по 5 особей. Животным опытных групп через пластмассовый зонд вводили рассматриваемое вещество в желудок в виде водной суспензии в количестве 2738 мг на 1 кг массы крысы (Ш50 при пероральном введении). После того, как животные погибали, их трупы подвергались вскрытию, одинаковые биологические объекты (органы или биожидкости), взятые от погибших особей внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них нимодипина.
Параллельно подобным образом исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы.
В качестве аналитических методов рассмотрены тонкослойная хроматография (ТСХ), электронная спектрофотометрия и газовая хроматография в сочетании с масс спектрометрией (ГХ-МС), так как применение инструментальных видов колоночной хроматографии в анализе нимодипина известно из литературных источников [7,12].
Схема изолирования. В каждом случае определённое количество измельченного (средние размеры частиц 0,2-0,4 см) паренхиматозного или полого органа, содержимого полого органа или биожидкости заливали количеством ацетона, в два раза (по массе) превышавшем количество биологического объекта. Смесь биоматериала с изолирующим агентом выдерживали в течение получаса, периодически перемешивая. По истечении указанного времени жидкую часть смеси (ацетоновое извлечение) отделяли от твёрдого остатка, а процесс настаивания
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2019 - V. 26, № 1 - P. 108-111
повторяли в описанном выше режиме. Первое и второе ацетоновые извлечения сливали в одну выпарительную чашку, растворитель и остатки воды испаряли в токе воздуха (температурный интервал 18-220С) до получения сухого остатка [2,3].
Таблица
Результаты изучения распределения нимодипина в организме теплокровных (крысы)
Масса Найдено нимодипина
Орган или биожидкость органов (суммарная для 5 особей), взятая для исследования, г мг в исследуемой массе биологического объекта мг в 100 г биологического объекта Метрологические характеристики
7,32 7,51 5,793 4,827 79,144 64,276 X = 71,288 S= 5,789
Почки 7,19 5,156 71,710 S - =2,589
7,73 7,58 5,719 5,103 73,987 67,324 Ai = 7,197 в = 10,10
25,0 25,0 12,152 11,187 48,607 44,747 X = 48,042 S = 3,218
Печень 25,0 11,349 45,396 S х = 1,439
25,0 25,0 12,498 13,117 49,993 52,467 Ai = 4,001 в = 8,33
6,02 5,86 1,565 1,619 25,996 27,622 X = 25,306 S = 1,686
Сердце 5,91 6,17 6,24 1,500 1,428 1,522 25,381 23,140 24,392 S- = 0,754 X М = 2,096 в = 8,28
19,61 31,044 158,308 х = 170,596
20,47 34,856 170,280 S = 8,876
Лёгкие 19,97 33,420 167,349 Sx = 3,969
21,12 38,492 182,252 Дх = 11,035
20,82 36,392 174,793 в = 6,47
13,66 12,48 3,722 3,537 27,249 28,340 X = 26,768 S = 1,141
Кровь 13,26 3,446 25,987 S - = 0,510
12,14 11,79 3,089 3,168 25,396 26,868 Ai = 1,418 в = 5,30
Тонкий кишечник 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 38,069 36,784 41,616 31,952 33,696 152,274 147,135 166,464 127,806 134,783 х = 145,692 S = 15,131 S - = 6,767 Дс = 18,812 в = 12,91
14,55 15,62 625,843 621,422 4301,329 3978,374 х = 4123,550 S = 293,141
Желудок 14,16 15,03 15,49 582,073 675,587 578,156 4110,683 4494,921 3732,445 S- = 131,097 Дх = 364,447 в = 8,84
Содержимое желуд- 7,51 7,11 6,58 694,781 668,158 648,471 9251,410 9397,445 9466,732 X = 9353,639 S = 84,855 S - = 37,948
ка 7,90 7,36 739,367 684,004 9359,071 9293,536 Д? = 105,497 в = 11,30
13,59 12,46 14,310 12,885 105,298 103,409 X = 102,973 S = 5,331
Мышцы 11,17 11,097 99,344 S - = 2,384
12,34 11,44 13,609 11,043 110,282 96,533 Дх = 6,627 в = 6,44
4,72 5,61 14,812 17,236 313,818 307,234 X = 313,243 S = 11,325
Селезёнка 4,35 13,813 317,529 S - = 5,065
4,97 5,23 16,348 15,622 328,943 298,693 Д! = 14,080 в = 4,49
Очистка извлеченного соединения. Сухой остаток подвергали обработке 1,8 мл ацетонитрила, прибавляли 1,2 мл воды, получаемый раствор вносили в макроколонку сорбента «Силасорб С-18» 30 мкм (размер колонки 120x11 мм). Аналит элюировали из колонки двухкомпонентным полярным элюентом ацетонитрил-вода (6:4). Фракции элюата, истекающего из макроколонки (по 2 мл каждая), собирали в градуированные пробирки. Серию фракций с 8 по 11 сливали в выпарительную чашку, а растворители удаляли из чашки, помещая её в поток воздуха комнатной температуры. После удаления растворителей остаток обрабатывали 5-7 мл этанола, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили этанолом до метки (исходный раствор).
В две фарфоровые выпарительные чашки (№ 1 и № 2) вносили по 1,0-4,5 мл исходного раствора и удаляли из него растворитель в потоке воздуха комнатной температуры.
Идентификация в тонком слое сорбента. Остаток, находящийся в чашке № 1, обрабатывали небольшими порциями этанола по 0,2-0,3 мл, количественно перенося раствор в виде полосы на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ. Рядом на линию старта наносили 510 мкл 0,08% раствора (в этаноле) вещества-свидетеля. Хроматографировали, используя элюент гексан-ацетон (7:3). Получаемые тонкослойные хро-матограммы проявляли, облучая их УФ-светом с длиной волны 254 нм. Нимодипин идентифицировали по величине Rf.
Идентификация и количественное определение с использованием УФ-спекгрофотометрии. Часть хрома-тограммы с находящимся на ней пятном исследуемого вещества вырезали, вносили в градуированную пробирку вместимостью 10 мл и элюировали вещество из сорбента в течение 15 минут 10 мл этанола в режиме периодического перемешивания. Полученный эта-нольный элюат отделяли в кварцевую кювету с длиной оптического пути 10 мм и проводили исследование его светопоглощения в диапазоне длин волн от 200 до 500 нм на спектрофотометре модели СФ-2000. Если оптическая плотность элюата превышала 1,2, его разбавляли этанолом. Количественное определение нимодипина проводили в области 358 нм.
Идентификация методом газовой хроматогрфии и масс спектрометрии (ГХ-МС). Сухой остаток, находящийся в выпарительной чашке № 2, обрабатывали 2 мл трихлорметана. 4 мкл, взятые из полученного раствора, вводили в хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6890N с масс-селективным квадруполь-ным детектором модели 5973N (Agilent Technologies). Процесс хроматографирования осуществляли в колонке DB-1MS (J&WScientific, США) с неподвижной жидкой фазой диметилполисилоксан (длина колонки 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки фазы 0,25 мкм). Начальная температура термостата колонки составляла 80°С (задержка на 2 минуты). Температура программировалась от 80 до 250°С со скоростью 40°С в минуту с выдержкой при конечной температуре 6 минут. Температура инжектора составляла 280°С, температура интерфейса - 300°С. В качестве газа-носителя использовался гелий. Подача газа-носителя произво-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2019 - V. 26, № 1 - P. 108-111
дилась со скоростью 39 см/с. Проба вводилась в режиме без деления потока, задержка 3 мин. Фрагментация молекул аналита в ионизационной камере осуществлялась с использованием электронного удара (70 эВ). Обнаружение вещества проводилось в режиме регистрации по полному ионному току (диапазон сканирования 40-550 m/Z). Анализируемое соединение идентифицировали как по значению времени удерживания, так и по совпадению его масс-спектра с масс-спектром стандарта на 86% и более.
Результаты и их обсуждение. При идентификации в тонком слое сорбента нимодипин проявлялся на хроматограммах в УФ-свете в виде темных розово-фиолетовых пятен на более светлом общем фоне пластины. Анализируемое вещество идентифицировали на основе совпадения значения его абсолютной хроматографической подвижности (Rf) в тонком слое силикагеля со значением Rf вещества-стандарта (0,56±0,03).
По результатам идентификации нимодипина методом УФ-спектрофотометрии отмечается совпадение формы спектральных кривых аналита, извлечённого из биоматриц, а также положения в них четырех максимумов (при 206, 236, 270-275 (скрытая полоса) и 358 нм) с этими же характеристиками вещества-стандарта.
По величине оптической плотности этанольно-го элюата, измеренной в области 358 нм, рассчитывали количественное содержание нимодипина, используя уравнение градуировочного графика, которое в настоящем случае имело следующий вид: А=0,016131*С+0,002479 (коэффициент корреляции 0,99967), в котором А - оптическая плотность фото-метрируемого раствора, С - содержание нимодипина в фотометрируемом растворе (мкг/мл). Полученный результат пересчитывали на необходимое количество той или иной биоматрицы.
При исследовании извлечений из биоматриц, взятых от крыс, не получавших нимодипин, установлено отсутствие данного вещества в паренхиматозных и полых органах, их содержимом, а также в крови животных контрольной серии. Измеренное при длине волн 358 нм фоновое поглощение элюа-тов из участков хроматограмм, по площади и положению относительно линии старта соответствующих анализируемому веществу, не превышало 0,14 единиц оптической плотности для различных биологических объектов в пересчёте на 5 г биоматериала.
В предложенных условиях проведения идентификации сочетанием газожидкостной хроматографии и масс-селективного детектирования (ГХ-МС)
значение времени удерживания нимодипина, извлечённого из биоматериала, совпадало с таковым вещества-стандарта и соответствовало интервалу 19,9±0,14 минуты.
При сравнении хроматограмм исследуемого соединения с хроматограммой вещества-стандарта (метод ГХ-МС) не наблюдалось присутствие дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии в зоне, соответствующей промежутку значений времени удерживания 19,2-20,2 мин.
Сравнение масс-спектров вещества-стандарта и нимодипина, выделенного из биоматриц, показывают, что в масс-спектре стандарта нимодипина, так же как и в масс-спектрах исследуемого вещества, извлечённого из биологических объектов, взятых от отравленных животных, отмечается присутствие сигналов характерных осколков (заряженных частиц), наиболее интенсивными из которых являются частицы с массами (m/Z): 59, 106, 151, 196, 227, 254, 296, 359. Основным (масса которого принимается за 100%) является осколок с массой 296.
Результаты определения рассматриваемого соединения в 10 биологических объектах (паренхиматозных органах, полых органах и их содержимом, биожидкостях), взятых от трупов отравленных животных, представлены в табл.
Как видно из таблицы, нимодипин присутствует в неизменном виде как в органах, так и в крови погибших организмов. Наибольшие количества отравляющего вещества (мг в 100 г органа или биожидкости) обнаруживаются в содержимом желудка (9353,639±105,497), желудке (4123,550±364,447), селезенке (313,243±14,080), легких (170,596±11,035), тонком кишечнике (145,692±18,812) и мышцах (102,973±6,627), несколько меньшие - в почках (71,288±7,197), печени (48,042±4,001), крови (26,768±1,418) и сердце (25,306±2,096) отравленных животных.
Проведённые исследования позволяют сделать следующие выводы:
1. Изучено распределение нимодипина в организме теплокровных животных (крысы) при введении LD50 данного отравляющего вещества в желудок.
2. Показано, что отравляющий агент обнаруживается в значительных количествах в трупах погибших от отравления крыс в неизменном виде.
3. Наибольшие количества нимодипина присутствуют в содержимом желудка (9353,639±105,497), желудке (4123,550±364,447), селезенке (313,243±14,080) и печени (48,042±4,001).
DISTRIBUTION OF NIMODIPINE IN THE ORGANISM OF WARM-BLOODED ANIMALS L.L. KVACHAKHIYA, V.K. SHORMANOV, T.V. RAKOVA Kursk State Medical University, K. Marx str., 3, Kursk, 305041, Russia
Abstract. Nimodipine is a drug widely used in medical practice as a blocker of slow calcium channels and possessing toxic properties in relation to warm-blooded organisms. The toxicity of this substance and the presence of cases of fatal poisoning with nimodi-pine determine its forensic chemical significance. An important task of forensic chemistry research is to identify organs and biofluids in which the poison is present in the greatest quantities. To this end, a study was made of the distribution of nimodipine in the body of omnivorous warm-blooded animals (rats) after intragastric administration of a half lethal dose of the poison agent. Isolation of nimo-
JOURNAL OF NEW MEDICAL TECHNOLOGIES - 2019 - V. 26, № 1 - P. 108-111
dipine from the organs, their contents and biofluids of animals was carried out with acetone in the regime of double infusion (for 30 minutes at each stage) with a mass ratio of the isolating liquid and biomatrix 2: 1. Purification of the recovered compound was carried out by chromatography in a column of "Silasorb C-18" 30 ^m (eluent-acetonitrile-water (6: 4 by volume). For identification and quantification of the test compound was used by thin layer chromatography (TLC), gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS) and UV spectrophotometry. The presence of the largest quantities of the test substance is fixed in the contents of the stomach, stomach, spleen, and liver. The obtained results allow to considering these organs as the main objects of forensic chemical examinations in case of nimodipine poisoning.
Key words: nimodipine, distribution in the organism, forensic and chemical analysis.
Литература / References
1. Квачахия Л.Л., Шорманов В.К., Маркелов М.Ю., Конарева Е.Г. Определение нифедипина в биологическом материале // Судебно-медицинская экспертиза. 2011. Т. 54, № 4. С. 31-34 / Kvachakhiya LL, Shormanov VK, Markelov MYu, Konareva EG. Opredelenie nifedipina v biologicheskom materiale [Determination of nifedipine in biological material]. Sudebno-meditsinskaya ekspertiza. 2011;54(4):31-4. Russian.
2. Шорманов B.K., Квачахия Л.Л., Щербаков Д.П. Химико-токсикологическое определение дилтиазема // Судебно-медицинская экспертиза. 2015. Т. 58, № 2. С. 39-45 / Shormanov VK, Kvachakhiya LL, Shcherbakov DP. Khimiko-toksikologicheskoe opredelenie diltiazema [Chemical-Toxicological definition of diltiazem]. Sudebno-meditsinskaya ekspertiza. 2015;58(2):39-45. Russian.
3. Шорманов В.К., Квачахия Л.Л. Идентификация нифедипина в биологических жидкостях // Фармация. 2013. Т. 62, № 8. С. 16-19 / Shormanov VK, Kvachakhiya LL. Identi-fikatsiya nifedipina v biologicheskikh zhidkostyakh [Identification of nifedipine in biological fluids]. Farmatsiya. 2013;62(8):16-9. Rusisan.
4. Aglony M., Cavagnaro F., Rios J.C. A suicide attempt with an oral calcium channel blocker // Veterinary and human toxicology. 2000. Vol. 42, N 2. P. 99-100 / Aglony M, Cavagnaro F, Rios JC. A suicide attempt with an oral calcium channel blocker. Veterinary and human toxicology. 2000;42(2):99-100.
5. Aschenbrenner DS Oral Nimodipine Given Intravenously Can Be Fatal // American Journal of Nursing. 2010. Aschenbrenner DS Oral Nimodipine Given Intravenously Can Be Fatal. American Journal of Nursing. 2010;110(12):27-8.
6. Clarke's analysis of drugs and poisonsin Pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. 3rd ed. London: Pharmaceutical Press, 2004. Vol. 2. 550 p. / Clarke's analysis of drugs and poisonsin Pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. 3rd ed. London: Pharmaceutical Press; 2004. Vol. 2.
7. Chen X., Zhao Y., Zhai D. Determination of nimodipine in human plasma by HPLC-ESI-MS and its application to a bioequivalence study // J. Chromatogr. Sci. 2010. Vol. 48, N 2. P. 81-85 / Chen X, Zhao Y, Zhai D. Determination of nimodipine in human plasma by HPLC-ESI-MS and its application to a bioequivalence study. J. Chromatogr. Sci. 2010;48(2):81-5.
8. Aburto-Murrieta Y., Marquez-Romero J.M., Bonifa-cio-Delgadillo D. Endovascular Treatment Balloon Angioplasty Versus Nimodipine Intra-arterial for Medically Refractory Cerebral Vasospasm Following Aneurysmal Subarachnoid Hemorrhage // Vasc. Endovascular Surg. 2012. Vol. 46, N 6. P. 460-465 / Aburto-Murrieta Y, Marquez-Romero JM, Bonifa-cio-Delgadillo D. Endovascular Treatment Balloon Angioplasty Versus Nimodipine Intra-arterial for Medically Refractory Cerebral Vasospasm Following Aneurysmal Subarachnoid Hemorrhage. Vasc. Endovascular Surg. 2012;46(6):460-5.
9. Ganellin C.R., Triggle D.J. PharmaSource Dictionary of Pharmacological Agents on CDROM. New York: CRC Press, 1997. 859 p. / Ganellin CR, Triggle DJ. PharmaSource Dictionary of Pharmacological Agents on CDROM. New York: CRC Press; 1997.
10. Kang H.-S., Cho W.-S., Kim J.E. Intra-Arterial Nimo-dipine Infusion for Cerebral Vasospasm in Patients with Aneu-rysmal Subarachnoid // Interv. Neuroradiol. 2011. Vol. 17, N 2. P. 169-178 / Kang H-S, Cho W-S, Kim JE. Intra-Arterial Nimo-dipine Infusion for Cerebral Vasospasm in Patients with Aneu-rysmal Subarachnoid. Interv. Neuroradiol. 2011;17(2):169-78.
11. Nimodipine. http://www.drugbank.ca/drugs/ DB00393. Accessed April 22, 2018 / Nimodipine. http://www.drugbank.ca/drugs/ DB00393. Accessed April 22; 2018.
12. Oiu F., Chen X., Li X. Determination of nimodipine in human plasma by a sensitive and selective liquid chromatogra-phy-tandem mass spectrometry method // J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2004. Vol. 802, N 2. P. 291297 / Oiu F, Chen X, Li X. Determination of nimodipine in human plasma by a sensitive and selective liquid chromatogra-phy-tandem mass spectrometry method. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2004;802(2):291-7.
13. Take steps to avoid inadvertent IV administration of nimodipine. https://www.ismp.org/newsletters/acutecare /articles/20050728_1.asp. Accessed April 22, 2018 / Take steps to avoid inadvertent IV administration of nimodipine. https://www.ismp.org/newsletters/acutecare/articles/20050728 _1.asp. Accessed April 22;2018.
Библиографическая ссылка:
Квачахия Л.Л., Шорманов В.К., Ракова Т.В. Распределение нимодипина в организме теплокровных животных // Вестник новых медицинских технологий. 2019. №1. С. 108-111. DOI: 10.24411/1609-2163-2019-16094
Bibliographic reference:
Kvachakhiya LL, Shormanov VK, Rakova TV. Raspredelenie nimodipina v organizme teplokrovnykh zhivotnykh [Distribution of nimodipine in the organism of warm-blooded animals]. Journal of New Medical Technologies. 2019;1:108-111. DOI: 10.24411/1609-21632019-16094. Russian.
